勵(lì)炯，吳 瓊，江 海，扈明潔，金朦娜，閆金花

（杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院，浙江杭州 310017）

食用動(dòng)物內(nèi)臟一直是我國(guó)幾千年飲食文化中重要的一部分，爆炒雞心、熘肝尖、紅燒鴨腸等等，很多可食用內(nèi)臟是我國(guó)各種菜系中的經(jīng)典之作，同時(shí)，近年來(lái)特別流行的火鍋、燒烤及鹵味文化，更是把各種動(dòng)物內(nèi)臟的吃法發(fā)揮到極致[1]。動(dòng)物內(nèi)臟不僅美味，而且營(yíng)養(yǎng)豐富[2]，能有效補(bǔ)充人體各種微量元素和維生素等營(yíng)養(yǎng)元素的需求，防止由于這些營(yíng)養(yǎng)元素的缺失而導(dǎo)致的各種疾病[3]。市面上常見(jiàn)的畜禽類內(nèi)臟食材通常以整個(gè)部位進(jìn)行銷售，而豬牛羊畜類動(dòng)物以及雞鴨鵝等禽類動(dòng)物內(nèi)臟，由于其體型和種屬相近的緣由，再加上不法商家會(huì)采用香精等對(duì)其原有的氣味進(jìn)行掩蓋，經(jīng)過(guò)粉碎、煙熏、腌制等深加工處理的可食用內(nèi)臟，使其原有的感官性狀發(fā)生改變，普通消費(fèi)者很難用感官進(jìn)行判斷鑒別[4?6]。其次，不同來(lái)源內(nèi)臟的價(jià)格差異，增加了用低價(jià)內(nèi)臟來(lái)替代高價(jià)內(nèi)臟的風(fēng)險(xiǎn)性。

近年來(lái)，越來(lái)越多基于分子水平的技術(shù)研究應(yīng)用于食品摻假鑒別中，一般包括蛋白分析技術(shù)或者基于DNA 分析[7?12]。由于基于蛋白的摻假技術(shù)存在無(wú)法區(qū)分相近物種或者深加工食品摻假等問(wèn)題，基于DNA 的技術(shù)具有較強(qiáng)的特異性和靈敏度，也可以對(duì)深加工食品進(jìn)行鑒別，越來(lái)越多的摻假研究集中在基于DNA 分析的技術(shù)方面[13?15]。

由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和通用性等問(wèn)題，大多數(shù)基于DNA 分析的鑒別技術(shù)沒(méi)有得到廣泛的應(yīng)用，局限性較明顯，可靠性和專屬性不強(qiáng)[16?17]。DNA 條形碼技術(shù)（DNA Barcoding）作為一種可靠快速的鑒定手段，越來(lái)越多的應(yīng)用于各種領(lǐng)域的物種的鑒別，其是利用一段相對(duì)較短的DNA 片段，該片段容易擴(kuò)增且有足夠的變異性[18?20]。很多研究采用線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞基Ι（Cytochrome Coxidase Subunit I，COI）基因的650 bp 左右大小的片段區(qū)域來(lái)研究可食用動(dòng)物內(nèi)臟的摻假，該片段符合DNA 條形碼技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因需具有足夠的特異性和種間足夠的多樣性的要求，被用于多種動(dòng)物源食品的摻假鑒別與應(yīng)用中，也稱全片段DNA 條形碼技術(shù)（Full-length DNA Barcoding）[21?22]。毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)是利用高壓電場(chǎng)下，由于各DNA 片段的大小、帶電荷數(shù)、等電點(diǎn)等性質(zhì)不同，在凝膠電泳上的遷移速度不一致，各組分依次移動(dòng)至毛細(xì)管輸出端附近的光檢測(cè)器，檢測(cè)和記錄其吸光度，并將各組分以吸收峰的形式動(dòng)態(tài)直觀地記錄下來(lái)，自動(dòng)分析出各目的片段的堿基數(shù)[23?24]。毛細(xì)管凝膠電泳分析技術(shù)極大的簡(jiǎn)化了PCR 產(chǎn)物的分析步驟，提高了檢測(cè)效率，其檢測(cè)分辨率低至3～5 bp，記錄的吸光值使得PCR 產(chǎn)物的分析更加直觀并可以進(jìn)行量化分析[25?26]。

目前關(guān)于可食用動(dòng)物內(nèi)臟的摻假研究有限，未曾有對(duì)整個(gè)可食用動(dòng)物內(nèi)臟摻假風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行系統(tǒng)性研究和評(píng)估，也沒(méi)有一套完整的摻假鑒別技術(shù)來(lái)提供相關(guān)的技術(shù)支持，特別是可食用內(nèi)臟復(fù)雜的基質(zhì)以及摻假鑒別技術(shù)對(duì)樣品前處理的特殊要求（比如防止漏檢和誤檢），給可食用內(nèi)臟鑒別帶來(lái)一定的困難，再加上經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)動(dòng)，給一些不法商家提供了可乘之機(jī)，市售可食用內(nèi)臟摻假行為層出不窮。本文以常見(jiàn)的7 種動(dòng)物源的5 類可食用內(nèi)臟為研究對(duì)象，首次將毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)與DNA 條形碼技術(shù)結(jié)合，建立基于COI 序列的鑒別可食用動(dòng)物內(nèi)臟摻假的檢測(cè)技術(shù)，以期能為市售可食用動(dòng)物內(nèi)臟的質(zhì)量監(jiān)督提供技術(shù)支持和保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

為了保證研究的動(dòng)物內(nèi)臟沒(méi)有摻假，所用的5類可食用動(dòng)物內(nèi)臟（包括胃、腸、肝、腎、肺）于屠宰場(chǎng)屠宰整只豬、牛、羊、雞、鴨、鵝、兔時(shí)取樣，作為本研究方法學(xué)建立與優(yōu)化的原料；共計(jì)25 批次新鮮動(dòng)物內(nèi)臟及其制品 研究所用的實(shí)際樣品來(lái)自杭州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)及超市，置于?20 ℃保存。

血液與組織DNA 提取試劑盒、QIAxcel DNA High Resolution Kit（1200）、QX Alignment Marker 15/600 bp、QX DNA Size Marker 15～1500 bp 均購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司；即用PCR 擴(kuò)增試劑、擴(kuò)增產(chǎn)物回收試劑盒 購(gòu)自上海生工公司；T4連接試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞 購(gòu)自TaKaRa 公司。

QIAxcel 全自動(dòng)毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng) 購(gòu)自德國(guó)Qiagen 公司；Veriti 96 孔梯度PCR 儀 購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；EYELA FDU-1100 真空冷凍干燥器購(gòu)自日本東京理化公司；NanoDrop 1000 微量核酸蛋白測(cè)定儀、冷凍高速離心機(jī) 均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 將7 種動(dòng)物的5 類可食用內(nèi)臟以及25 批次可食用動(dòng)物制品分別用刀切成小塊或小段后，取100 g 樣品泡于250 mL 生理鹽水中，超聲處理30 min，過(guò)濾，去掉濾液，反復(fù)處理后直至除去血水，殘?jiān)昧侠頇C(jī)進(jìn)行粉碎處理，在?80 ℃下預(yù)冷4 h 后的樣品置真空冷凍干燥箱（溫度≤?50 ℃，真空度≤1×10?4Pa）處理24 h，冷凍干燥處理后的樣品經(jīng)粉碎過(guò)篩后，室溫存放于干燥器中，備用。

1.2.2 DNA 提取與純化 由于動(dòng)物內(nèi)臟基質(zhì)較復(fù)雜，需要一定的DNA 純化步驟才可以保證7 種動(dòng)物的5 類內(nèi)臟的DNA 的擴(kuò)增效率，本文在DNeasy 血液與組織提取試劑盒的操作規(guī)程的基礎(chǔ)上進(jìn)行一定的改進(jìn)，具體操作如下：0.5 g 樣品中加入2 mL ATL緩沖溶液和0.2 mL 蛋白酶K，56 ℃裂解至溶液澄清。取裂解液0.25 mL，純化過(guò)程按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。最后將純化的DNA 用37 ℃預(yù)熱的AE 緩沖液洗脫DNA，?20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 COI 基因的擴(kuò)增 本文最終選用了Ivanova等[27]公開(kāi)發(fā)表的一對(duì)引物（COI-A，詳細(xì)序列見(jiàn)表1），為了方便DNA 測(cè)序，在每對(duì)引物上連接M13，引物合成由杭州擎科生物技術(shù)有限公司提供支持。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequence of genes

本文采用了25 μL 的PCR 擴(kuò)增體系，每個(gè)體系由以下試劑組成：12.5 μL 即用PCR 擴(kuò)增試劑（上海生工公司），9.5 μL 重蒸水，0.5 μL 10 μmol/L 正向引物，0.5 μL 10 μmol/L 反向引物，2 μL DNA 模板。DNA 條形碼片段擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性1 min，46 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s（5 個(gè)循環(huán)）；95 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s（35個(gè)循環(huán)）；最后72 ℃延伸10 min。將擴(kuò)增片段儲(chǔ)存于?20 ℃，備用。

1.2.4 毛細(xì)管凝膠電泳確認(rèn) 采用QIAxcel 毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行確認(rèn)分析，對(duì)可食用動(dòng)物內(nèi)臟的COI 基因的擴(kuò)增效率進(jìn)行初步確認(rèn)。將Alignment Marker 校準(zhǔn)過(guò)并進(jìn)行平衡的凝膠卡夾置于儀器內(nèi)，樣品分析盤內(nèi)分別放入已加入10 μL DNA size marker 以及動(dòng)物內(nèi)臟的擴(kuò)增產(chǎn)物的小管，由于本文采用的擴(kuò)增條件的擴(kuò)增效率很高，本文最終將擴(kuò)增產(chǎn)物用緩沖液稀釋至100 倍后再進(jìn)行分析，毛細(xì)管凝膠電泳分析時(shí)間為5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DNA High Resolution Kit（1200）凝膠電泳分離后進(jìn)行確認(rèn)分析。確認(rèn)后的PCR 產(chǎn)物送公司進(jìn)行測(cè)序（杭州擎科生物技術(shù)有限公司），所得的測(cè)序結(jié)果經(jīng)刪除兩端引物序列，獲得最終的擴(kuò)增序列。

1.2.5 PCR 產(chǎn)物克隆測(cè)序 切膠回收純化后的PCR產(chǎn)物與pGEM-T 載體連接后，導(dǎo)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，經(jīng)過(guò)藍(lán)-白篩選后，挑取10 個(gè)不同的白色菌落接種到LB 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜（36 ℃，150 r/min 搖床），取菌液1 mL 提取質(zhì)粒DNA，送杭州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.6 測(cè)序結(jié)果分析 將經(jīng)刪除兩端引物和質(zhì)粒序列后的測(cè)序結(jié)果提交本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行DNA 序列比對(duì)，便可以得到摻假樣品中混有其他不同動(dòng)物來(lái)源的內(nèi)臟的序列，從而準(zhǔn)確的分析出摻假樣品中含有的動(dòng)物源種類。同時(shí)利用美國(guó)國(guó)家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)樣品的COI 序列進(jìn)行鑒定和相似度分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 摻假樣品預(yù)處理方法的優(yōu)化

相對(duì)其他生物樣本，動(dòng)物內(nèi)臟的基質(zhì)較為復(fù)雜，一般在DNA 提取純化之前，需要采用一定的預(yù)清理方式，將含有的組織液和血液進(jìn)行清除[28?30]。本文將切成小塊的動(dòng)物內(nèi)臟用生理鹽水浸泡并進(jìn)行超聲清洗處理。DNeasy 血液與組織提取試劑盒的說(shuō)明書的取樣方式是采用一次性鑷子直接從樣品上取一定量的樣品，由于本文是針對(duì)摻假樣品的研究，取樣的均一性和代表性直接影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。摻混樣品預(yù)處理方式的選擇會(huì)直接決定取樣之前樣品的均一性，是影響被取樣品的代表性的最重要的因素。一般動(dòng)物組織的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的預(yù)處理方式有2 種，即料理機(jī)粉碎混勻和液氮研磨法。而現(xiàn)代高科技技術(shù)的不斷進(jìn)步，涌現(xiàn)出很多先進(jìn)的樣品前處理技術(shù)和設(shè)備，真空冷凍干燥技術(shù)也越來(lái)越多的應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的前處理技術(shù)中。本文采用含10%雞源性成分的鴨腸，來(lái)考察上述三種預(yù)處理方式的可靠性，具體操作如下：各取5 組含10%雞源性成分的鴨腸（每組20 份樣品），分別經(jīng)三種預(yù)處理方式，前處理和分析參照1.2 節(jié)，結(jié)果用雞腸檢出率來(lái)對(duì)樣品均一性進(jìn)行分析，由圖1 可知：采用真空冷凍干燥法進(jìn)行預(yù)處理的樣品檢測(cè)結(jié)果，與其他兩種預(yù)處理檢測(cè)結(jié)果有顯著性差異（P<0.001），雞源性成分檢出率達(dá)到100%，采用真空冷凍干燥處理后的摻假樣品，由于將樣品直接冷凍干燥，再用粉粹機(jī)處理成均一性較好的粉末混合樣品，而其他兩種方式處理的樣品，有不同程度的漏檢情況發(fā)生，所以本文最終選擇真空冷凍干燥法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。

圖1 不同前處理方式（A）和不同取樣量（B）對(duì)鴨腸摻假模型（含10%雞源性成分）中的摻假成分檢出率的影響Fig.1 Effect of different pretreatment methods (A) and sampling volumes (B) on the detection rate of adulterated ingredients in the duck sausage adulteration model (containing 10% chicken-derived ingredients)

一般生物樣品的DNA 提取與凈化均可以完全按照DNA 提取試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，比如樣品的取樣，用一次性鑷子取10～25 mg 即可。由于摻假樣品對(duì)均一性的要求，取樣量太少會(huì)影響樣品的代表性，從而影響摻假檢出情況，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤判。本文采用含10%雞源性成分的鴨腸考察動(dòng)物內(nèi)臟摻假樣品中的最佳取樣量，采用0.025、0.1、0.5 g 三個(gè)取樣量進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)取樣量為0.5 g 時(shí)，樣品中檢出雞源性成分的比例為100%，而取樣量為0.025 g和0.1 g 時(shí)，均有不同程度的漏檢情況，所以本文最終采用0.5 g 的取樣量對(duì)可食用內(nèi)臟摻假樣品進(jìn)行DNA提取。

2.2 摻假樣品DNA 提取方式的優(yōu)化

近年來(lái)實(shí)驗(yàn)室常用的商業(yè)化DNA 提取試劑盒一般有兩種類型，即快速提取法和柱模法提取試劑盒，快速提取試劑盒的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快、效率高，缺點(diǎn)是沒(méi)有去雜質(zhì)步驟，可能會(huì)影響PCR 擴(kuò)增效率，而柱模法增加了深度純化DNA 的步驟，但是提取過(guò)程比較耗時(shí)[31?32]。本文采用兩種提取試劑盒對(duì)7 種動(dòng)物的5 類可食用內(nèi)臟的DNA 提取純化效率進(jìn)行考察，純化效率用A260和A280的比值進(jìn)行判斷判斷，如果比值在1.8～2.0 之間，可以認(rèn)為該DNA 比較純，質(zhì)量較好[33]，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)圖2。

圖2 不同DNA 提取方法對(duì)可食用動(dòng)物內(nèi)臟DNA純度的總體影響統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics on the overall effect of different DNA extraction methods on the purity of DNA from edible visceral

從圖2 的統(tǒng)計(jì)圖中可以看出，柱膜法提取的可食用內(nèi)臟的DNA 的A260/A280比值要比快速提取法高，純度較高，質(zhì)量較好，A260與A280的比值主要集中在1.8～2.0 之間，而快速提取法提取DNA 的A260與A280的比值在1.2～1.6 之間，純度較差，所以本文最終采用柱膜法對(duì)各種動(dòng)物源的可食用內(nèi)臟的DNA進(jìn)行提取凈化。

2.3 COI 基因片段的擴(kuò)增條件優(yōu)化

影響目標(biāo)DNA 片段擴(kuò)增效率關(guān)鍵因素主要包括引物的選擇、擴(kuò)增體系中DNA 模板濃度以及擴(kuò)增程序中的退火溫度[34?35]。DNA 條形碼技術(shù)的關(guān)鍵也是選擇合適的引物，作為通用引物，在同一個(gè)擴(kuò)增體系和條件下，能有效的擴(kuò)增出研究的幾種物種的目標(biāo)DNA 片段。本文選用了三對(duì)通用引物COI-A、COIB 和COI-C（具體引物序列詳見(jiàn)表1），分別對(duì)7 種動(dòng)物源內(nèi)臟進(jìn)行擴(kuò)增效率進(jìn)行考察，三對(duì)引物擴(kuò)增的目標(biāo)片段均是線粒體COI 基因上大小為658 bp 的片段。7 種動(dòng)物的5 類可食用內(nèi)臟DNA 經(jīng)提取純化并擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)QIAxcel 毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)進(jìn)行確認(rèn)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引物COI-B 雖然能非常有效的擴(kuò)增出7 種動(dòng)物的5 類可食用內(nèi)臟的基因片段，但是鵝的5 類內(nèi)臟的擴(kuò)增效率低，相對(duì)于的條帶的熒光值較低；引物COI-C 幾乎對(duì)所有7 種動(dòng)物的5 類內(nèi)臟的擴(kuò)增效率都很低，從條帶的熒光值可以判斷擴(kuò)增失敗；而引物COI-A 能全部高效的擴(kuò)增出658 bp 的目標(biāo)片段，所以本文最終采用COIA 作為可食用內(nèi)臟摻混研究的引物（具體見(jiàn)圖3）。

圖3 7 種動(dòng)物源的可食用內(nèi)臟（肝）DNA 條形碼的PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.3 Electrophoresis images of DNA barcoding fragments amplified by PCR from liver of 7 anmials

選擇了合適的通用引物后，本文繼續(xù)對(duì)擴(kuò)增體系中的DNA 模板量及PCR 擴(kuò)增程序中的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。由于毛細(xì)管凝膠電泳上的毛細(xì)管輸出端配置了光檢測(cè)器，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶在每個(gè)泳道上吸光度（熒光值）會(huì)被檢測(cè)器記錄，并轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的條帶信號(hào)，所以可以利用毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)記錄的各個(gè)產(chǎn)物條帶的熒光值，對(duì)擴(kuò)增效率進(jìn)行量化考察。在一定的擴(kuò)增體系中，DNA 模板的濃度過(guò)高或者過(guò)低，都會(huì)影響擴(kuò)增效率，從而降低PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物濃度，影響檢測(cè)結(jié)果的靈敏度和有效性。本文考察了三個(gè)體積的DNA 模板量，分別為1、2、3 μL，在同樣的擴(kuò)增條件下進(jìn)行擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)后讀取相應(yīng)的目標(biāo)條帶的熒光值（RFU），結(jié)果見(jiàn)圖4。同時(shí)，在PCR 擴(kuò)增程序中，合適的退火溫度是保證擴(kuò)增效率以及產(chǎn)物特異性的關(guān)鍵因素，退火溫度太低，會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，反之則會(huì)大幅度降低擴(kuò)增效率。本文采用50、53 以及57 ℃，3 個(gè)退火溫度分別對(duì)7 種動(dòng)物的5 類內(nèi)臟進(jìn)行擴(kuò)增效率的考察，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)后讀取相應(yīng)的目標(biāo)條帶的熒光值（RFU），結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 DNA 模板量與不同退火溫度對(duì)7 種動(dòng)物源的可食用內(nèi)臟DNA 條形碼的PCR 擴(kuò)增效率的影響Fig.4 Effect of DNA template amount and different annealing temperatures on the PCR amplification efficiency of edible visceral DNA barcodes from seven animal source

從圖4 可以看出，當(dāng)DNA 模板量為1 μL 和3 μL時(shí)，7 種動(dòng)物源的5 類內(nèi)臟的凝膠條帶的熒光值較模板量2 μL 時(shí)小，而熒光值大小與擴(kuò)增效率成正比；選擇退火溫度為53 ℃，7 種動(dòng)物源的5 類內(nèi)臟的凝膠條帶的熒光值最高。所以本文最終選擇DNA 模板量為2 μL、退火溫度為53 ℃的擴(kuò)增條件作為7 種動(dòng)物源的5 類內(nèi)臟DNA 條形碼基因的最佳擴(kuò)增條件。從毛細(xì)管凝膠電泳系統(tǒng)中可以看出，7 種動(dòng)物源的5 類內(nèi)臟在700 bp 左右均有一條較明顯的擴(kuò)增條帶（見(jiàn)圖3）。然后將7 種動(dòng)物源的5 類內(nèi)臟的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生物公司進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 7 種動(dòng)物源內(nèi)臟的DNA 條形碼檢測(cè)結(jié)果Table 2 DNA barcoding results for 7 samples found to contain one species

2.4 可食用動(dòng)物內(nèi)臟摻假模型靈敏度和穩(wěn)定性檢測(cè)

本文根據(jù)常見(jiàn)的可食用動(dòng)物內(nèi)臟的摻假類型，根據(jù)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的高低，對(duì)可能存在的摻假模式進(jìn)行模擬，具體見(jiàn)表3。

表3 可食用內(nèi)臟摻假模型Table 3 Animal viscera adulteration model

本文根據(jù)現(xiàn)有的可食用內(nèi)臟的市場(chǎng)價(jià)格，根據(jù)其價(jià)格與供給量進(jìn)行評(píng)估可食用內(nèi)臟的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，分成高經(jīng)濟(jì)價(jià)值可食用內(nèi)臟和低經(jīng)濟(jì)價(jià)值可食用內(nèi)臟，根據(jù)類型和感官性狀等，建立了19 個(gè)可食用內(nèi)臟摻假模型，對(duì)可食用動(dòng)物內(nèi)臟中有可能摻假的其他動(dòng)物源內(nèi)臟進(jìn)行摻假靈敏度的考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19 個(gè)可食用內(nèi)臟的摻假模型中的摻假成分檢出靈敏度較合理，最低檢出比例均能達(dá)到5%，能滿足日常的檢測(cè)要求。同時(shí)本文對(duì)19 個(gè)摻假模型，分別采用5%、10%、15%三個(gè)摻假比例，進(jìn)行穩(wěn)定性考察。將上述擴(kuò)增產(chǎn)物置?20 ℃進(jìn)行保存，分別在第1、3、7 d 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果保持一致。

2.5 建立基于BLAST+的7 種可食用動(dòng)物內(nèi)臟的DNA條形碼本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)

基本局域連配檢索工具（Basic local alignment search tool,BLAST）是由NCBI 開(kāi)發(fā)的序列查找和比對(duì)工具，BLAST 及其相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)是快速進(jìn)行數(shù)據(jù)查詢匹配的有力工具[36]。目前BLAST 本地化工具（BLAST+）及其數(shù)據(jù)庫(kù)可以通過(guò)自行構(gòu)建的方法脫機(jī)運(yùn)行，即通過(guò)本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行查找，而無(wú)需連接到美國(guó)NCBI 中央數(shù)據(jù)庫(kù)[37]。本文根據(jù)測(cè)定的7 種動(dòng)物源的可食用動(dòng)物內(nèi)臟的COI 基因序列，構(gòu)建了常見(jiàn)的可食用內(nèi)臟摻假的內(nèi)臟DNA 條形碼本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)。將11 種肉的微條形碼片段核酸序列存為單一的FASTA 格式文件viscera07，然后使用BLAST+工具包的makeblastdb 命令（makeblastndb-in.viscera07.fasta-dbtype nucl-parse_seqids-out Viscera），對(duì)上述序列文件進(jìn)行數(shù)據(jù)格式化和索引化，形成可供BLAST檢索的本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)Viscera。

取本文研究的可食用內(nèi)臟的摻假模型、實(shí)際樣品的測(cè)序結(jié)果，使用本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)的blastn 命令將待檢索序列結(jié)果對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，結(jié)果自動(dòng)保存于result.txt 文件。在結(jié)果目錄下打開(kāi)result.txt 文件，根據(jù)比對(duì)得分（Score）情況進(jìn)行結(jié)果分析。

2.6 可食用內(nèi)臟制品檢測(cè)

按照本文建立的方法，對(duì)25 批次可食用內(nèi)臟制品進(jìn)行摻假鑒別，將克隆測(cè)序結(jié)果經(jīng)建立的可食用動(dòng)物內(nèi)臟的DNA 條形碼本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast 比對(duì)分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Table 4 Actual sample test results

本文利用建立的檢測(cè)和分析方法對(duì)25 批次可食用內(nèi)臟制品進(jìn)行摻假鑒別研究，25 批次可食用內(nèi)臟制品包括6 批次的牛百葉（牛胃）、5 批次的鵝肝、4 批次的鵝腸、3 批次的牛肝、2 批次的羊肝、2 批次的牛腸、2 批次的羊肺以及1 批次的牛肺。所有的樣品經(jīng)預(yù)處理、DNA 提取純化擴(kuò)增后，在毛細(xì)管凝膠色譜分析上700 bp 左右的位置均有一條較清晰的條帶。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化后，進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)建立的可食用動(dòng)物內(nèi)臟的DNA 條形碼本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行blast 比對(duì)分析。比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25 批次的可食用內(nèi)臟制品檢出2 批次的豬源性成分和2 批次的鴨源性成分，摻假比例為16%：其中6 批次的牛百葉制品中檢出2 批次的豬源性成分，不合格率為33%；4 批次的鵝腸制品中檢出1 批次的鴨源性成分，不合格率為25%；5 批次的鵝肝制品中檢出1 批次的鴨源性成分，不合格率為20%。為了驗(yàn)證本檢測(cè)方法的可靠性，我們對(duì)上述4 批次的摻假樣品參照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 3309-2018《肉類源性成分鑒定 實(shí)時(shí)熒光定性PCR 法》進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與本方法一致（見(jiàn)表4）。從上述檢測(cè)結(jié)果可以看出，市售可食用內(nèi)臟制品中，牛百葉、鵝腸、鵝肝等三類內(nèi)臟制品比較容易有摻假問(wèn)題，需要重點(diǎn)關(guān)注。

3 結(jié)論

本文建立了基于QIAxcel 毛細(xì)管凝膠電泳分析系統(tǒng)結(jié)合DNA 條形碼技術(shù)對(duì)7 種可食用內(nèi)臟進(jìn)行摻假鑒定，優(yōu)化了樣品前處理、DNA 提取和PCR 擴(kuò)增條件。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序所得的COI 基于序列在建立的可食用動(dòng)物內(nèi)臟的DNA 條形碼本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)Viscera 進(jìn)行BLAST 比對(duì)，進(jìn)行摻假鑒別。本方法檢出靈敏度較合適，適合正常的可食用內(nèi)臟摻假鑒別，又不會(huì)出現(xiàn)誤判。傳統(tǒng)的基于DAN 分析的鑒定技術(shù)一般使用特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，方法的通用性不強(qiáng)，摻假篩選能力一般；而DNA 條形碼技術(shù)采用通用型引物，可以一次性檢測(cè)可食用動(dòng)物內(nèi)臟中的7 種動(dòng)物源成分，效率高，通用性強(qiáng)。但是本方法也存在一定的缺點(diǎn)，比如DNA 條形碼擴(kuò)增產(chǎn)物的后續(xù)分析和確認(rèn)需要較昂貴的設(shè)備和需要較專業(yè)的技術(shù)人員，且克隆測(cè)序的時(shí)間較長(zhǎng)，所以今后在動(dòng)物源成分的摻假鑒定技術(shù)研究方向，亟需開(kāi)發(fā)一種耗時(shí)短、效率高、特異性強(qiáng)的DNA 條形碼擴(kuò)增產(chǎn)物確認(rèn)技術(shù)手段。