陳泓妃 顧賽汝 王洪洋 李燦輝 劉晶

摘要：致病疫霉是引起馬鈴薯晚疫病的重要病原菌，在全世界范圍內(nèi)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。以2種不同致病力的致病疫霉菌株侵染馬鈴薯葉片5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的混合菌絲樣品作為cDNA文庫的材料來源，利用Gateway法分別構(gòu)建了初級(jí)文庫與次級(jí)文庫，初級(jí)文庫與次級(jí)文庫的庫容量分別為1.60×107、1.52×107 CFU，插入片段長(zhǎng)度大多在 1 000～2 000 bp之間，重組率均達(dá)到100%。次級(jí)文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌構(gòu)建酵母文庫，所得酵母文庫滴度為1.00×108 CFU/mL，轉(zhuǎn)化效率為6×108 CFU/μg。結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的酵母雙雜交cDNA文庫質(zhì)量較高，完全可以滿足互作蛋白高質(zhì)量、高效率篩選的要求。該文庫為后續(xù)深入解析致病疫霉的致病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：致病疫霉；馬鈴薯；酵母雙雜交；cDNA文庫

中圖分類號(hào)：S435.32? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）13-0060-05

致病疫霉（Phytophthora infestans）屬于腐霉科（Pyhiaceae）疫霉屬（Phytophthora），是引起世界范圍內(nèi)馬鈴薯晚疫病的重要病原卵菌［1］。19世紀(jì)中期，馬鈴薯晚疫病在愛爾蘭大暴發(fā)并引起饑荒，數(shù)百萬人因此喪命或流亡他國(guó)［2］。如今，晚疫病仍是馬鈴薯生產(chǎn)上的重要病害，全球每年因馬鈴薯晚疫病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億歐元［3］。目前，我國(guó)馬鈴薯種植面積位居世界第一，但馬鈴薯晚疫病在我國(guó)各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)期流行，嚴(yán)重制約了我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，持續(xù)有效的防治措施仍有待挖掘［4-5］。因此，深入解析致病疫霉的致病機(jī)制對(duì)于后續(xù)開發(fā)新的殺菌劑作用靶標(biāo)以及培育新的抗晚疫病馬鈴薯品種至關(guān)重要。

酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system）是研究蛋白與蛋白間的互作、篩選與已知蛋白互作的未知蛋白的常用方法［6］。該系統(tǒng)最早由Fields和Song在研究真核生物的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能時(shí)提出并建立的，具有速度快、效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于微生物及動(dòng)植物體中互作蛋白的研究［7］。該系統(tǒng)依賴于酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的特性，GAL4擁有2個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，簡(jiǎn)稱BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，簡(jiǎn)稱AD），BD能夠結(jié)合GAL1啟動(dòng)子區(qū)的DNA序列，AD能夠激活轉(zhuǎn)錄［8］。將2個(gè)目的基因分別連接到含BD和AD序列的表達(dá)載體中，使BD和AD序列分別與2個(gè)目的基因的開放閱讀框（ORF）融合，隨后將重組載體轉(zhuǎn)入相應(yīng)酵母菌株使目的基因在酵母細(xì)胞中表達(dá)；若目的基因表達(dá)的蛋白之間發(fā)生互作，則GAL4轉(zhuǎn)錄因子的BD和AD也隨之相互靠近并結(jié)合，GAL4隨即發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子功能，與上游激活序列結(jié)合后激活報(bào)告基因的表達(dá)［9］。根據(jù)上述原理，篩選酵母cDNA文庫可知曉與已知蛋白互作的未知蛋白。將已知蛋白的編碼基因連接到BD表達(dá)載體上，作為“誘餌”載體。將待篩選物種的cDNA文庫中不同的插入片段連接到AD表達(dá)載體上，作為“獵物”載體。隨后，“誘餌”載體與“獵物”載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。若一個(gè)酵母細(xì)胞中同時(shí)表達(dá)的“誘餌”蛋白與“獵物”蛋白發(fā)生互作，則報(bào)告基因被激活，通過提取該酵母細(xì)胞質(zhì)粒，利用測(cè)序手段獲得與已知蛋白互作的基因序列。

構(gòu)建高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA文庫是成功篩選未知互作蛋白的關(guān)鍵。目前，病原菌侵染植物后構(gòu)建酵母雙雜交文庫已有不少報(bào)道，包括馬鈴薯、茄子、花生、辣椒、番茄、棉花、擬南芥等［10-16］。這些文庫都是以病原菌侵染后的植物材料作為來源，提取RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA最終構(gòu)建酵母雙雜交文庫，而以侵染植物后的病原菌作為來源構(gòu)建酵母雙雜交文庫的案例較少。因此，本研究以侵染馬鈴薯不同時(shí)間的致病疫霉作為材料來源構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫，為后續(xù)篩選互作蛋白、研究致病疫霉的致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯二倍體野生種感病材料C9701 （Solanum chacoense）于2022年3月種植于云南師范大學(xué)馬鈴薯科學(xué)研究院恒溫氣候室（溫度為 22? ℃，光照/黑暗周期為16 h/8 h）中，生長(zhǎng)6周后使用。致病疫霉菌株88069 （1.3.4.7） （中低毒力菌株）及HB09-14-2 （1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11） （強(qiáng)毒力菌株） 接種于黑麥-V8培養(yǎng)基上并在 18 ℃ 黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，用手術(shù)刀切取大小約為 0.5 cm×0.5 cm的菌塊放置于青豆汁培養(yǎng)液中靜置培養(yǎng)3.5 d后收獲菌絲，備用。大腸桿菌菌株DH10B，酵母菌株Y187，載體pDONR222j及pGADT7-DEST均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 主要試劑及試劑盒

FastTrack MAG mRNA純化試劑盒及CloneMinerTM II cDNA 文庫構(gòu)建試劑盒購自Invitrogen公司，Trizol、SD-Leu購自TAKARA公司，質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，鮭魚精DNA、PEG/LiAc、DMSO等試劑購自Sigma公司。

1.3 總RNA的提取及mRNA分離純化

將收集的致病疫霉菌絲均勻放置于馬鈴薯葉片上，隨后在菌絲上再覆蓋1層葉片并放置于托盤中，18 ℃保濕培養(yǎng)。取侵染馬鈴薯葉片0、12、24、48、72 h的致病疫霉菌絲等量混合后，分別用液氮迅速研磨成粉末后用Trizol提取法提取菌絲總RNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，利用FastTrack MAG mRNA純化試劑盒純化mRNA。

1.4 cDNA文庫的構(gòu)建

隨后參照CloneMinerTM Ⅱ cDNA 文庫構(gòu)建試劑盒說明書合成cDNA第1鏈及第2鏈（Gateway法）。將cDNA與重組接頭連接后分級(jí)分離并收集，通過BP重組反應(yīng)將收集的cDNA片段連接到載體pDONR222上。隨后利用電轉(zhuǎn)法將上述重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B中（1.5 kV，200 Ω，25 μF）。在37 ℃，225～250 r/min條件下培養(yǎng)1 h后，取部分菌液涂布平板用于文庫容量鑒定，剩余菌液加入甘油至終濃度20%并保存于-80 ℃冰箱，得到初級(jí)文庫菌液。初級(jí)文庫質(zhì)量鑒定合格后，將初級(jí)文庫菌液擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，利用LR重組反應(yīng)將所得質(zhì)粒與pGADT7-DEST進(jìn)行重組，再將重組產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH10B中。同制備初級(jí)文庫菌液相似，轉(zhuǎn)化后的DH10B在搖床培養(yǎng) 1 h后，取部分菌液涂布平板用于文庫容量鑒定，剩余菌液加入甘油至甘油終濃度為20%并保存于-80 ℃冰箱，得到次級(jí)文庫菌液。

1.5 cDNA文庫的質(zhì)量鑒定

1.5.1 文庫容量鑒定 分別取初級(jí)文庫菌液及次級(jí)文庫菌液10 μL，用無菌水稀釋100倍后分別取50 μL涂布于含50 mg/L卡那霉素（Kan）及50 mg/L氨芐霉素（Amp）的 LB固體培養(yǎng)基平板上，過夜培養(yǎng)后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并計(jì)算文庫容量。文庫滴度（CFU/mL）=平板菌落數(shù)/涂板體積×稀釋倍數(shù)。文庫容量（CFU）=文庫滴度×文庫菌液總體積。

1.5.2 重組率及插入片段長(zhǎng)度鑒定 從“1.5.1”節(jié)中的初級(jí)文庫及次級(jí)文庫菌液培養(yǎng)平板上分別隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。初級(jí)文庫及次級(jí)文庫鑒定所用引物對(duì)分別為M13F/M13R及T7F/3ADR，鑒定引物序列見表1 （由北京擎科生物科技有限公司合成）。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃充分延伸5 min后4 ℃保存。隨后利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，統(tǒng)計(jì)文庫重組率及插入片段長(zhǎng)度。

1.6 次級(jí)文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

利用PEG /LiAc轉(zhuǎn)化法將次級(jí)文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞Y187。取上述質(zhì)量鑒定合格的次級(jí)文庫質(zhì)粒5 μg與20 μL變性鮭魚精DNA在離心管中充分混勻，隨后加入600 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞Y187，輕柔振蕩混勻后加入2.5 mL PEG/LiAc溶液并再次混勻。將混合液置于30 ℃水浴45 min，期間顛倒混勻數(shù)次。隨后向混合液中加入160 μL二甲基亞砜（DMSO），混勻后置于42 ℃水浴20 min，其間顛倒混勻數(shù)次。室溫700 g離心5 min，棄上清并用30 mL 0.9% NaCl重新懸浮細(xì)胞，立即將菌液均勻涂布于100個(gè)SD-Leu平板上，30 ℃倒置培養(yǎng) 3～6 d。為檢測(cè)酵母文庫滴度，需同時(shí)將上述重懸后的細(xì)胞按1 ∶10、1 ∶100、1 ∶1 000、1 ∶10 000的比例稀釋后涂布于SD-Leu平板，每個(gè)平板均勻涂布100 μL菌液，待平板上長(zhǎng)出菌落后統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量并計(jì)算酵母文庫滴度及酵母文庫轉(zhuǎn)化效率。酵母文庫轉(zhuǎn)化效率（CFU/μg）=（平板菌落數(shù)×懸浮液體積×稀釋倍數(shù)）/（涂布菌液體積×轉(zhuǎn)化DNA量）。

從轉(zhuǎn)化涂布后的平板上隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。隨后將平板置于4 ℃冷卻3～4 h，向每個(gè)平板中加入5 mL YPDA培養(yǎng)基溶液（含30%甘油），用無菌玻璃涂棒均勻刮下所有酵母菌落，計(jì)算酵母細(xì)胞總數(shù)，收集并分裝酵母雙雜交文庫菌液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取、mRNA的分離及dscDNA的合成

提取致病疫霉侵染馬鈴薯葉片不同時(shí)期菌絲混合樣品的總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的總RNA質(zhì)量是否合格。結(jié)果如圖1-A所示，瓊脂糖凝膠電泳后28S rRNA及18S rRNA條帶清晰且無拖尾現(xiàn)象，說明RNA未發(fā)生降解，可用于后續(xù)mRNA的分離純化。用NanoDrop核酸蛋白分析儀檢測(cè)總RNA濃度為0.97 μg/μL，D260 nm/D280 nm為2.26，D260 nm/D230 nm為1.74。上述結(jié)果均表明，致病疫霉侵染馬鈴薯葉片不同時(shí)期菌絲混合樣品的總RNA質(zhì)量較高。使用純化試劑盒分離純化mRNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示分離純化后的mRNA呈彌散狀，條帶均勻分布在500～2 500 bp之間（圖1-B），說明分離的mRNA質(zhì)量較高。隨后，根據(jù)文庫構(gòu)建試劑盒說明書合成雙鏈互補(bǔ)DNA （dscDNA）并進(jìn)行均一化處理，如圖1-C所示，dscDNA呈現(xiàn)出均勻的彌散條帶，條帶大小為500～2 500 bp，說明制備的dscDNA包含了不同大小和豐度的基因，可用于后續(xù)文庫的構(gòu)建。

2.2 cDNA初級(jí)文庫的構(gòu)建及鑒定

cDNA與重組接頭連接后，利用BP重組反應(yīng)將cDNA片段連接到文庫載體pDONR222上。隨后，通過電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌DH10B中，將上述菌液涂布到平板上并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)（圖2-A）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，初級(jí)文庫滴度為4.00×106 CFU/mL，轉(zhuǎn)化后的菌液體積為4 mL，因此初級(jí)文庫容量為1.60×107 CFU。從上述轉(zhuǎn)化涂布后的平板上隨機(jī)挑取24個(gè)單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖2-B所示，所有挑取的單克隆均擴(kuò)增出條帶，條帶大小在1 000～2 000 bp之間。說明致病疫霉cDNA片段成功插入初級(jí)文庫載體，重組率為100%。

2.3 cDNA次級(jí)文庫的構(gòu)建及鑒定

提取cDNA初級(jí)文庫質(zhì)粒，利用LR重組反應(yīng)將初級(jí)文庫質(zhì)粒與次級(jí)文庫載體pGADT7-DEST進(jìn)行重組，將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH10B中，涂布平板并進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)（圖3-A）。結(jié)果表明，次級(jí)文庫滴度為3.80×106 CFU/mL，次級(jí)文庫容量為1.52×107 CFU。隨機(jī)挑取上述轉(zhuǎn)化平板上的24個(gè)單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，所有單克隆都能擴(kuò)增出清晰條帶，條帶大小大多在 1 000～2 000 bp 之間（圖3-B），重組率為100%。上述結(jié)果表明，本研究所構(gòu)建的cDNA次級(jí)文庫容量較大、質(zhì)量較高，完全可以滿足酵母雙雜交篩選互作蛋白的要求。

2.4 cDNA次級(jí)文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞

提取cDNA次級(jí)文庫質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞Y187，制備酵母雙雜交文庫菌液。統(tǒng)計(jì)平板上的酵母菌落數(shù)并計(jì)算得出酵母文庫滴度為1.00×108 CFU/mL （圖4-A），酵母文庫轉(zhuǎn)化效率為6×108 CFU/μg。隨機(jī)挑取24個(gè)酵母單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，所有單克隆都能擴(kuò)增出1條清晰的條帶，條帶大小大多在 750～2 000 bp之間（圖4-B）。綜上，酵母文庫轉(zhuǎn)化效率較高，酵母文庫菌液覆蓋了全部的次級(jí)文庫質(zhì)粒，酵母文庫質(zhì)量較高，可用于后續(xù)互作蛋白的篩選。

3 討論與結(jié)論

由致病疫霉引起的馬鈴薯晚疫病是引起馬鈴薯減產(chǎn)的主要原因。深入探究致病疫霉的致病機(jī)制并在此基礎(chǔ)上選育抗病馬鈴薯新品種是防治馬鈴薯晚疫病的根本措施。全面解析致病疫霉的致病性相關(guān)基因的功能，探究這些基因通過何種機(jī)制促使馬鈴薯感病顯得尤為重要。蛋白質(zhì)是基因編碼的產(chǎn)物也是基因功能的具體執(zhí)行者，大多數(shù)蛋白需要通過與其他蛋白相互作用來發(fā)揮其功能［13］。目前，常用來研究蛋白間相互作用關(guān)系的試驗(yàn)技術(shù)為酵母雙雜交技術(shù)，該技術(shù)具有成本低廉且高效快捷的優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于分析2個(gè)已知蛋白間的相互作用，或者用已知蛋白作為“誘餌”來釣取能夠與之結(jié)合的未知蛋白。

目前，以侵染植物后的病原菌作為材料來源提取RNA并構(gòu)建酵母雙雜交文庫的相關(guān)報(bào)道較少。本研究選取2種不同致病力的致病疫霉菌株侵染馬鈴薯葉片5個(gè)時(shí)間點(diǎn)的菌絲樣品作為cDNA文庫的材料來源，可以準(zhǔn)確反應(yīng)致病疫霉侵染馬鈴薯時(shí)其致病性相關(guān)基因受到激發(fā)的真實(shí)表達(dá)情況，在確保文庫構(gòu)建的完整性的同時(shí)，也保證了文庫的代表性。構(gòu)建高質(zhì)量的酵母雙雜交cDNA文庫對(duì)于后續(xù)篩選互作蛋白至關(guān)重要，cDNA文庫的質(zhì)量直接影響了互作蛋白的篩選效率［15］。本研究采用Gateway法利用特異性重組技術(shù)構(gòu)建文庫，最大程度避免了低豐度基因克隆的丟失；為降低高豐度基因?qū)ξ膸熨|(zhì)量造成的負(fù)面影響，本研究對(duì)dscDNA進(jìn)行了均一化處理，提高了后續(xù)酵母文庫篩選的效率。從初級(jí)文庫及次級(jí)文庫的鑒定結(jié)果來看，本研究得到的初級(jí)文庫容量為1.60×107 CFU，重組率為100%；次級(jí)文庫容量為1.52×107 CFU，重組率為100%；初級(jí)文庫及次級(jí)文庫插入片段的長(zhǎng)度大多在 1 000～2 000 bp 之間，包含了相當(dāng)一部分全長(zhǎng)cDNA序列。用次級(jí)文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞，最終得到酵母文庫菌液，該酵母文庫滴度為1.00×108 CFU/mL，轉(zhuǎn)化效率為6×108 CFU/μg。以上結(jié)果均說明，本研究所構(gòu)建的致病疫霉酵母雙雜交cDNA文庫質(zhì)量較高，理論上利用此文庫能夠篩選出與誘餌蛋白相互作用的所有未知蛋白，這將為后續(xù)深入研究致病疫霉致病相關(guān)基因及其致病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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