劉 玲

（張家川回族自治縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅天水 741500）

近年來(lái)，我國(guó)食品中毒事件頻頻發(fā)生，食品安全備受關(guān)注，微生物污染是食品中毒的原因之一。為了能夠減少食源性疾病的發(fā)生，我國(guó)進(jìn)一步加強(qiáng)了食品安全管理，并在實(shí)際工作中采用食品微生物檢驗(yàn)方法進(jìn)行食品安全監(jiān)測(cè)?！稒z測(cè)和校準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室能力認(rèn)可準(zhǔn)則在微生物檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō)明》（CNASCL01-A025:2022）明確規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室必須存有滿足試驗(yàn)要求的標(biāo)準(zhǔn)菌種，且需從人、機(jī)、料、法、環(huán)等方面進(jìn)行菌種的質(zhì)量管理，以保證微生物檢驗(yàn)工作的質(zhì)量和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由此可見(jiàn)，有必要對(duì)食品微生物檢驗(yàn)菌種進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化管理[1-2]。

1 標(biāo)準(zhǔn)菌種的特性

CNAS-CL01-A025:2022明確規(guī)定，實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)用的菌種必須從認(rèn)可的菌種或標(biāo)本收集途徑獲得，以保證菌種來(lái)源的可靠性。因此，溯源性是標(biāo)準(zhǔn)菌種的特性。為保證其特性，菌種的獲得須從國(guó)際認(rèn)可或國(guó)家設(shè)立的菌種保藏機(jī)構(gòu)中購(gòu)買或索取，不得使用無(wú)資質(zhì)機(jī)構(gòu)提供的無(wú)證菌種，且持證的菌種不可隨意贈(zèng)送、轉(zhuǎn)讓，必須按規(guī)定進(jìn)行。

2 標(biāo)準(zhǔn)菌種的標(biāo)準(zhǔn)化管理

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株的選擇及采購(gòu)

標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)從專業(yè)微生物菌株保藏機(jī)構(gòu)或有合格資質(zhì)的供應(yīng)商中購(gòu)買獲得，如美國(guó)菌株保藏中心、中國(guó)醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心、工業(yè)微生物菌種保藏管理中心等。標(biāo)準(zhǔn)菌株的采購(gòu)應(yīng)參照《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》（GB 4789.2—2022）的規(guī)定選擇，優(yōu)先選擇形態(tài)、染色、生理生化等特性穩(wěn)定且實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好、不會(huì)發(fā)生變異的菌種。在確定菌株后，還需核對(duì)菌種編號(hào)等信息。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株的驗(yàn)收、復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代、使用及銷毀

2.2.1 驗(yàn)收

在標(biāo)準(zhǔn)菌株入庫(kù)環(huán)節(jié)，應(yīng)著重檢查其包裝完整與否、是否臨近保質(zhì)期等，還需對(duì)其是否滿足冷凍運(yùn)送的條件進(jìn)行確認(rèn)，若滿足條件，則進(jìn)行入庫(kù)備案，并記錄接收菌種的時(shí)間、菌種名稱、菌種產(chǎn)地、菌種編號(hào)以及接收實(shí)驗(yàn)室名稱等信息，執(zhí)行雙檔案制，即紙質(zhì)檔案和電子檔案同時(shí)記錄[3]。

2.2.2 復(fù)蘇

菌種復(fù)蘇是菌種保藏的首要環(huán)節(jié)。在菌種復(fù)蘇時(shí)，須嚴(yán)格按照菌種說(shuō)明書要求進(jìn)行，確保菌種及時(shí)恢復(fù)其旺盛的生命活力。

2.2.3 確認(rèn)

待菌種復(fù)蘇后，需對(duì)儲(chǔ)備菌株進(jìn)行必要的純化試驗(yàn)及生化鑒定試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株指標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)過(guò)復(fù)活且能在適宜的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌株，已經(jīng)解凍的標(biāo)準(zhǔn)菌種不可繼續(xù)使用，也不能繼續(xù)凍結(jié)，應(yīng)及時(shí)記錄，以保證菌種使用及保藏的溯源性。此外，工作菌株不可作為標(biāo)準(zhǔn)菌種進(jìn)行試驗(yàn)，工作菌株指使用標(biāo)準(zhǔn)菌株法的商業(yè)派生菌株[4]。在對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株進(jìn)行純化試驗(yàn)及生化鑒定試驗(yàn)的過(guò)程中，需及時(shí)記錄菌種的名稱、變化、驗(yàn)證依據(jù)、鑒定人員和試驗(yàn)結(jié)果等信息，只有鑒定結(jié)果符合條件要求的菌種，才可進(jìn)行保存和傳代。

2.2.4 傳代

對(duì)于菌株的傳代，除非標(biāo)準(zhǔn)方法中有特殊的規(guī)定與要求，具有能證明菌株特征未發(fā)生變化的文件依據(jù)，否則菌株的傳代次數(shù)不可超過(guò)5次，避免過(guò)度傳代使菌種發(fā)生變異。還應(yīng)定期對(duì)菌株進(jìn)行傳代，并對(duì)菌種試驗(yàn)所需的存活度、純度等關(guān)鍵指標(biāo)進(jìn)行確認(rèn)。

2.2.5 使用和銷毀

標(biāo)準(zhǔn)菌種做參照標(biāo)本時(shí)，需領(lǐng)取標(biāo)準(zhǔn)菌種，并填寫領(lǐng)用登記表，填寫內(nèi)容包括菌種名稱、編號(hào)、使用日期、用途、使用人員和管理人員簽字，經(jīng)過(guò)菌種管理人員批準(zhǔn)方可領(lǐng)取使用。針對(duì)有突變、污染、衰退的菌種，經(jīng)過(guò)鑒定確認(rèn)不合格或沒(méi)有使用需求，應(yīng)及時(shí)銷毀菌種，并記錄銷毀菌種的名稱、編碼、銷毀日期和銷毀方法等信息。為避免造成檢測(cè)環(huán)境及設(shè)施設(shè)備的污染，有必要建立完善的菌種銷毀管理制度。只有符合國(guó)家環(huán)保標(biāo)準(zhǔn)及衛(wèi)生安全規(guī)范的菌種，才可作為污染廢棄物棄置。

2.3 菌株的保藏

2.3.1 原則

①不同菌種的生物學(xué)特征有所差異，需要針對(duì)性選擇適宜的保藏方法。②要盡可能地避免雜菌對(duì)菌種保藏過(guò)程的影響，最大限度地保護(hù)菌種不會(huì)衰退和消亡。③注意菌種的安全保存，避免其對(duì)周圍環(huán)境及設(shè)施設(shè)備造成污染和破壞。④嚴(yán)格按照國(guó)家生物安全要求進(jìn)行菌種保藏管理，并在劃分微生物菌種危險(xiǎn)級(jí)別及安全等級(jí)的基礎(chǔ)上，嚴(yán)格按照對(duì)應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室條件進(jìn)行操作，做好個(gè)人安全防護(hù)和環(huán)境保護(hù)工作。

2.3.2 方法

（1）多孔磁珠低溫保藏法。對(duì)于有長(zhǎng)期保護(hù)要求的細(xì)菌、真菌、放線菌等，可選用多孔磁珠低溫保藏法進(jìn)行保藏。該方法以低溫的環(huán)境短暫停止菌種的新陳代謝，以此實(shí)現(xiàn)菌種的保藏。因此，冷凍溫度越低，保藏效果越好。在使用該方法進(jìn)行菌種保藏時(shí)，需注意幾點(diǎn)要求。①注意對(duì)冷凍存管進(jìn)行無(wú)菌操作，保證菌種能長(zhǎng)時(shí)間保存。②須在生物安全箱中完成菌種的儲(chǔ)存和復(fù)蘇等作業(yè)。③使用過(guò)的冷凍存管必須進(jìn)行處理，避免環(huán)境遭受污染。④在冷藏保藏過(guò)程中，要注意控制冷藏及解凍的速度，通常有效的凍結(jié)速度在1 ℃·min-1以內(nèi)，有效的解凍速度為1 min從-70 ℃解凍至-20 ℃。⑤低溫槽具有一定的空間，若發(fā)現(xiàn)溫度有變，可適當(dāng)在低溫槽中加入干冰，保證冷凍效果。⑥倘若菌種解凍后無(wú)法繼續(xù)使用，則需中心接種后再使用和保存。多孔磁珠低溫保藏法具體應(yīng)用流程如下。①菌種保護(hù)管的選擇?？蛇x擇商品化保護(hù)管，且避免保護(hù)管有裂縫。②培養(yǎng)物準(zhǔn)備。優(yōu)先選擇具有較高生物活力的培養(yǎng)物。不同菌種的生理生化特征不同，存活率也有所不同。在準(zhǔn)備培養(yǎng)物時(shí)，可以刮取斜面上的菌種，并放入磁珠冷凍管中保存。有嚴(yán)格保存要求的厭氧菌，通常一個(gè)冷凍管中要刮取4～5個(gè)斜面板上的細(xì)菌。在準(zhǔn)備培養(yǎng)物時(shí)，還可以接種液態(tài)培養(yǎng)基，將管內(nèi)除磁珠外的全部物質(zhì)吸干，通過(guò)振蕩產(chǎn)生菌懸液，以液態(tài)的形式存在于培養(yǎng)基中。③使用磁珠凍存管。標(biāo)記凍存管，記錄菌種名稱、編號(hào)、實(shí)驗(yàn)室名稱和轉(zhuǎn)移時(shí)間。菌種培育需在適宜的環(huán)境下進(jìn)行，直到菌種穩(wěn)定或是到達(dá)成熟期，須進(jìn)行純度等生化測(cè)試，確認(rèn)培育的菌株符合要求后才可進(jìn)入凍存管中保藏。④保藏周期。在-30～-70 ℃進(jìn)行凍存管的儲(chǔ)存，-30 ℃的儲(chǔ)存時(shí)間是1～5年，-70 ℃可適當(dāng)延長(zhǎng)保藏的時(shí)間或者常年保藏。如果定期檢驗(yàn)確認(rèn)菌種不能滿足其生物學(xué)功能，則需要及時(shí)銷毀或補(bǔ)充儲(chǔ)存。⑤培養(yǎng)恢復(fù)。待對(duì)工作環(huán)境無(wú)菌化處理后，打開(kāi)凍存管，用無(wú)菌針取出1粒磁珠，及時(shí)封管并送至適宜溫度環(huán)境下進(jìn)行儲(chǔ)存，凍存管運(yùn)送期間應(yīng)使用專門的保溫運(yùn)輸設(shè)備[5]。

（2）定期移植保藏法。定期移植保藏法適用于有長(zhǎng)時(shí)間保藏要求的菌種，不同菌株需結(jié)合實(shí)際選擇適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行培育。該方法通過(guò)適宜的環(huán)境溫度減慢菌株的新陳代謝過(guò)程，使其生產(chǎn)速率減慢，既能減少突變，又能延長(zhǎng)菌株的保藏期。在應(yīng)用定期移植保藏法時(shí)，可選擇不同的細(xì)菌注射方法，如斜面注射、液體接種、穿刺注射等。在使用該方法進(jìn)行菌種保藏時(shí)，應(yīng)明確幾點(diǎn)要求。①在恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中接種，避免人為及環(huán)境的污染。②在保藏期間，需定期進(jìn)行室溫與濕度的檢查，尤其要檢查菌種儲(chǔ)藏的房間及冷庫(kù)，避免培養(yǎng)基干燥，若發(fā)現(xiàn)室溫和濕度有異常，需要考慮移栽培育。③在菌株傳代時(shí)，為保留菌株的優(yōu)良特征，應(yīng)在養(yǎng)分充足的培養(yǎng)基中栽培。④每一次的移植培養(yǎng)都需要逐一檢驗(yàn)比較保藏菌種及其分解卡片，確認(rèn)無(wú)誤后存放。⑤針對(duì)不能頻繁移植保藏的菌株，可加大每次移植的數(shù)量，以延長(zhǎng)使用期。⑥菌株數(shù)量越多，意味著移植的隔離期限有較大的差異。一般不形成芽胞的細(xì)菌的持續(xù)時(shí)間是1～2周，最長(zhǎng)1個(gè)月左右。但某些菌株一般需要2個(gè)月左右才能完成移植。酵母、放線菌等連續(xù)生長(zhǎng)的菌種的間隔時(shí)間較長(zhǎng)，一般在5個(gè)月以內(nèi)完成移植。

（3）斜面低溫保藏法。斜面低溫保藏法通常用于工作用菌種的保藏。具體操作流程為在固體斜面培養(yǎng)基中完成菌種的接種工作，待菌種生長(zhǎng)穩(wěn)定或成熟后，再將其移至2～8 ℃冰箱中進(jìn)行保藏。斜面低溫保藏方法具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求簡(jiǎn)單、菌種存活率高等優(yōu)勢(shì)，適應(yīng)大部分菌種的短期保藏，但不適宜菌種的長(zhǎng)期保藏，主要因?yàn)樵?～8 ℃的環(huán)境保藏，菌種具有一定的代謝能力，會(huì)降低菌種活性，需要反復(fù)多次的傳代培養(yǎng)，可能會(huì)發(fā)生變異或污染。

（4）脫脂牛奶保藏法。脫脂牛奶保藏法適用于菌種的中長(zhǎng)期保藏。其應(yīng)用的主要流程是先將新鮮純培養(yǎng)物接種至滅菌處理的脫脂牛奶中，充分混勻后形成濃菌液，分裝在無(wú)菌保藏管中保藏。一般在-20 ℃的環(huán)境下，保藏時(shí)間3年以上。脫脂牛奶保藏法的優(yōu)勢(shì)是操作簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、不需要特殊設(shè)備且不需要反復(fù)傳代，有良好的保存效果。

（5）液體石蠟保藏法。液體石蠟保藏法在改良斜面低溫保藏法的基礎(chǔ)上進(jìn)行菌種的保藏，用液體石蠟覆蓋固體斜面或穿刺培養(yǎng)的半固體高層培養(yǎng)基，以此營(yíng)造無(wú)氧環(huán)境，使菌種在無(wú)氧的環(huán)境下生長(zhǎng)，可避免培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，進(jìn)而延長(zhǎng)菌種保藏的時(shí)間。在應(yīng)用該方法時(shí)，需要對(duì)液體石蠟進(jìn)行滅菌處理，之后再滴至培養(yǎng)基表面，應(yīng)保證石蠟厚度高出菌種表面約1 cm，使菌體與空氣隔離。在4 ℃的環(huán)境下，保持試管直立，進(jìn)行保藏，保藏時(shí)間1～2年，甚至更長(zhǎng)。該保藏方法的優(yōu)勢(shì)是能夠有效彌補(bǔ)斜面低溫保藏法的不足，延長(zhǎng)菌種保持的時(shí)間，因此適用中長(zhǎng)期保藏。這一方法也適用于無(wú)法分解液體石蠟的大部分菌種，但并不意味液體石蠟保藏法沒(méi)有缺陷，該法需要保持試管始終處于直立的狀態(tài)，所需空間大，攜帶不便。

（6）甘油冷凍管保藏法。甘油冷凍管保藏法適用于菌種的中長(zhǎng)期保藏。在生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)板上刮取新鮮純培養(yǎng)物，接種至適宜的培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)菌的密度OD600為1.0～1.5時(shí)，在菌懸浮液中加入相同體積濃度為20%的無(wú)菌甘油，輕輕振蕩混勻，分裝至無(wú)菌小試管中。試管冷凍儲(chǔ)存溫度為-20～-80 ℃。在-20 ℃冷凍條件下，可保藏1～2年；在-80 ℃的冷凍條件下，可保藏2～4年，溫度越低，保藏的時(shí)間越長(zhǎng)。這一保藏方法的優(yōu)勢(shì)是適用范圍廣，有良好的保藏效果，尤其是鏈球菌、弧菌等苛性菌，保藏時(shí)間長(zhǎng)，菌種變異的可能性低。

2.4 人員管理要求

菌種管理要有專人負(fù)責(zé)，包括菌種的申購(gòu)、驗(yàn)收、復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代和保藏等各個(gè)環(huán)節(jié)。菌種管理人員要有強(qiáng)烈的崗位責(zé)任意識(shí)，嚴(yán)格按照微生物檢驗(yàn)操作流程及要求進(jìn)行菌種管理工作，要具有扎實(shí)的菌種基礎(chǔ)知識(shí)及工作經(jīng)驗(yàn)，熟練掌握各種菌種復(fù)蘇、傳代、保藏的條件。對(duì)于菌種的采購(gòu)，菌種管理人員必須要從有資質(zhì)的機(jī)構(gòu)中購(gòu)買，并在驗(yàn)收環(huán)節(jié)針對(duì)每一種菌種的質(zhì)量及檢驗(yàn)報(bào)告進(jìn)行檢查，檢查過(guò)程除了外觀檢查，還有純度與特性的確認(rèn)。

2.5 環(huán)境管理要求及生物安全

為保證菌種能長(zhǎng)期有效的保存，加強(qiáng)環(huán)境管理非常重要。應(yīng)保證微生物在低溫環(huán)境下存放，低溫環(huán)境可降低其生長(zhǎng)速度。通常實(shí)驗(yàn)所用的工作菌種宜在2～8 ℃的環(huán)境中保藏，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株需要在-20～-80 ℃的低溫環(huán)境中保藏。

在實(shí)際的菌種管理過(guò)程中，嚴(yán)格執(zhí)行《病原微生物生物安全通用要求》《微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程》《人間傳染的病原微生物名錄》等規(guī)范的要求，保證實(shí)驗(yàn)過(guò)程為無(wú)菌化操作過(guò)程，要重視個(gè)人防護(hù)及環(huán)境保護(hù)，避免發(fā)生污染。

2.6 設(shè)備管理要求

在菌株保藏管理過(guò)程中，要保證實(shí)驗(yàn)室具有相應(yīng)的設(shè)備，包括低溫或超低溫冰箱、冷凍干燥機(jī)等。實(shí)施“雙人雙鎖”管理機(jī)制管理菌種，加強(qiáng)設(shè)備監(jiān)控，定期檢查和維護(hù)設(shè)備，及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常，及時(shí)維修。

3 結(jié)論

本文對(duì)食品微生物檢驗(yàn)菌種的標(biāo)準(zhǔn)化管理進(jìn)行了分析探討，得出以下結(jié)論。①菌種管理必須要結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行，要制定完善的管理機(jī)制并嚴(yán)格執(zhí)行。②應(yīng)從人、機(jī)、料、法、環(huán)等維度開(kāi)展菌種管理工作，并保證實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性，避免發(fā)生污染，保證菌種的可靠性和溯源性。③菌種的保藏需合理選擇保藏方法，要充分考慮菌種自身的特性、保藏目的以及實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備條件。一般至少要選擇兩種保藏方法，且需對(duì)復(fù)蘇菌種的關(guān)鍵性指標(biāo)定期檢驗(yàn)，確保菌種的活性與特性。