吳鄒平，李鮮慧，黃秋琪，吉訓(xùn)超

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405

2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第八臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 佛山 528051

3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

川崎?。↘D）又稱為皮膚黏膜淋巴結(jié)綜合征（MCLS），主要發(fā)生于5 歲以下兒童及嬰幼兒，在我國發(fā)病率有不斷上升的趨勢[1-2]，以全身中、小動脈血管炎性病變?yōu)樘卣鳎衫奂肮跔顒用}引起嚴重并發(fā)癥。過敏性紫癜（HSP）臨床以出血性皮疹為主要表現(xiàn)，可伴有關(guān)節(jié)炎、腹痛、血尿及蛋白尿等，是兒童時期最常發(fā)生血管炎性疾病[3]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是以免疫炎癥及多系統(tǒng)受累為主要特征的結(jié)締組織病，兒童SLE 較成人SLE 病情重，病程長，預(yù)后相對更差[4]。這3 種疾病均屬于兒童結(jié)締組織病范疇，發(fā)病機制尚不清楚，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)目前仍缺乏理想的治療藥物。

“異病同治”為中醫(yī)治療疾病的重要法則之一，具有重要的臨床實踐指導(dǎo)意義。雖然KD、HSP、SLE 分別屬于3 種不同疾病，但其中醫(yī)病因病機方面卻有著相似之處。清瘟敗毒飲出自《疫疹一得》，由清代醫(yī)家余霖所創(chuàng)，方由白虎湯、犀角地黃湯和黃連解毒湯三方加減而成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，清瘟敗毒飲具有解熱、降低血液黏稠度、抗血小板聚集、抗菌、抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[5]。臨床上有研究表明清瘟敗毒飲在治療KD、HSP、SLE 同樣具有較好的療效[6-10]。中醫(yī)藥在疾病治療上有多成分、多靶點、多通路協(xié)同的特點，在許多疾病治療，尤其在“異病同治”方面中存在明顯的優(yōu)勢。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，探討清瘟敗毒飲在治療KD、HSP、SLE 的共同作用機制，為后續(xù)臨床運用及實驗研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 清瘟敗毒飲藥物有效成分及靶點獲取運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP），搜索黃連、梔子、桔梗、黃芩、知母、赤芍、玄參、連翹、甘草、牡丹皮有效成分和藥物靶點，設(shè)置生物利用度≥30%、類藥性≥0.18 為篩選條件[11]。對TCMSP 平臺上查詢不到的石膏、生地黃、水牛角、竹葉等藥物，通過檢索中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM）及查閱相關(guān)文獻等方式獲得藥物成分相關(guān)化學(xué)信息，并將結(jié)果導(dǎo)入PubChem[12]。將獲得的結(jié)構(gòu)信息輸入SwissADEM 平臺，將胃腸道吸收設(shè)置為“High”，類藥性5 項中（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）滿足2 項及以上[13]的化合物納入研究。另外，通過對已發(fā)表的相關(guān)中藥有效成分文獻檢索，對中藥活性成分做進一步補充。將獲取的重要活性成分輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索對應(yīng)靶點信息，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫[14]對靶點蛋白基因名稱進行規(guī)范。

1.2 疾病靶點、藥物-疾病交集靶點篩選與獲取在 Gencards、 OMIM 數(shù)據(jù)庫分別以“Kawasaki Disease、 Mucocutaneous Lymph Node Syndrome”“Henoch-Sch?nleinPurpura、Henoch-Schonleinpurpura、IgA vasculitis、Anaphylactoid Purpura”“systemic lupus erythematosus”為關(guān)鍵詞檢索獲取有關(guān)KD、HSP、SLE 相關(guān)疾病靶點。通過Venn 2.1 在線分析軟件對獲取的清瘟敗毒飲藥物有效成分作用靶點與3 種疾病相關(guān)作用靶點取交集。

1.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）分析對于了解疾病等特殊生理病理狀態(tài)下生物信號、能量物質(zhì)代謝的反應(yīng)機制及了解蛋白之間的功能聯(lián)系具有重要意義。將1.2 獲取的藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫進行PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，物種選項為“Homo sapiens”，選擇高置信度（0.700），繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape v3.9.1[15]軟件中，利用Cytoscape 軟件中CytoHubba 插件篩選出核心作用靶點。

1.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析將藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中進行基因本體功能富集（GO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，以P＜0.05 表明差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，通過R4.2.1 中clusterProfiler 包對數(shù)據(jù)進行整理，并運用ggplot2 包對結(jié)果可視化。

1.5 成分-靶點-通路-藥物網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將清瘟敗毒飲藥物活性成分、藥物-疾病交集靶點蛋白以及KEGG 富集通路運用Cytoscape v3.9.1 軟件構(gòu)建“藥物-有效成分-靶點-通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。通過Network Analyzer 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，根據(jù)拓撲學(xué)參數(shù)判斷清瘟敗毒飲治療KD、HSP、SLE 主要有效成分，以備后續(xù)進一步分析。

1.6 分子對接為了評估藥物有效成分與目標靶點的親和力，選取PPI 網(wǎng)絡(luò)中篩選得到的核心靶點蛋白為受體，通過PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲得受體蛋白3D 結(jié)構(gòu)；將藥物有效成分作為配體，運用蛋白-配體對接軟件AutoDock v1.5.7[16]進行分子對接。根據(jù)對接后配體-受體最低結(jié)合能繪制熱圖，當結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol 時，提示二者之間能夠較好地結(jié)合；當結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol 時，則配體和受體具有強烈的結(jié)合性[17]。將對接結(jié)果導(dǎo)入PyMol v3.7.9 軟件進行三維成像可視化。

2 結(jié)果

2.1 清瘟敗毒飲藥物有效成分及靶點綜合相關(guān)數(shù)據(jù)庫和文獻篩選數(shù)據(jù)，共收集清瘟敗毒飲藥物有效成分共195 種，其中赤芍13 種，甘草88 種，黃連11 種，黃芩31 種，桔梗4 種，連翹17 種，牡丹皮6 種，生地黃17 種，生石膏2 種，水牛角3 種，玄參5 種，知母11 種，梔子10 種，竹葉9 種，其中有32 種為藥物之間共同有效成分。運用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對有效成分靶點預(yù)測，并通過UniProt 數(shù)據(jù)庫對靶點蛋白基因名稱進行規(guī)范，刪除重復(fù)項后，共得到167 個預(yù)測靶點。

2.2 疾病靶點、藥物-疾病交集靶點篩選與獲取見圖1。通過對KD、HSP、SLE 相關(guān)疾病靶點進行檢索去重后，共得到KD 疾病靶點3 536 個，HSP 疾病靶點1 402 個，SLE 疾病靶點5 128 個，運用Venn 2.1 在線分析軟件對藥物和疾病交集靶點映射，最終獲得清瘟敗毒飲治療KD、HSP、SLE 的潛在靶點38 個，占比0.5%。

圖1 清瘟敗毒飲治療KD、HSP、SLE 交集靶點Venn 圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選見圖2。將清瘟敗毒飲治療KD、HSP、SLE 的38 個交集基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，該網(wǎng)絡(luò)包含38 節(jié)點，686 條邊，如圖2A。利用Cytoscape v3.9.1 軟件中CytoHubba 插件篩選出核心蛋白，設(shè)置Calculate值為Top10，運用Degree 算法得出前10 位相關(guān)度最高的潛在核心蛋白靶點，見圖2B，推測白細胞介素-6（IL-6）、血管內(nèi)皮細胞生長因子A（VEGFA）等為清瘟敗毒飲治療KD、HSP、SLE 的潛在核心作用靶點。

圖2 靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析結(jié)果見圖3。將篩選出的38 個交集靶點通過R4.2.1進行GO 和KEGG 富集分析，根據(jù)P值大小倒序排列。通過GO 分析得到生物過程（BP）1 512 條，細胞組分（CC）52 條，分子功能（MF）113 條，見圖3A，其中包括了多脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物（transcription regulator complex）、轉(zhuǎn)錄輔調(diào)控因子結(jié)合（transcription coregulator binding）等。通過KEGG 富集分析共到相關(guān)信號通路123 條，具體結(jié)果參數(shù)見表1。對P值前20 的通路，使用R語言ggplot2 包對結(jié)果可視化（圖3B），這些潛在的信號通路在清瘟敗毒飲異病同治的過程中具有顯著作用。

圖3 GO 分析柱狀圖及KEGG 富集分析

2.5 藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建見圖4。運用Cytoscape v3.9.1 軟件構(gòu)建“藥物-成分-靶點-通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，此網(wǎng)絡(luò)由499 個節(jié)點和2 365 條邊構(gòu)成。通過Network Analyzer 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析得到Degree 值排名前6 位的核心藥物有效成分主要為槲皮素（Quercetin）、 芹黃素（Apigenin）、 山柰酚（Kaempferol）、木犀草素（Luteolin）、β-谷甾醇（Beta-sitosterol）、漢黃芩素（Wogonin）。網(wǎng)絡(luò)圖顯示脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路（Lipid and atherosclerosis）為清瘟敗毒飲治療KD、HSP、SLE 過程中最重要的通路，因此，可認為清瘟敗毒飲最有可能由此通路對這3 種疾病產(chǎn)生潛在的治療作用。

圖4 清瘟敗毒飲治療KD、HSP、SLE 藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接見圖5。為探究清瘟敗毒飲干預(yù)KD、HSP、SLE 關(guān)鍵分子學(xué)機制，將“藥物-成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)中Degree 值最高的前6 的有效成分作為配體，PPI 網(wǎng)絡(luò)中的10 個核心靶點蛋白作為靶點蛋白受體。運用蛋白-配體對接軟件AutoDock v1.5.7 獲得配體與受體之間相互作用的結(jié)合能，結(jié)合能越小，則結(jié)合越穩(wěn)定，繪制結(jié)合能熱圖，見圖5A，其中橫坐標代表靶點蛋白，縱坐標代表清瘟敗毒飲有效成分。結(jié)果顯示，篩選的6 個有效成分與10 個核心靶點之間最低結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol 的占85%，結(jié)合活性較好，其中β-谷甾醇與過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）的結(jié)合活性最強。選取對接分數(shù)最小的前3 組組合結(jié)果導(dǎo)入PyMol v3.7.9 軟件進行三維成像可視化，見圖5B。圖中綠色為有效成分，淡藍色為蛋白，紫色為氨基酸殘基部分，黃色虛線為氫鍵，并標注距離。

圖5 分子對接圖

3 討論

“異病同治”作為中醫(yī)治療的特色之一，其核心思想強調(diào)了“證同治同”，表明中醫(yī)學(xué)中的“證”是一種多系統(tǒng)、多靶點、多層次的病理生理改變[18]。KD 屬于中醫(yī)學(xué)溫病范疇，中醫(yī)學(xué)認為本病是由于感受溫?zé)岫拘?，初犯肺衛(wèi)，后熱毒邪氣入里，侵犯營血，充斥內(nèi)外，熱毒迫血妄行，可導(dǎo)致發(fā)斑、冠狀動脈病變等臨床癥狀。HSP 屬于中醫(yī)學(xué)血證的范疇，外感風(fēng)熱邪毒而發(fā)病，熱毒入血，迫血妄行，離經(jīng)之血致皮膚出現(xiàn)紫癜。SLE 中醫(yī)稱之為“陰陽毒”，在SLE 疾病活動期，多由于邪熱壅盛，熱灼營陰導(dǎo)致。這3 種疾病雖病癥不同，然病機無異，均屬于熱毒深重，氣血兩燔之病癥，予清瘟敗毒飲清熱涼血、解毒化斑，體現(xiàn)中醫(yī)“異病同治”理論思想。

本研究利用TCMSP、ETCM、Pubchem 數(shù)據(jù)庫分別獲得清瘟敗毒飲中藥有效成分及對應(yīng)靶點，通過GeneCards、OMIM 數(shù)據(jù)庫獲得KD、HSP、SLE 疾病靶點，基于Venn 圖共獲得38 個交集靶點。利用Cytoscape 軟件及PPI 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析提示IL-6、VEGFA、PPARG 等是清瘟敗毒飲治療的主要靶點蛋白。IL-6是一種多效性細胞因子，由多種細胞產(chǎn)生，可作用于多種組織，能夠參與對免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)。在KD 急性期由單核巨噬細胞活化時可產(chǎn)生IL-6[19]，其與疾病過程中血管壁損傷、冠狀動脈病變以及靜脈注射免疫球蛋白非敏感型KD 的產(chǎn)生密切相關(guān)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，過敏性紫癜性腎炎（HSPN）多由Th2 淋巴細胞分泌的IL-6 刺激引發(fā)，各種誘發(fā)因素導(dǎo)致患者體內(nèi)產(chǎn)生過量的IL-6，刺激T 細胞增殖、活化及腎小球系膜增生，使腎小球纖維化且大量IgA、IgE 沉積在腎小球系膜上導(dǎo)致腎炎[21]。一項關(guān)于SLE 患者的促炎癥細胞因子研究發(fā)現(xiàn)高水平IL-6 可促進SLE 患者關(guān)節(jié)炎進展和關(guān)節(jié)變形[22]。IL-6 在不同階段影響KD、HSP、SLE 的發(fā)生、發(fā)展及愈合，而清瘟敗毒飲可有效降低患者IL-6 的水平，控制機體炎癥因子的產(chǎn)生。VEGFA 是血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）家族中含量最豐富、最具特征性的成員。VEGFA 對血管形成、內(nèi)皮細胞生長有顯著刺激作用，可促進產(chǎn)生結(jié)構(gòu)不完整的新生血管，增加血管通透性。有研究證實，在KD 的急性期和亞急性期都存在高水平的VEGF 的表達，且患者血管組織發(fā)生病理改變，進一步出現(xiàn)血管動態(tài)平衡失調(diào)和冠脈病變的發(fā)生[23-24]。傅卓等[25]通過對HSP、HPSN、健康兒童的VEGF 進行檢測，發(fā)現(xiàn)VEGF 參與了HSP 血管炎的發(fā)生過程，且與腎臟損害程度密切相關(guān)。PPAR是一種參與抗炎反應(yīng)和脂肪生成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[26]，有前瞻性研究表明KD 患者急性期、亞急性期和恢復(fù)期的PPARG 基因表達均明顯高于健康兒童，認為PPARG 因其抗炎作用可能是KD 的保護因素，并且其表達水平可有效預(yù)測KD 冠脈病變的預(yù)后[27]。由于動脈粥樣硬化導(dǎo)致心血管疾病是SLE 患者最常見的死亡原因之一，目前尚無有效的預(yù)防措施[28]。在動物模型中，PPARG 激動劑吡格列酮能夠改善血管損傷及內(nèi)皮功能障礙[29]。進一步的臨床試驗Hasni S 等[30]也發(fā)現(xiàn)吡格列酮能夠顯著改善SLE 患者的血管僵硬程度和心臟代謝參數(shù)，有希望成為SLE 臨床治療藥物。清瘟敗毒飲主要通過上述3 個主要靶蛋白發(fā)揮治療作用，期待能進一步完善相關(guān)基礎(chǔ)研究，為KD、HSP、SLE 疾病提供新的治療思路。

在KEGG 富集分析中，脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路為富集基因最多的關(guān)鍵信號通路。脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路主要功能包括促炎癥反應(yīng)、炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖、損傷和凋亡過程，該通路主要涉及磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白酶B（PI3K-AKT）、腫瘤壞死因子（TNF）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和絲裂原活化蛋白激酶1/3（ERK）通路[31]。研究證實通過激活PI3K-AKT 信號通路能夠使TNF 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞炎癥反應(yīng)減輕，從而保護KD 患者冠狀動脈內(nèi)皮細胞[32]。JNK 具有促進血管炎癥的作用，持續(xù)的JNK通路激活會導(dǎo)致長期的慢性炎癥，通過上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶活性、細胞外基質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致KD 動脈瘤發(fā)生。因此JNK 可能成為KD 動脈瘤高危患者的新的治療靶點[33]，值得進一步探索研究。HSPN 活動期導(dǎo)致腎臟足細胞凋亡從而檢測到患者尿液中存在大量足細胞，而研究證實激活PI3K-AKT 信號通路可減少足細胞的凋亡，促進腎臟維持足細胞完整的結(jié)構(gòu)和功能[34-35]。SLE 患者AKT 表達和磷酸化水平高于健康者提供的CD4+T 細胞則提示PI3K-AKT 信號通路活性上調(diào)[36]。此外，Molad Y 等[37]首次證實了ERK 和JNK 活性與人類SLE 疾病的活性呈正相關(guān)，若在疾病發(fā)展和活動期及時使用ERK 和（或）JNK 抑制劑可能對SLE 患者的治療有益。

根據(jù)藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的結(jié)果分析，清瘟敗毒飲中重要的有效成分包括槲皮素、芹黃素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、漢黃芩素等，在對KD、HSP、SLE“異病同治”中發(fā)揮著重要的潛在作用。如槲皮素是一種天然黃酮類，具有包括抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護等作用，已有研究表明槲皮素可能是KD、HSP、SLE 等炎癥性疾病的潛在治療候選藥物[38-40]。芹黃素生物學(xué)效應(yīng)主要是調(diào)節(jié)細胞周期、提高解毒酶效力、誘導(dǎo)細胞凋亡。樂純琰等[41]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)論證了芹黃素能夠通過調(diào)控ALB、HSP90AA1、ESR1 等關(guān)鍵靶點，利用雌激素、NF-κB等信號通路的調(diào)控達到治療SLE 的目的，為之后的實驗研究奠定了理論基礎(chǔ)。分子對接結(jié)果顯示，槲皮素、芹黃素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、漢黃芩素與疾病主要靶點PPARG、CASP3、NFKBIA、MYC、IL-6 的結(jié)合活性強，在今后的基礎(chǔ)試驗中可探究這些化合物對KD、HSP、SLE 的作用機制，為臨床治療提供思路。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，對清瘟敗毒飲“異病同治”治療KD、HSP 及SLE 的潛在靶點及有效成分預(yù)測、PPI 網(wǎng)絡(luò)分析、GO和KEGG 富集分析，揭示清瘟敗毒飲治療KD、HSP、SLE 是一個涉及多靶點、多通路、多成分的復(fù)雜過程，其主要有效成分包括槲皮素、芹黃素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、漢黃芩素等，可能通過IL-6、VEGFA、PPARG、CASP3、HIF1A、EGFR、NFKBIA、ICAM1、MYC、FOS 等潛在核心作用靶點，作用于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化等信號通路上。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)主要通過對已有公開數(shù)據(jù)建立的網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型，其數(shù)據(jù)庫信息存在局限性，雖不能做到反映全部的藥理學(xué)特點，但此研究可作為研究的基礎(chǔ)，為進一步探討清瘟敗毒飲治療KD、HSP 及SLE提供依據(jù)，也證實了中醫(yī)“異病同治”理論的科學(xué)性。