石玉喆,閆曉鑫,張志強(qiáng),周永康*

(1.北京康仁堂藥業(yè)有限公司,北京 101301;2.中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,北京 101301;3.北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心,北京 101301)

石楠藤為薔薇科植物石楠PhotiniaserrulataLindl.的干燥帶葉的莖枝。味辛、甘,性溫,入肝經(jīng),用于祛風(fēng)止痛,壯筋骨,主治風(fēng)痹疼痛,腰膝酸軟等癥[1]。石楠藤作為各地方常用品種,各地方標(biāo)準(zhǔn)對其收載項目簡單、質(zhì)量評價指標(biāo)較少,尚不可全面反映石楠藤的藥材質(zhì)量。中藥傳統(tǒng)用藥采用的是水煎煮湯劑的形式,故水溶性成分為其發(fā)揮臨床藥效的物質(zhì)基礎(chǔ),經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研可知,石楠藤中含皂苷、野櫻皮苷、熊果酸、齊墩果酸、揮發(fā)油等化學(xué)成分[2-3],根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)石楠藤中含有大量綠原酸,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明熊果酸、齊墩果酸、綠原酸有顯著的抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)免疫、保肝、止疼、強(qiáng)心等藥理作用[4-7],且均具有較好的水溶性,這與石楠藤祛風(fēng)止痛作用密切相關(guān),是其發(fā)揮臨床藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前關(guān)于石楠藤的研究僅有少量文獻(xiàn)報道,且主要為石楠藤中熊果酸和齊墩果酸的相關(guān)研究[8],未見對其活性成分綠原酸的研究,因此該研究選擇以綠原酸作為研究對象進(jìn)行配方顆粒生產(chǎn)過程質(zhì)量控制更符合臨床的要求,能夠保證用藥的有效性。

中藥配方顆粒是以傳統(tǒng)中藥飲片為原料,經(jīng)過提取、濃縮、干燥、制粒等生產(chǎn)工藝,加工制成的一種統(tǒng)一規(guī)格、劑量、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的新型配方用藥[9]。在中醫(yī)理論指導(dǎo)下使用,與傳統(tǒng)中藥湯劑相比,具有服用方便、易貯藏、便攜帶、質(zhì)量可控等特點。標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為配方顆粒的基準(zhǔn)物質(zhì),用以衡量中藥配方顆粒與臨床湯劑的一致性[10],其質(zhì)量參數(shù)是分析飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒相關(guān)性的依據(jù),能夠闡明物質(zhì)傳遞的情況,從而保證藥效成分的有效轉(zhuǎn)移。

近年來,對于石楠藤的研究多側(cè)重于化學(xué)成分及藥理作用的研究,未見石楠藤飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒的質(zhì)量相關(guān)性研究,以現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)并不能對飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒的相關(guān)性進(jìn)行分析。故本研究以石楠藤中水溶性藥理活性成分為研究對象建立含量測定及特征圖譜方法,采用特征圖譜與含量轉(zhuǎn)移率相結(jié)合的模式,分析飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒的相關(guān)性,闡明物質(zhì)傳遞情況,為中藥配方顆粒生產(chǎn)全過程的質(zhì)量控制提供參考,也為后續(xù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供實驗依據(jù)。

1 儀器及試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC?H-Class超高效液相色譜儀,PDA Detector檢測器;島津LC-20,TUV Detector檢測器,Empower 3色譜工作站;Waters CORTECS?UPLC?T3(2.1 mm×100 mm,1.6 μm)色譜柱(美國Waters公司);KQ-300DB超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ME104E電子天平(梅特勒·托利多);JY20002電子天平(梅特勒·托利多);LGJ-50FD真空冷凍干燥機(jī)(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)。

1.2 試藥及試劑

綠原酸對照品(中國食品藥品檢定研究院,批號:110753-202018,純度,96.1%);乙腈為色譜純購于美國Merk公司;水為屈臣氏蒸餾水;石楠藤藥材分別購于廣東省佛山市、廣東省江門市、汕頭市等,藥材經(jīng)北京康仁堂藥業(yè)有限公司質(zhì)量檢測中心鑒定為薔薇科植物石楠PhotiniaserrulataLindl.的干燥帶葉莖枝,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司按《北京炮制規(guī)范》2008年版石楠藤飲片項下的炮制方法加工制成石楠藤飲片,經(jīng)檢驗均符合《北京炮制規(guī)范》(2008年版)規(guī)定。樣品來源見表1。

表1 材料來源

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 石楠藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

取石楠藤飲片200 g于砂鍋中,浸泡30 min,一煎加飲片量8倍水,武火(500 W)煮沸后,文火煎煮30 min,趁熱過濾(150目濾布),迅速冷卻,備用;二煎加飲片量6倍水,武火煮沸后,文火(200 W)煎煮20 min,趁熱過濾(150目濾布),迅速冷卻備用;合并濾液,濃縮(65 ℃以下,真空度-0.1 MPa),濃縮至料液比約為1∶1(相對密度為1.05～1.10),冷凍干燥,密封保存,即得。

2.1.2 石楠藤配方顆粒的制備

取石楠藤飲片9 000 g,加水煎煮,濾過,濾液濃縮成清膏,干燥(或干燥、粉碎),再加入輔料適量,混勻,制粒,制成1 000 g,即得。

2.2 含量測定方法

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(內(nèi)徑2.1 mm,柱長100 mm,粒徑1.6 μm)為色譜柱;以乙腈為流動相A,0.5%乙酸為流動相B,按表2中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;檢測波長為320 nm;柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min。理論塔板數(shù)按綠原酸峰計算應(yīng)不低于4 000。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的制備

取綠原酸對照品適量,精密稱定,加30%甲醇制成每1 mL含綠原酸0.487 mg的溶液,搖勻,作為對照品貯備液。

2.2.3 供試品溶液制備

飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒供試品溶液的制備:取本品適量,研細(xì),分別取約0.5,0.2,0.2 g,精密加入體積分?jǐn)?shù)為30%甲醇25 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W,頻率40 kHz)30 min,取出,放冷,再稱定質(zhì)量,并補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 精密度試驗

精密稱取同一批次石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒適量,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣6次測定綠原酸峰面積,石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的配方顆粒中綠原酸含量的RSD值分別為0.3%,1.2%,0.7%,表明儀器精密度良好。

2.2.4.2 線性試驗

精密吸取對照品貯備液5,1,1,1 mL,分別轉(zhuǎn)移至10,10,50,100 mL容量瓶中,加體積分?jǐn)?shù)為30%甲醇至刻度,質(zhì)量濃度分別分4.873,9.746,48.728,243.638,487.275 μg·mL-1,進(jìn)樣測定得各峰面積,以峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),計算得回歸方程為y=18 206x-9 264.9,R=1.000 0,表明綠原酸在4.873～487.275 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.4.3 重復(fù)性試驗

精密稱取石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒適量,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液各6份,進(jìn)樣測定綠原酸峰面積,石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的配方顆粒中綠原酸含量的RSD值分別為1.1%,1.2%,1.6%,表明重復(fù)性良好。

2.2.4.4 中間精密度試驗

精密稱取石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒適量,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液各6份,采用不同儀器,不同人員,不同時間進(jìn)樣測定綠原酸峰面積,計算得其RSD值分別為0.4%,1.7%,1.9%,表明中間精密度良好。

2.2.4.5 穩(wěn)定性試驗

精密稱取同一批次的石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒適量,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液,分別于第0,2,4,8,10,12,24 h進(jìn)樣,測定綠原酸峰面積,石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒中綠原酸含量的RSD值分別為1.2%,1.0%,1.5%,結(jié)果表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.2.4.6 準(zhǔn)確度試驗

精密稱取石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒各9份,分別精密加入與其相當(dāng)量50%,100%,150%的綠原酸對照品,各平行三份,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液,測定含量,計算得綠原酸的平均回收率分別為101.84%,102.00%,96.18%,RSD值分別為2.0%,1.8%,1.0%,符合方法學(xué)驗證回收率要求,表明該方法測得的結(jié)果準(zhǔn)確。

2.2.5 含量測定

分別對20批石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及3批配方顆粒按照上述方法測定綠原酸含量,并計算其轉(zhuǎn)移率,結(jié)果如表3所示。

表3 含量及轉(zhuǎn)移率匯總結(jié)果

2.3 特征圖譜方法

2.3.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

同2.2.1項下含量測定方法。

2.3.2 參照物溶液的制備

同2.2.3中飲片供試品溶液的制備方法,制備對照藥材參照物溶液。另取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸對照品適量,精密稱定,分別加30%甲醇制成每1 mL分別含0.10,0.05,0.05 mg的溶液,搖勻,作為對照品參照物溶液。

2.3.3 供試品溶液制備

飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒供試品溶液制備方法同2.2.3中制備方法。

2.3.4 方法學(xué)考察

2.3.4.1 精密度試驗

精密稱取同一批次石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒適量,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣6次記錄其特征圖譜,以綠原酸為參照峰,計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積可知,相對保留時間RSD均為0.0%～0.2%,相對峰面積RSD分別為0.0%～0.8%,0.0%～0.7%,0.0%～1.2%,表明儀器精密度良好。

2.3.4.2 重復(fù)性試驗

精密稱取石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒適量,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液各6份,記錄其特征圖譜,以綠原酸為參照峰,計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積可知,相對保留時間RSD分別為0.0%～0.4%,0.0%～0.8%,0.0%～0.9%,相對峰面積RSD分別為0.0%～1.9%,0.0%～1.4%,0.0%～2.0%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.4.3 中間精密度試驗

精密稱取石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒適量,按照2.2.3項下方法制備供試品溶液各6份,采用不同儀器,不同人員,不同時間進(jìn)樣,記錄其特征圖譜,以綠原酸為參照峰,計算各特征峰的相對保留時間和峰面積可知,相對保留時間RSD分別為0.0%～0.6%,0.0%～0.1%,0.0%～0.1%,相對峰面積RSD分別為0.0%～0.1%,0.0%～1.9%,0.0%～0.4%,不同儀器間相對保留時間RSD分別為0.0%～1.8%,0.0%～2.0%,0.0%～1.9%,相對峰面積RSD分別為0.0%～5.2%,0.0%～6.4%,0.0%～8.1%,表明該特征圖譜在不同儀器間相對保留時間符合分析要求,不同儀器間相對峰面積差異較大。表明中間精密度良好。

2.3.4.4 穩(wěn)定性試驗

精密稱取石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉及配方顆粒適量,按照2.1.3項下方法制備供試品溶液,分別于第 0,2,4,6,8,10,12,24 h進(jìn)樣,記錄其特征圖譜,以綠原酸為參照峰,計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積可知,相對保留時間RSD分別為0.0%～0.7%,0.0%～0.8%,0.0%～1.4%,相對峰面積RSD分別為0.0%～1.5%,0.0%～2.5%,0.0%～2.0%,結(jié)果表明24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.4.5 特征圖譜的測定

分別對20批石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及3批配方顆粒按照特征圖譜方法測定,將所得到的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件”(2012A),用多點校正將譜峰自動匹配,平均數(shù)法計算得出樣品指紋圖譜的共有模式,經(jīng)比較分析后確定石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒均有6個共有峰,結(jié)果見圖1～3,表明石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒整體相似性較高。6個共有峰均峰面積較大且峰型較好,能夠有效表征石楠藤內(nèi)在質(zhì)量的整體變化,故將6個共有峰作為特征圖譜的特征峰,同時指認(rèn)了峰1為新綠原酸,峰3為綠原酸,峰5為隱綠原酸,見圖4。

圖1 20批石楠藤飲片特征圖譜

圖2 20批石楠藤標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜

峰1:新綠原酸;峰3(S):綠原酸;峰5:隱綠原酸

圖4 共有峰指認(rèn)

2.4 質(zhì)量相關(guān)性分析

石楠藤飲片中綠原酸含量范圍為0.5～2.3 mg·g-1;標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量范圍為2.4～7.3 mg·g-1,轉(zhuǎn)移率范圍為12.0%～47.6%;配方顆粒含量分別為2.5,2.8,2.6 mg·g-1,轉(zhuǎn)移率分別為24.1%,35.1%,20.0%,由以上結(jié)果可知,配方顆粒綠原酸含量及含量轉(zhuǎn)移率均在標(biāo)準(zhǔn)湯劑所測得的均值±3SD范圍內(nèi),說明飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒制備過程中工藝成熟、穩(wěn)定,能夠保證配方顆粒的臨床藥效。

石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒UPLC對照指紋圖譜相似度結(jié)果見表4。由圖5及表4可知,在飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒中5個特征峰傳遞良好,石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒對照指紋圖譜相似度均大于0.990,說明石楠藤配方顆粒和飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑主要化學(xué)成分基本一致。

圖5 石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒特征圖譜

表4 石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑、配方顆粒對照指紋圖譜的相似度結(jié)果

3 討論

石楠藤中含皂苷、野櫻皮苷、熊果酸、齊墩果酸、綠原酸、揮發(fā)油等化學(xué)成分,其中綠原酸具有抗炎、止疼的藥理活性,是石楠藤發(fā)揮臨床藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一,其同分異構(gòu)體為新綠原酸和隱綠原酸,受溫度、pH值及化合物中不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的影響,通過水解和分子內(nèi)酯基遷移而易發(fā)生同分異構(gòu)體之間的轉(zhuǎn)化[11-15],因此選擇綠原酸作為定量指標(biāo),以新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸為定性指標(biāo)進(jìn)行過程質(zhì)控具有一定意義。建立的含量測定和特征圖譜方法經(jīng)方法學(xué)驗證,重復(fù)性、中間精密度、穩(wěn)定性考察RSD均小于3.0%;綠原酸含量測定其平均回收率結(jié)果均大于90.0%,RSD均小于3.0%,且綠原酸在4.873～487.275 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,表明建立的含量測定和特征圖譜方法準(zhǔn)確、可行。故本研究所建立的含量測定和特征圖譜方法能夠?qū)κ亠嬈?、?biāo)準(zhǔn)湯劑以及配方顆粒進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。

基于建立的質(zhì)量控制方法,對石楠藤飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑以及配方顆粒進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示在飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒制備過程中藥效成分損失較小,配方顆粒轉(zhuǎn)移率均符合標(biāo)準(zhǔn)湯劑范圍,且各批次石楠藤特征圖譜中特征峰均傳遞良好,飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及配方顆粒相似度達(dá)0.9以上,表明石楠藤飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒物質(zhì)傳遞過程穩(wěn)定,主要化學(xué)成分基本一致,三者具有良好的相關(guān)性。

因此,本研究針對石楠藤中水溶性藥效成分建立含量測定和特征圖譜方法,通過飲片-標(biāo)準(zhǔn)湯劑-配方顆粒相關(guān)性分析,實現(xiàn)了對配方顆粒生產(chǎn)過程的質(zhì)量監(jiān)控,闡明了物質(zhì)傳遞情況,可為后續(xù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供實驗及理論依據(jù)。