鄒強(qiáng),牛新湘,劉 萍,楊紅梅,楚 敏,王 寧,林 青,包慧芳,詹發(fā)強(qiáng),張雨萌,王靜怡,佐長(zhǎng)賡,婁 愷,史應(yīng)武,4,5,
(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所,新疆烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與農(nóng)業(yè)節(jié)水研究所,新疆烏魯木齊 830091;4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830091;5.新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,新疆烏魯木齊 830091)
葡萄(Vitis viniferaL.)是葡萄科葡萄屬木質(zhì)藤本植物,在全世界范圍內(nèi)分布廣泛,其味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高。葡萄含水量較高,采后生理代謝旺盛,在運(yùn)輸和貯藏過程中極易遭受病菌的侵染而引起果實(shí)腐爛變質(zhì)[1]。由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的葡萄灰霉?。℅ray mold)是危害葡萄果實(shí)的主要病害之一,嚴(yán)重影響葡萄的品質(zhì),造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在采后葡萄灰霉病的防治中,通常采用的是SO2、硫化物、吡咯類等化學(xué)藥劑,但是長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑存在很多弊端,如藥劑殘留對(duì)人體以及環(huán)境的危害、大量使用化學(xué)藥劑也增加了病原菌的耐藥性,導(dǎo)致防病效果明顯下降[3?5]。近年來,隨著食品安全問題的日益突出,綠色、安全、高效的生物防治逐漸成為當(dāng)今果蔬防腐保鮮的新方向[6?7]。
生防微生物在宿主體內(nèi)的增殖效率是決定生防效果的關(guān)鍵因素,是生防菌篩選與評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[8]。與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及生存空間是生防菌防病機(jī)制之一,Bacon 等[9]對(duì)玉米內(nèi)生枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)研究發(fā)現(xiàn),其與玉米病原菌串珠鐮孢菌(Fusarium moniliforme)有相同的生態(tài)位點(diǎn),枯草芽孢桿菌能快速地在玉米體內(nèi)定殖,占據(jù)病原菌的生長(zhǎng)位點(diǎn),降低玉米的發(fā)病率。生防菌的次生代謝拮抗物質(zhì)是其發(fā)揮防病作用的重要機(jī)制,高振峰等[10]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌ZSY-1 產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)在濃度為200~400 μg/mL 能有效降低番茄采后早疫病的發(fā)生、延緩果實(shí)軟化。此外,防御酶活性的提高是衡量植物體防御反應(yīng)的重要指標(biāo),也是生防的主要作用機(jī)理,有大量研究表明生防菌能夠誘導(dǎo)植物體內(nèi)相關(guān)防御酶活性變化,以此來提高植物的抗病能力[11?13]。陳劉軍等[14]研究證實(shí)蠟質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus cereus)AR156 處理水稻后,誘導(dǎo)植株內(nèi)抗病基因上調(diào)表達(dá),增加水稻防御酶活性,從而抑制水稻紋枯病的發(fā)生。
有研究表明許多微生物具有防治灰霉病的作用,如枯草芽孢桿菌、多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、酵母菌(Saccharomyces)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等[2,15?17]。貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)是芽孢桿菌屬的一個(gè)新種,最早于1999 年被Ruiz 等[18]分離得到,最初認(rèn)為貝萊斯芽孢桿菌是枯草芽孢桿菌的一個(gè)亞種。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步,Dunlap 等[19]通過比較基因組學(xué)的方法對(duì)貝萊斯芽孢桿菌及其相近種進(jìn)行了分類,認(rèn)為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌植物亞種是貝萊斯芽孢桿菌的異名。研究表明貝萊斯芽孢桿菌抑菌譜廣,具有防治多種植物病害的潛力[20],是一種應(yīng)用前景廣泛的生防資源。張倩等[21]研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌KT 可通過分泌抗菌物質(zhì)以及誘導(dǎo)甜櫻桃果實(shí)防御酶活性的提高從而抑制甜櫻桃軟腐病的發(fā)生。還有研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌SB023 發(fā)酵液可顯著抑制杧果炭疽病病原菌的生長(zhǎng),具有良好的生防效果[22]。然而目前關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌防治葡萄灰霉病的研究鮮有報(bào)道,因此,研究貝萊斯芽孢桿菌在葡萄中的定殖能力以及生防機(jī)制,對(duì)該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用具有重要意義。
本文以前期篩選的貝萊斯芽孢桿菌TP-1 為研究對(duì)象,采用抗生素標(biāo)記法篩選出具有抗利福平標(biāo)記的抗性菌株,研究其在葡萄中的定殖能力、對(duì)葡萄果實(shí)腐爛率的影響以及對(duì)葡萄中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(PPO)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等抗病相關(guān)酶活性的影響,初步探討貝萊斯芽孢桿菌誘導(dǎo)葡萄對(duì)灰霉病產(chǎn)生抗性的機(jī)理,為葡萄灰霉病的防治提供一定的理論參考。
“玫瑰香”葡萄 購自烏魯木齊市沙依巴克區(qū)北園春水果市場(chǎng),選取果實(shí)飽滿、無損傷、大小相似、成熟度基本一致的葡萄,立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。貝萊斯芽孢桿菌TP-1 采集新疆五家渠市葡萄園根際土壤,通過稀釋涂布法分離菌株,以灰葡萄孢PH-23 為指示菌,通過平板對(duì)峙法篩選得到[23];灰葡萄孢PH-23由本實(shí)驗(yàn)室從葡萄果實(shí)病健交界處分離,再回接到葡萄果實(shí)上進(jìn)行驗(yàn)證,得到此菌株;馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(PDB)青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;苯丙氨酸解氨酶(PAL)試劑盒、多酚氧化酶(PPO)試劑盒、抗壞血酸過氧化物酶(APX)試劑盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司;利福平(Rifampicin)上海生工生物工程有限公司。
ZWY-2102C 型智城恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司;UVZ2450 型紫外分光光度計(jì) 日本島津自動(dòng)化設(shè)備有限公司;GMSX–280型高壓蒸汽滅菌鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器廠;CENTRIFUGE 型高速冷凍離心機(jī) EPPENDORF;RXZ 型智能人工氣候箱 寧波江南儀器廠制造;DH–9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海恒一科技有限公司。
1.2.1 貝萊斯芽孢桿菌抗利福平標(biāo)記 參照羅云艷[24]的方法,采用抗生素標(biāo)記法篩選貝萊斯芽孢桿菌的抗性標(biāo)記菌株,配制利福平濃度為10、20、30、50、100、150、200、250、300 μg/mL 的NA 培養(yǎng)基。將貝萊斯芽孢桿菌TP-1 接種于含10 μg/mL 利福平的NA 平板中,34 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h,待菌落大小約1 cm 時(shí),挑取形態(tài)與原始菌株相同的新菌落接種到含有相同濃度抗生素的NA 平板上,繼代培養(yǎng)24 h后,再接入利福平濃度為20 μg/mL 的NA 平板上培養(yǎng),直到篩選出能在300 μg/mL 利福平下正常生長(zhǎng)且菌落形態(tài)與原始菌株相同的標(biāo)記菌株[25?26]。利用平板對(duì)峙法,測(cè)定標(biāo)記菌株的對(duì)灰葡萄孢的拮抗作用,以原始菌株為對(duì)照,最終獲得穩(wěn)定生長(zhǎng),且對(duì)灰葡萄孢的拮抗作用與原始菌株無明顯差異的標(biāo)記菌株。
1.2.2 標(biāo)記菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定 將獲得的標(biāo)記菌株接種在不添加利福平的NA 培養(yǎng)基上,在34 ℃下繼代培養(yǎng)15 代后接種到利福平濃度為300 μg/mL的NA 培養(yǎng)基上,在相同條件下繼代培養(yǎng)15 代。然后檢測(cè)標(biāo)記菌株在添加利福平和不添加利福平的NA 培養(yǎng)基中的數(shù)量,比較其有無明顯差異[27]。
1.2.3 貝萊斯芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線 根據(jù)郗良卿等[28]的方法進(jìn)行改進(jìn),用無菌接種環(huán)分別將標(biāo)記菌株與原始菌株接種于裝有100 mL NB 培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中,在30 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)。以未接菌的NB 培養(yǎng)液為空白。0~10 h 每1 h 取一次樣,10 h 后每隔2 h 取一次樣,32 h 結(jié)束,用紫外分光光度計(jì)在600 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值,比較標(biāo)記菌株與原始菌株的生長(zhǎng)曲線是否存在差異。
1.2.4 貝萊斯芽孢桿菌在葡萄果實(shí)中的定殖能力標(biāo)記菌株發(fā)酵液:將標(biāo)記菌株接種至含300 μg/mL利福平的NB 培養(yǎng)基中,于30 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h,調(diào)節(jié)濃度至1.0×107CFU/mL。
灰葡萄孢孢子懸浮液:將灰葡萄孢接種于PDA上,27 ℃下培養(yǎng)7 d 后,用無菌水沖洗,然后用滅過菌的紗布進(jìn)行過濾得到孢子懸浮液,調(diào)節(jié)濃度到1×106孢子/mL。
參照羅琳等[29]的葡萄處理方法,選取大小和成熟度相近的葡萄果實(shí),用無菌水將葡萄洗凈,再用75%酒精進(jìn)行表面消毒,然后用無菌水沖洗3 次,自然晾干后,用無菌打孔器在葡萄表面赤道部位打取直徑2 mm、深2 mm 的傷口。吸取10 μL 的拮抗菌液和灰葡萄孢孢子懸浮液接種于葡萄果實(shí)傷口內(nèi),以只接種拮抗菌液的葡萄為對(duì)照。于20 ℃、相對(duì)濕度為85%條件下貯藏。以接種后1 h 測(cè)定的細(xì)菌數(shù)量為起始值,而后于接種第5、10、15、20、25、30 d 取樣測(cè)定。測(cè)定方法為取傷口處果肉組織,放于無菌研缽中研磨,用無菌水稀釋至適宜濃度,取100 μL 稀釋液于含300 μg/mL 利福平的NA 平板上進(jìn)行稀釋涂布,30 ℃下恒溫培養(yǎng)計(jì)數(shù)。每個(gè)處理3 次重復(fù),每重復(fù)10 顆葡萄。
1.2.5 貝萊斯芽孢桿菌對(duì)葡萄果實(shí)腐爛率的影響選取大小和成熟度相近的葡萄果實(shí),以1.2.4 相同方法進(jìn)行消毒清洗。用無菌打孔器在果實(shí)赤道處打取直徑2 mm、深2 mm 的孔[30]。共分6 個(gè)處理:接種10 μL 無菌水為空白對(duì)照(CK);只接種10 μL 拮抗菌發(fā)酵液(T1);接種5 μL 拮抗菌發(fā)酵液,1 h 后接種5 μL 灰葡萄孢孢子懸浮液(T2);接種10 μL 灰葡萄孢孢子懸浮液為病原菌對(duì)照組(T3);接種5 μL 灰葡萄孢孢子懸浮液,1 h 后接種5 μL 拮抗菌發(fā)酵液(T4);拮抗菌發(fā)酵液(5 μL)與灰葡萄孢孢子懸浮液(5 μL)同時(shí)接種(T5)。接種后果實(shí)置于密封的保鮮盒中,在20 ℃、相對(duì)濕度為85%條件下貯藏。每個(gè)處理3 次重復(fù),每重復(fù)10 顆葡萄。每5 d 統(tǒng)計(jì)果實(shí)腐爛情況,共統(tǒng)計(jì)5 次,計(jì)算腐爛率。將病斑直徑大于4 mm 記為發(fā)病果實(shí),其相較于總果數(shù)的比例記為腐爛率。
1.2.6 防御相關(guān)酶活性的測(cè)定 選取大小和成熟度相同的葡萄,用無菌打孔器在葡萄果實(shí)赤道部位打出一個(gè)直徑、深淺相同的傷口(2 mm)。實(shí)驗(yàn)選取1.2.5 中CK、T1、T2、T3 4 個(gè)處理組。常溫下貯藏,相對(duì)濕度85%。每個(gè)處理3 次重復(fù)。在貯藏第5、10、15、20、25 d 取樣檢測(cè),按照試劑盒步驟測(cè)定酶活性。
PAL 酶活單位定義:每g 組織在每mL 反應(yīng)體系中每min 使290 nm 下吸光值變化0.05 為一個(gè)酶活性單位(U/g FW)。PPO 酶活單位定義:每min 每g組織在每mL 反應(yīng)體系中使525 nm 處吸光值變化0.005 為一個(gè)酶活性單位(U/g FW)。APX 酶活單位定義:每g 組織每min 氧化1 nmol AsA 為1 個(gè)酶活性單位(nmol/min/g FW)。
本研究每處理3 個(gè)平行,每平行3 次重復(fù),數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Excel 2016 和SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,應(yīng)用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。使用Origin 2020 軟件繪圖。
2.1.1 抗生素標(biāo)記菌株的篩選 采用抗生素標(biāo)記法獲得可以在利福平濃度為300 μg/mL 的平板上正常生長(zhǎng)的標(biāo)記菌株TP-1R,并且其菌落形態(tài)沒有發(fā)生明顯改變。圖1(a)為標(biāo)記菌株TP-1R在含利福平濃度為300 μg/mL NA 平板的菌落圖。圖1(b)顯示標(biāo)記菌株抑菌圈直徑為22.14±0.24 mm,原始菌株抑菌圈直徑為22.48±0.16 mm,兩者無明顯差異,表明經(jīng)利福平標(biāo)記的標(biāo)記菌株與原始菌株對(duì)病原菌的拮抗能力無顯著差異(P>0.05)。
圖1 標(biāo)記菌株的篩選Fig.1 Screening of labeled strains
2.1.2 標(biāo)記菌株遺傳穩(wěn)定性分析 標(biāo)記菌株在含利福平的NA 培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)15 代,其第5、10、15 代菌落數(shù)分別為1.0×109、1.01×109、0.97×109CFU/mL,在不含利福平的NA 培養(yǎng)基中第5、10、15 代菌落數(shù)分別為1.0×109、0.99×109、0.95×109CFU/mL,兩者間無明顯差異(P>0.05),均能穩(wěn)定生長(zhǎng)(圖2)。
圖2 標(biāo)記菌株TP-1R 的抗性遺傳穩(wěn)定性Fig.2 Genetic stability of resistance of marker strain TP-1R
2.1.3 標(biāo)記菌株與原始菌株生長(zhǎng)曲線 從圖3 可以看出標(biāo)記菌株與原始菌株的生長(zhǎng)曲線基本一致,3 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,在培養(yǎng)18 h 時(shí)標(biāo)記菌株OD 值達(dá)到峰值,為3.986,原始菌株OD 值為4.063,差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明標(biāo)記菌株的抗性穩(wěn)定,能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
圖3 標(biāo)記菌株與原始菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of labeled strain and original strain
2.2.1 貝萊斯芽孢桿菌在萄果實(shí)中的定殖 由圖4可知,兩個(gè)處理組在葡萄果實(shí)上的數(shù)量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)。可能是由于拮抗菌在接種后需要適應(yīng)其生態(tài)位點(diǎn)并與病原菌進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng),定殖數(shù)量有所下降,在拮抗菌適應(yīng)生態(tài)位點(diǎn)后,定殖數(shù)量開始上升,在宿主營(yíng)養(yǎng)消耗殆盡,拮抗菌定殖數(shù)量開始逐漸下降[31]。不同時(shí)期T 處理組回收到的標(biāo)記菌株數(shù)量均多于T+P 處理組,都在第15 d時(shí)定殖數(shù)量達(dá)到最高值,T 處理組為4.32×106CFU/g,T+P 處理組為4.08×106CFU/g。分別是初始值的1.23倍和1.20 倍。隨著時(shí)間的延長(zhǎng),標(biāo)記菌株的數(shù)量也逐漸下降,其中在第30 d 時(shí)T 處理組和T+P 處理組可以回收到的標(biāo)記菌株數(shù)量分別為3.11×106CFU/g,2.93×106CFU/g,表明貝萊斯芽孢桿菌TP-1R在葡萄上具有較強(qiáng)的定殖能力。
圖4 拮抗菌TP-1R 在葡萄中的定殖動(dòng)態(tài)Fig.4 Colonization dynamics of antagonistic TP-1R in grape
2.2.2 貝萊斯芽孢桿菌對(duì)葡萄果實(shí)腐爛率的影響腐爛率能夠直接反映果實(shí)的感官品質(zhì),是影響果實(shí)貯藏品質(zhì)的重要指標(biāo)。由圖5 可以看出,在整個(gè)貯藏期間玫瑰香葡萄腐爛率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。T1 處理組的葡萄腐爛率要顯著低于其他處理組(P<0.05),在第5 d 時(shí)T1 處理組無腐爛果實(shí),在貯藏第25 d 時(shí)T1 處理組腐爛率為35.76%,CK、T2、T3、T4、T5 處理組腐爛率分別為81.84%、39.14%、100%、53.39%、44.28%。其中T2 處理組腐爛率要低于T5 處理組,說明提前接種貝萊斯芽孢桿菌可有效抑制病原菌生長(zhǎng),減緩貯藏期間葡萄果實(shí)的腐爛。
圖5 貝萊斯芽孢桿菌TP-1R 對(duì)葡萄腐爛率的影響Fig.5 Effect of Bacillus velezensis TP-1R on decay rate of grape
2.3.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的變化 由圖6可以看出,4 種不同處理下,葡萄中PAL 的活性都隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。初期在受到病原菌侵染,激活宿主防御反應(yīng),PAL 活性逐漸上升,后期宿主體內(nèi)代謝減緩,宿主體內(nèi)酶活也逐漸下降。在貯藏第15 d 時(shí),4 個(gè)處理組葡萄中PAL 活性達(dá)到最大值,其中,T2 處理組的葡萄PAL 活性最大,為6.80 U/g FW,是對(duì)照組(CK)的1.41 倍。T1 處理組葡萄PAL 活性為5.96 U/g FW,是對(duì)照組(CK)的1.23倍。T2 處理組PAL 活性峰值明顯大于T1 處理組PAL 活性峰值(P<0.05)。表明混合接種對(duì)葡萄PAL誘導(dǎo)活性要大于單獨(dú)接種貝萊斯芽孢桿菌TP-1R對(duì)葡萄PAL 誘導(dǎo)活性,可能是因?yàn)閮烧咴谡T導(dǎo)PAL 酶活中具有協(xié)同作用。拮抗菌TP-1R處理葡萄后能有效減緩PAL 活性的降低。
圖6 不同處理對(duì)葡萄PAL 活性的影響Fig.6 Effects of different treatments on PAL activity of grape
2.3.2 多酚氧化酶(PPO)活性的變化 由圖7 可知,在貯藏期間,不同處理下的葡萄PPO 活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。T1 處理與T2 處理均能提高葡萄PPO 活性,除第10 d 二者無顯著差異外(P>0.05),T1 處理對(duì)葡萄PPO 的誘導(dǎo)效應(yīng)均大于T2 處理。四個(gè)處理的PPO 活性均于貯藏第15 d 達(dá)到峰值,其中T1 處理的PPO 活性最大,為73.15 U/g FW,是對(duì)照組(CK)的1.19 倍;T2 處理組葡萄PPO 活性為68.11 U/g FW,是對(duì)照組(CK)的1.11 倍。
圖7 不同處理對(duì)葡萄PPO 活性的影響Fig.7 Effects of different treatments on PPO activity of grape
2.3.3 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的變化從圖8 可以看出,在貯藏期間,不同處理下葡萄APX活性呈先上升后下降的趨勢(shì),且T1 和T2 處理組葡萄APX 活性顯著高于其他處理組(P<0.05)。各處理組的APX 活性均于貯藏第15 d 達(dá)到峰值,T1 處理為816.51 nmol/min/g FW,T2 處理為703.58 nmol/min/g FW,分別是對(duì)照組(CK)的2.01 倍和1.74 倍。單獨(dú)接種貝萊斯芽孢桿菌對(duì)葡萄APX 誘導(dǎo)效應(yīng)要顯著高于其他處理組(P<0.05)。表明貝萊斯芽孢桿菌處理能有效減緩葡萄APX 活性的降低。
圖8 不同處理對(duì)葡萄APX 活性的影響Fig.8 Effects of different treatments on APX activity of grape
生防菌是否可以在宿主體內(nèi)穩(wěn)定定殖以及定殖數(shù)量是影響生防效果的關(guān)鍵因素。目前用于研究生防菌在宿主體內(nèi)定殖情況的方法主要有:抗生素標(biāo)記法、同位素示蹤法、基因標(biāo)記法等。其中抗生素標(biāo)記法具有簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用、不會(huì)改變?cè)季甑闹匾再|(zhì)等特點(diǎn),適用于追蹤微生物在宿主體內(nèi)的定殖情況[8,12,27,32]。本研究通過用抗生素標(biāo)記法,篩選出了能抗300 μg/mL 利福平的標(biāo)記菌株TP-1R,其拮抗性能、外觀形態(tài)等均與原始菌株無明顯差異,且抗性標(biāo)記可穩(wěn)定遺傳。本研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌在葡萄中的定殖規(guī)律呈現(xiàn)先下降后上升再下降趨勢(shì)。在貯藏后期其定殖數(shù)量還可達(dá)到3.11×106CFU/g,表明菌株TP-1R能在葡萄上穩(wěn)定定殖。生防菌在宿主上的定殖是一個(gè)十分復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程,溫度、接種量、宿主自身特性等因素都會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響[33]。其中生防菌能否很快適應(yīng)宿主所在的微生態(tài)環(huán)境,從而占據(jù)有利位點(diǎn),抑制病原微生物的生長(zhǎng)是其有效發(fā)揮生防作用的重要因素。目前只是在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下研究了貝萊斯芽孢桿菌的定殖能力,為了進(jìn)一步地提高其在實(shí)際應(yīng)用的效果,還需要對(duì)影響其定殖量的因素做更深入的研究。
誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性是生防菌發(fā)揮防病作用的重要機(jī)制之一。參與植物體內(nèi)生理代謝的APX、PPO、PAL、POD 等酶系與植物抵抗病原菌侵染有著密切關(guān)系。APX 是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一,APX 酶能有效提高植物的活性氧代謝水平,并且能促進(jìn)維生素C 的代謝水平,有效清除植物體內(nèi)過多的活性氧,提高APX 的活性可以減輕果實(shí)的氧化損傷,降低腐爛率[4]。其中PAL 是苯丙烷代謝途徑的關(guān)鍵酶,參與酚類、植保素和木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)的合成[34],已有研究表明酚的代謝產(chǎn)物是潛在的抗病因子,而PPO 酶能將酚類物質(zhì)氧化為活性更強(qiáng)的醌類物質(zhì),并能促進(jìn)木質(zhì)素的合成,增加植物的抗病能力[35?36]。已有大量研究報(bào)道芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)植物防御酶活性的提高,從而抵抗病原菌的侵染。孫一凡等[37]發(fā)現(xiàn)側(cè)孢芽孢桿菌BI13 可以誘導(dǎo)番茄葉片防御酶活性的提高增強(qiáng)植物對(duì)番茄早疫病的抗性。孫建波等[38]研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)枯草芽孢桿菌XB16 處理后的香蕉,其POD 和PPO 活性均比接種病原菌和清水對(duì)照高。王雪等[39]采用灌根法對(duì)人參進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌FS6 能夠提高人參CAT、PPO、POD 酶活性,增強(qiáng)人參對(duì)根腐病菌的抗性。本研究中發(fā)現(xiàn),葡萄果實(shí)在受到灰葡萄孢侵染時(shí),與對(duì)照相比葡萄中PAL、PPO、APX 活性略有上升,表明病原菌也可以誘導(dǎo)植物相關(guān)防御酶活性的提高,可能原因是葡萄在受到病菌入侵后,為了抵御病菌,體內(nèi)防御酶基因被激活,相關(guān)防御酶上調(diào)表達(dá)。此外經(jīng)拮抗菌處理和拮抗菌與病原菌共同處理的葡萄防御酶活性均高于對(duì)照組以及灰葡萄孢處理,防御酶活性有更大程度的增加,說明菌株TP-1R能誘導(dǎo)植物進(jìn)一步提高防御酶活性,增強(qiáng)對(duì)灰葡萄孢的抗性。且拮抗菌和病原菌共同誘導(dǎo)的PAL 活性要高于單獨(dú)接種拮抗菌和病原菌,表明兩者共同誘導(dǎo)對(duì)PAL 活性有協(xié)同增效的作用。防御酶的活性是植物抗病性的重要生理特征,酶活性越高,抗病性越強(qiáng)。此外防御酶相關(guān)基因的增強(qiáng)有助于防御系統(tǒng)的激活,防御酶相關(guān)基因的表達(dá)水平與相應(yīng)酶活性密切相關(guān)[4,40]。關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌TP-1R誘導(dǎo)相關(guān)防御酶基因的表達(dá)水平以及關(guān)于其抑菌物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。
本研究通過抗生素標(biāo)記法測(cè)定貝萊斯芽孢桿菌TP-1R在葡萄上定殖能力,發(fā)現(xiàn)其在貯藏第30 d 菌株定殖數(shù)量仍可達(dá)到3.11×106CFU/g,表明拮抗菌TP-1R能夠在葡萄果實(shí)穩(wěn)定定殖,從而有效發(fā)揮其生防效果。后續(xù)課題組將采用GFP 基因標(biāo)記法,研究菌株TP-1R在葡萄生長(zhǎng)期間的定殖動(dòng)態(tài),對(duì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行補(bǔ)充驗(yàn)證。在接種拮抗菌發(fā)酵液后,能有效防治葡萄灰霉病,降低葡萄果實(shí)腐爛率,在貯藏第25 d 時(shí)葡萄腐爛率為35.76%。在貯藏期間,葡萄防御酶PAL、PPO、APX 均呈先上升后下降的趨勢(shì),接種拮抗菌TP-1R的葡萄3 種酶活性顯著高于CK(P<0.05),在第15 d 時(shí),拮抗菌處理組PAL、PPO、APX 活性是CK 的1.23、1.19、2.01 倍。貝萊斯芽孢桿菌TP-1R處理能夠提高葡萄防御酶PAL、PPO、APX 的活性,增強(qiáng)葡萄對(duì)灰霉病的防御能力。本研究為利用該菌株進(jìn)行生防菌劑的研制提供了理論依據(jù),為后續(xù)研究貝萊斯芽孢桿菌對(duì)葡萄防御物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。