馮婷茵，鄧希楷，邢 珂

（廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006）

【研究意義】動物的性別決定機制有兩種類型，分別是遺傳性別決定型（Genetic sex determination，GSD）和環(huán)境依賴性別決定型（Environment dependent sex determination，ESD）。高等脊椎動物，如哺乳動物和鳥類的性別決定機制屬于遺傳性別決定型［1］，而魚類、兩棲類和爬行類動物的性別決定機制不完全依賴于染色體，環(huán)境溫度、pH 值、激素、行為模式等因素都會改變和影響個體的性別分化［2-5］，而且這種影響可以貫穿個體發(fā)育的全過程。因此，在很多魚類和爬行類動物中都可以觀察到環(huán)境因素誘導的性別逆轉現(xiàn)象。

在水產養(yǎng)殖中，魚類的個體大小、外形、體色等具有經(jīng)濟價值的性狀通常與某一特定性別關聯(lián)。如雄性羅非魚（Oreochromis niloticus）和烏斑雜交鱧（Channa）都比其雌性個體生長速度快、體型大，具有更高的經(jīng)濟價值［6-7］；而大菱鲆（Scophthalmus maximus）雌魚體型比雄魚大50%［8］。西部食蚊魚（Gambusia aff inis）為暖水性的小型硬骨魚類，生活于水庫、湖泊、壩塘、沼澤、稻田、水渠、洼地等各類靜水水體中。因其嗜食蚊子幼蟲及具有觀賞價值而被引入我國，分布于長江以南諸多省區(qū)［9］。由于食蚊魚具有容易獲得、生長速度快、繁殖能力強、性別二態(tài)性，且與哺乳動物對化學物質的反應方式相似等特點，近年來食蚊魚被當成一種很好的模式生物，廣泛應用于進化和生態(tài)等研究領域［10-12］。因此，利用食蚊魚研究魚類性別逆轉，有助于在水產養(yǎng)殖業(yè)中控制種群性別比例、培養(yǎng)全單性種群，具有重要的科學意義和經(jīng)濟價值［13-15］。

【前人研究進展】食蚊魚的性別決定染色體為ZW/ZZ 型，但其性別分化同時受到環(huán)境因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)豬場、紙漿造紙廠和城鎮(zhèn)污水處理廠附近水域中高含量的孕激素使雌性食蚊魚的性腺發(fā)育、生殖交配行為受到損害，并使其出現(xiàn)雄魚的第二性征，進而改變該種群的雌雄比例［16-17］。深入研究表明由雌性食蚊魚通過性別逆轉產生的偽雄性食蚊魚具有與野生雄性食蚊魚相似的追逐、搖擺、交配等行為［18-19］，但其擺動臀鰭的頻率更低。此外，這些偽雄性食蚊魚的生殖足無法與雌性個體完全匹配，需要在交配中保持更高的交配頻率。以上研究表明，雌性食蚊魚在環(huán)境中高劑量孕激素的誘導下可發(fā)生性別逆轉現(xiàn)象，且其產生的偽雄性個體獲得了部分生殖行為能力。

【本研究切入點】雖然目前針對硬骨魚類的性別逆轉已有一些研究，但針對食蚊魚的性別逆轉研究鮮有報道，從單細胞基因表達水平探討其性別逆轉機制的研究仍為空白。本研究以養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應用的新型孕激素——孕二烯酮（Gestodene，GES）作為外源激素［20］，以西部食蚊魚(以下簡稱食蚊魚）為研究對象，從形態(tài)學和單細胞轉錄組水平研究孕二烯酮誘導下雌性食蚊魚雄性化過程中性腺單細胞水平基因表達的變化?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用單細胞轉錄組測序技術，從單細胞水平分析孕二烯酮誘導后雌性食蚊魚性腺基因表達譜的變化，挖掘雌性食蚊魚雄性化的關鍵基因，初步解析食蚊魚性別逆轉的分子機理，豐富動物性腺單細胞數(shù)據(jù)，為后續(xù)研究提供更多有效的數(shù)據(jù)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2022 年10 月于廣州市花地灣花鳥魚蟲市場購買4 月齡左右的西部食蚊魚，轉至廣州大學實驗室水循環(huán) 養(yǎng)殖系統(tǒng)培養(yǎng)馴化，設置溫度26(±1)℃，光周期14 h∶10h（光照∶黑暗），水體硬度140(±2.5) mg/L，水體導電性20(±0.3)μS/cm，pH 值7.4(±0.5)，溶解氧含量7.4(±0.2)mg/L。經(jīng)過2 個月馴化穩(wěn)定后，食蚊魚死亡率小于5%，已性成熟可用于試驗。實驗魚的使用和實驗操作符合“實驗動物3R 原則”［21］。

主要試劑包括孕二烯酮（GES,純度99.4%）購自上海西格瑪奧德里奇貿易有限公司（Sigma-Aldrich）、二甲基亞砜（DMSO,純度99.9%）購自上海生工生物工程公司。500 ng/L 孕二烯酮溶液：將24 μL 2 mg/mL 孕二烯酮溶液溶于4 776 μL二甲基亞砜中，取1 250 μL 加進25 L 水中。

4 ℃預冷的400 μg/mL 磷酸鹽緩沖生理鹽水（PBS）溶液（含0.04% BSA,無Ca2+、Mg2+）；30℃預熱的400 μg/mL 1×HBSS 緩沖液（含0.04%BSA，有Ca2+、Mg2+）；消化酶混合液：1 000 μL 1× HBSS 緩沖液（30℃預熱）+1 μL DNA 酶Ⅰ（2 000 U/mL）+10 μL 膠原酶Ⅰ（10%）+10 μL膠原酶Ⅱ（10%）+10 μL 膠原酶Ⅳ（10%）+5 μL 透明質酸酶（10%）+10 μL 中性蛋白酶（5%）+2 μL 離子緩沖液。

1.2 試驗方法

1.2.1試驗分組與處理 挑選 體長為3.0（±0.5）cm、體質量為130（±50）mg 的成年雌性食蚊魚（6 月齡）和體長為1.9（±0.6）cm、體質量為110（±70）mg 的成年雄性食蚊魚（6 月齡）參與孕二烯酮暴露實驗。設置雄性和雌性食蚊魚的空白對照（FC，female control；MC，male control）以及雌性食蚊魚孕二烯酮暴露4 周和8周的處理組（F4，female treated for 4 weeks；F8，female treated for 8 weeks），各組設3 個重復。孕二烯酮處理組為每個容積12 L 的缸中放置10 條雌性成魚和10 L 孕二烯酮暴露溶液。

1.2.2單細胞懸液制備 用解剖剪刀由食蚊魚肛門開始沿腹部剪至鰓蓋下緣，再從兩端分別向背部解剖，在體視鏡下取出性腺組織，使用 預冷至4 ℃的1×PBS 洗滌 2～3 次。將組織切成小碎片，然后轉移到消化酶混合液中，30 ℃消化30～50 min，每隔3 min 搖1 次，進行初步顯微鏡檢查。消化后的細胞懸液用70 μm 過濾器過濾，用2 mL 1× PBS 清洗離心管和細胞篩。用水平離心機在4 ℃下以200 g 離心5 min；取上清，加入5 mL 1×PBS 重懸細胞，再以200 g 離心5 min，洗滌2～3 次；根據(jù)沉淀的量加入預冷的1×PBS 溶液（沉淀較大加入1 mL，較少則加入0.5 mL，幾乎看不到沉淀則加100 μL），輕輕混勻。利用顯微鏡細胞計數(shù)板和0.2%臺盼藍染色液檢測細胞濃度和活性并記錄。

1.2.3單細胞文庫構建及測序 使用10×GenomicsTM微流控芯片，將單細胞懸液和Chromium Single Cell 3’ Reagent（v3，10×Genomics）試劑盒混合，在油相反應體系中形成單細胞珠狀凝膠液滴［22］。隨后，在53 ℃下反轉錄45 min、85 ℃下反應5 min 后終止反應，制備出測序所需的cDNA。將cDNA 進行PCR 擴增，對得到的擴增cDNA 進行片段化、末端修復和補全polyA 尾巴，添加測序接頭并進行文庫擴增，最終制備出單細胞cDNA文庫。單細胞測序采用10×Genomics Novaseq 6000 測序平臺，并用CellRanger（10×GenomicsTM）比對得到原始測序數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

使用Seurat［23］進行主成分分析（Principle Component Analysis，PCA），選擇適當?shù)闹鞒煞诌M行下一步非監(jiān)督聚類和UMAP（Uniform Manifold Approximation and Projection）分析。根據(jù)單細胞聚類結果，在Seurat 中進行特征基因篩選，確定每個細胞亞群的特征基因，并利用CellKB［24］和Fish Enrichr［25-26］數(shù)據(jù)庫鑒定每個細胞亞群對應的細胞類型。

根據(jù)細胞類型注釋的結果，選擇相關的細胞群進行細胞軌跡分析。使用Monocle［27］將單細胞數(shù)據(jù)集轉換成CDS（Cell dataset object）類型，進行預處理（使用降維函數(shù)將數(shù)據(jù)縮小到較低維 度，reduction_method=“UMAP”，preprocess_method=“Aligned”），嵌入降維數(shù)據(jù)，進行擬時序計算。在過濾掉低質量數(shù)據(jù)后進行細胞聚類分析，根據(jù)不同的細胞狀態(tài)分類并進行可視化分析。

根據(jù)上述擬時序計算和細胞分化軌跡結果，找到關鍵細胞群的分化節(jié)點，通過BEAM（Branch Expression Analysis Modeling）分析篩選對分化節(jié)點最關鍵的基因［28-29］，并使用cluster Profiler［30］進行KEGG 富集分析。

2 結果與分析

2.1 孕二烯酮誘導后的食蚊魚鰭部形態(tài)變化

孕二烯酮誘導后的雌性食蚊魚臀鰭形態(tài)發(fā)生了雄性化的變化。野生雌性食蚊魚的臀鰭為扇形或三角形，而雄性的臀鰭具有特化的生殖足結構。經(jīng)孕二烯酮誘導處理4～8 周后，雌性食蚊魚臀鰭發(fā)生了不同程度的特化現(xiàn)象，呈現(xiàn)出類似于雄性生殖足的結構（圖1）。結果表明，孕二烯酮在雌性食蚊魚的性別逆轉過程中起重要的調節(jié)作用，能夠促進其雄性化外部特征的出現(xiàn)。

圖1 孕二烯酮誘導后的食蚊魚鰭部形態(tài)變化Fig.1 Changes in fin morphology of mosquitofish exposed to GES

2.2 孕二烯酮誘導后的食蚊魚性腺細胞構成變化

為進一步探究孕二烯酮誘導下雌性食蚊魚雄性化的分子機制，本研究分別收集MC、FC、F4和F8 組的食蚊魚性腺進行單細胞測序。測序產生的數(shù)據(jù)使用CellRanger 軟件進行單細胞基因表達定量分析；將表達數(shù)據(jù)進行質量控制和篩選，剔除低質量單細胞數(shù)據(jù)，最終獲得每個樣本的單細胞基因表達譜。MC、FC、F4 和F8 樣本的測序數(shù)據(jù)如表1 所示，單個樣本有效細胞數(shù)介于8 982～13 873 之間，檢測到的有效表達基因數(shù)目介于19 891～20 250 之間，有效Barcodes 比例均在97%以上，表明數(shù)據(jù)質量優(yōu)秀。

表1 食蚊魚性腺單細胞測序數(shù)據(jù)概況Table 1 Overview of single-cell sequencing data on gonads of mosquitofish

分析使用Sctransform 對4 個樣本的數(shù)據(jù)進行歸一化并整合，利用UMAP 進行降維處理。由圖2B 可見，野生雌性FC 組和孕二烯酮處理后的雌性F4、F8 組細胞重疊較好，而雄性MC 組的細胞相對呈獨立分布特征，說明成年雌性食蚊魚和雄性食蚊魚性腺細胞構成具有較大差異，且經(jīng)孕二烯酮誘導后的雌性性腺細胞構成仍與雄性不同。

圖2 食蚊魚性腺單細胞UMAP 圖譜Fig.2 Single-cell UMAP diagrams of gonads in mosquitofish

為了確定食蚊魚性腺的具體細胞構成類型和對應的基因表達情況，本研究進一步對細胞進行聚類，提取每個細胞類群特異高表達的marker 基因，利用CellKB 和Fish Enrichr 對細胞類型進行注釋分析。剔除血液細胞和免疫細胞后，結果發(fā)現(xiàn)食蚊魚性腺一共包含6 種主要的細胞類型（圖2A，表2）。不同樣本間比較發(fā)現(xiàn)，雄性食蚊魚性腺主要由成纖維細胞、雄性生殖細胞、上皮細胞和原始生殖細胞構成，而雌性性腺主要由內皮細胞、成纖維細胞、卵母細胞和原始生殖細胞構成。孕二烯酮誘導處理4～8 周后，雌性食蚊魚性腺中產生少量的雄性生殖細胞（F4 0.79%，F(xiàn)8 0.39%）。此外，誘導8 周后性腺中原始生殖細胞比例較野生雌性樣本極顯著上升。

表2 食蚊魚性腺單細胞細胞類型比例Table 2 Proportion of cell types in gonads of mosquitofish (%)

2.3 原始生殖細胞的基因表達與分化

2.3.1原始生殖細胞的基因表達 提取來自FC、F4和F8樣本的原始生殖細胞進行重聚類和分析，并重點分析與性別決定相關重要基因的表達情況。結果表明，來自FC、F4 和F8 的原始生殖細胞可以被劃分為9 個亞類型（圖3）。值得注意的是，不同性別分化的關鍵基因在不同細胞類群里出現(xiàn)差異表達情況。幾個與 雄性生殖細胞分化密切相關的基因（如amh、fabp3、dmrt1、wt1a和wt1b）在cluster1 和cluster3 中高表達；對雌性性腺發(fā)育和卵子形成有重要作用的cyp19a1a及fgf16基因則在cluster 0 和cluster 2 中高表達（圖4）。結果表明，在孕二烯酮誘導下原始生殖細胞類群中同時出現(xiàn)了兩種具有不同性別決定潛能的細胞。

圖3 原始生殖細胞狀態(tài)和細胞來源UMAP 圖譜Fig.3 UMAP diagrams of primordial germ cells state and sources

圖4 原始生殖細胞性別特征基因表達圖譜Fig.4 Gene expression profiles of sex characteristics in primordial germ cells

2.3.2原始生殖細胞的分化 利用單細胞軌跡分析和擬時序分析研究原始生殖細胞的分化過程以及對應的基因表達變化序列，結果（圖5B）顯示，來自FC 的樣本主要集中分布在原始生殖細胞分化軌跡的早期，來自F4 和F8 的細胞主要集中分布在分化軌跡的中晚期。孕二烯酮誘導后，原始生殖細胞出現(xiàn)了兩種截然不同的分化方向。結合圖4 中性別分化關鍵基因的表達情況，推測部分原始生殖細胞出現(xiàn)向雄性生殖細胞分化的趨勢，而部分細胞維持向雌性生殖細胞分化的趨勢（圖5C）。

圖5 原始生殖細胞分化軌跡Fig.5 Trajectory analysis of primordial germ cells

基于上述細胞分化軌跡，通過BEAM 分析發(fā)現(xiàn)，有2 477 個基因在兩個不同的分化方向表現(xiàn)出不同的表達模式（圖6A）。對差異最大的前200 個基因進行KEGG 通路富集分析，結果發(fā)現(xiàn)Toll-like receptor、TGF-beta、Notch 等信號通路參與了原始生殖細胞向雄性化逆轉的過程（圖6B）；甘氨酸，絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝等途徑也與該過程相關（圖6C）；不飽和脂肪酸、類固醇激素生物合成，醚酯、亞油酸代謝等途徑則對維持原始生殖細胞向雌性性腺分化有重要作用（圖6B）。

圖6 原始生殖細胞BEAM 分析及基因富集分析結果Fig.6 BEAM analysis of primordial germ cells and enrichment analysis of genes

3 討論

原始生殖細胞是一類生殖干細胞，具有向不同性別生殖細胞分化的潛能，是魚類性別決定和分化過程中最重要的一類細胞。其形成方式目前存在兩種學說，第一種是先成論，指受精卵帶有母源生殖質，隨著細胞分裂進行，生殖質被不均等地分配，獲得生殖質的細胞將發(fā)育成原始生殖細胞，否則發(fā)育成體細胞，如斑馬魚（Danio rerio）、泥 鰍（Misgurnus anguillicaudatus）和大菱鲆等；另一種是后成論，指受精卵早期分裂中的體細胞與生殖細胞沒有區(qū)別，但會因某些細胞間信號誘導分化成原始生殖細胞，如哺乳動物、青鳉(Oryzias latipes)、真鯛（Pagrosomus major）［31-34］。本研究發(fā)現(xiàn)孕二烯酮刺激下，隨著時間增加，雌性食蚊魚中的原始生殖細胞數(shù)量不斷上升，推測食蚊魚原始生殖細胞形成方式屬于后成論。通過富集分析發(fā)現(xiàn)Toll-like receptor、TGF-beta、Notch 等信號通路參加了食蚊魚雄性化的過程，推測以上通路也可能誘導原始生殖細胞生成。

原始生殖細胞的基因表達和細胞數(shù)量都有可能影響魚類的性別決定。在斑馬魚和青鳉的研究中發(fā)現(xiàn)，原始生殖細胞數(shù)量不足的個體傾向于發(fā)育為雄魚，而原始生殖細胞較多的個體則傾向于發(fā)育為雌魚［35-37］。相比之下，泥鰍的性別決定則與原始生殖細胞的數(shù)量無關［38］。本研究發(fā)現(xiàn)孕二烯酮刺激下雌性食蚊魚出現(xiàn)向雄性化逆轉的現(xiàn)象，且伴隨原始生殖細胞數(shù)量顯著上升，這一結果與在斑馬魚、青鳉和泥鰍中觀察到的情況均不相同。分析其原因可能與不同魚類多樣化的性別決定機制有關，且這一結果進一步說明原始生殖細胞數(shù)目是決定魚類性別分化的重要因素之一。

本研究發(fā)現(xiàn)孕二烯酮刺激下有幾個與魚類性別分化密切相關的基因（amh、fabp3、dmrt1、wt1a、wt1b、cyp19a1a和fgf16）在原始生殖細胞內出現(xiàn)差異表達的情況。其中TGFβ超家族成員amh基因是硬骨魚睪丸分化的關鍵基因。哺乳動物中該基因誘導繆勒氏管退化，并阻止雌性生殖管發(fā)育［39］。而在魚類中amh被發(fā)現(xiàn)可以通過調節(jié)cyp11a1、cyp17和cyp19a1a的表達進而影響性腺中的睪酮含量［40］。研究發(fā)現(xiàn)，東部食蚊魚（Gambusia holbrooki）雄性胚胎中amh基因的表達量是雌性胚胎的25 倍［41］。本研究中amh基因在孕二烯酮誘導后在部分原始生殖細胞中出現(xiàn)了高表達的情況，說明這部分細胞可能出現(xiàn)了向雄性化分化的特征。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)amh和cyp19a1a基因具有截然相反的表達模式，側面印證了性腺分化過程中amh基因對cyp19a1a的抑制作用。

促卵泡激素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促黃體化激素（Luteninzing hormone，LH）通過與其對應的受體FSHR 和LHCGR 相結合調控性腺發(fā)育。fshr和lhcgr基因在青鳉卵巢和睪丸中均具有較高的表達水平，在睪丸形成過程中，兩個基因的表達均有上調現(xiàn)象［42］，說明這兩個基因對雄性性腺的發(fā)育有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，在食蚊魚原始生殖細胞向雄性化分化的過程中，fshr出現(xiàn)上調現(xiàn)象，但lhcgr則并未出現(xiàn)明顯上調。由于在卵泡形成過程中l(wèi)hcgr的表達相比fshr存在一定的滯后現(xiàn)象［43］，推測這兩個基因在雄性化過程中的表達同樣存在表達時間差異的可能。比較野生雌性食蚊魚和孕二烯酮處理后雌性食蚊魚的單細胞圖譜，本研究發(fā)現(xiàn)誘導后的原始生殖細胞開始出現(xiàn)向雄性化分化的特征，出現(xiàn)極少量的分化后雄性生殖細胞（精原細胞），這說明誘導后的雌魚已經(jīng)在一定程度上具有雄性食蚊魚的生殖功能，但其生殖能力還遠遠低于正常的雄性食蚊魚。在本試驗所用孕二烯酮劑量下，完全的雄性化過程可能需要更長的時間。在前期的預實驗中發(fā)現(xiàn)，當環(huán)境中孕二烯酮濃度達到500 ng/L 時，培養(yǎng)2 個月后的食蚊魚就開始出現(xiàn)死亡情況，且隨著時間增加死亡數(shù)目不斷上升，3 個月時70%的食蚊魚已經(jīng)死亡。因此，為了確保獲得足夠的樣本進行測序和分析，本研究選擇8 周作為最長的暴露時間來觀察食蚊魚的性別逆轉現(xiàn)象。下一步研究將通過調節(jié)暴露濃度和延長暴露時間進一步跟蹤雌性食蚊魚完全雄性化的過程。

已有多項研究證明雌性食蚊魚暴露在孕激素中會誘導出與雄魚類似的生殖足，即發(fā)生臀鰭雄性化。雄魚生殖足的形成和發(fā)育主要由類固醇激素決定，特別是雄激素［44-45］。在一些魚類中，雄激素尤其是11-酮睪酮（11KT）可刺激魚鰭的伸長，而雄激素拮抗劑或雄激素合成抑制劑會干擾睪丸功能和外生殖器發(fā)育［46］。研究發(fā)現(xiàn)ar、shh、ptc1、cyp19a、er和vtgc等基因都與性別二態(tài)性魚類臀鰭發(fā)育相關［47-48］，本研究也發(fā)現(xiàn)cyp19a基因存在特異性表達，與以往研究結果符合。

單細胞測序是一項新興的組學研究技術，憑借其高通量的準確性和特異性，廣泛應用于生物的各種生理過程研究。目前利用單細胞測序分析來研究魚類性別逆轉的報道有半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis），其雌性個體在發(fā)育早期用高溫誘導可使雌魚的性逆轉率達到73%［49］。利用單細胞測序技術發(fā)現(xiàn)，在未分化的偽雄性精原細胞中，CaSR基因和MAPK 信號因子上調［50］。本研究未發(fā)現(xiàn)該基因和信號因子上調，可能原因是不同機制誘導的性別逆轉涉及到的信號通路不同，以及不同魚類遺傳背景也會導致性別轉變機制不同。魚類的性別逆轉是個復雜過程，仍需要大量的研究來填補該空白領域。

4 結論

將雌性食蚊魚置于濃度為500 ng/L 孕二烯酮溶液暴露4～8 周后，發(fā)現(xiàn)雌性食蚊魚臀鰭出現(xiàn)雄性化特征；分別取野生雌性、雄性食蚊魚和暴露4、8 周雌性食蚊魚的性腺進行單細胞轉錄組測序并進行數(shù)據(jù)分析，結果發(fā)現(xiàn)野生雌性食蚊魚和雄性食蚊魚性腺細胞構成明顯不同，暴露4、8 周后的雌性食蚊魚性腺中出現(xiàn)少量的雄性生殖細胞（精原細胞），且原始生殖細胞數(shù)量有明顯上升；在孕二烯酮誘導下雌性食蚊魚原始生殖細胞中性別決定關鍵基因amh、fabp3、dmrt1、wt1a、wt1b、cyp19a1a和fgf16出現(xiàn)差異化表達情況；細胞軌跡分析表明，部分原始生殖細胞出現(xiàn)向雄性化分化的特征。Toll-like receptor、TGF-beta、Notch和一些氨基酸代謝信號通路參與了原始生殖細胞向雄性化逆轉的過程。