吳宇泠 王寶珊 胡 晶 鄢和新 楊立群

肝臟是人體腹腔內(nèi)較為獨(dú)特的器官,可同時(shí)接受動(dòng)脈血和靜脈血的雙重供應(yīng),其中門靜脈來源的靜脈血是供給肝臟的主要來源,經(jīng)肝動(dòng)脈進(jìn)入肝臟的動(dòng)脈血僅是一小部分。門靜脈血不僅富含腸道吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),也含有由損傷的腸黏膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移而來的病原體及其衍生物,肝臟必須耐受這些潛在的免疫原性物質(zhì),同時(shí)保持對(duì)病原體和惡性腫瘤的持續(xù)免疫監(jiān)視。因此,肝臟是一個(gè)具有很強(qiáng)的免疫學(xué)特性的免疫器官[1]。同時(shí),肝臟也是一個(gè)固有免疫占據(jù)優(yōu)勢(shì)的器官,固有免疫細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于適應(yīng)性免疫細(xì)胞。作為肝內(nèi)固有免疫占比最高的細(xì)胞,自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞在清除細(xì)菌、病毒和癌細(xì)胞以維持肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮了重要作用[2]。

慢性肝病是全球主要的疾病負(fù)擔(dān)之一,每年導(dǎo)致200萬(wàn)人死亡。慢性肝病的潛在病因包括病毒、酒精、代謝、自身免疫和遺傳等因素。器官纖維化則是慢性炎癥疾病進(jìn)展的特征,占全球全因死亡率的45%。肝纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生和基質(zhì)降解障礙為特征的病理過程[3]。各種原因?qū)е碌母渭?xì)胞損傷、死亡為肝纖維化提供了信號(hào),其釋放的細(xì)胞碎片和內(nèi)容物,以及免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)激活了肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)并誘導(dǎo)其增殖、分化、產(chǎn)生過量的纖維蛋白原和細(xì)胞外基質(zhì)[4]。肝纖維化的進(jìn)展決定了慢性肝病患者的預(yù)后及生活質(zhì)量,若不給予有效治療,將進(jìn)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌。在目前臨床實(shí)踐中,肝部分切除術(shù)和肝移植手術(shù)是肝癌及肝硬化等終末期肝病患者的有效治療手段,但圍手術(shù)期肝損傷[術(shù)中缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)和術(shù)后移植物免疫反應(yīng)等]影響著患者的預(yù)后。隨著對(duì)肝纖維化和圍手術(shù)期肝損傷的病理生理過程的深入了解,研究[5]發(fā)現(xiàn)固有免疫在兩者進(jìn)展中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。本文將總結(jié)固有免疫細(xì)胞中的NK細(xì)胞在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程和肝移植手術(shù)圍手術(shù)期IRI,以及術(shù)后移植物免疫反應(yīng)中的作用及其調(diào)控機(jī)制。

1 正常肝臟與NK細(xì)胞

NK細(xì)胞最初被定義為對(duì)腫瘤細(xì)胞具有天然細(xì)胞毒性的大顆粒淋巴細(xì)胞,來源于骨髓淋巴樣干細(xì)胞,是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的重要組分之一,在人體的大部分器官中均有分布[6]。NK細(xì)胞在人體中起到免疫防御與免疫監(jiān)視的作用,不僅可以通過細(xì)胞毒性發(fā)揮殺傷能力,同時(shí)具有產(chǎn)生細(xì)胞因子的效應(yīng)功能。NK細(xì)胞可以通過直接釋放穿孔素、顆粒酶、顆粒溶素等裂解顆粒誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,其表面表達(dá)的TNF超家族成員(如FasL和TRAIL)分別與其相應(yīng)受體(Fas和TRAILR)結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NK細(xì)胞表面表達(dá)一些抑制性受體和激活性受體,這些受體可與靶細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合傳遞抑制或活化的信號(hào),而這兩種信號(hào)之間的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控著NK細(xì)胞的活性。抑制性受體可以識(shí)別各種形式的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ分子。靶細(xì)胞上MHC-Ⅰ分子表達(dá)水平下降或缺失可減弱傳遞給NK細(xì)胞的抑制信號(hào)強(qiáng)度,從而促進(jìn)NK細(xì)胞的活化。此外,NK細(xì)胞還可通過其表達(dá)的IgG Fc段受體Ⅲ(FcγRⅢ,即CD16)與抗體Fc段結(jié)合,介導(dǎo)抗體依賴性的細(xì)胞毒性作用,以殺傷靶細(xì)胞。人常規(guī)NK細(xì)胞可根據(jù)其標(biāo)志物CD56的表達(dá)水平分為CD56dim(即CD56低表達(dá))和CD56bright(即CD56高表達(dá))兩個(gè)亞群[7]。不同亞群具有獨(dú)特功能屬性,在免疫反應(yīng)中起到的作用也不同。CD56dimNK細(xì)胞亞群相較于CD56bright亞群的細(xì)胞毒性更強(qiáng),其FcγRⅢ的表達(dá)水平更高;而CD56bright細(xì)胞亞群分泌細(xì)胞因子的能力更強(qiáng)。NK細(xì)胞也可根據(jù)CD27與CD11b的表達(dá)分為不同亞群,CD27-CD11b+NK細(xì)胞更為成熟且呈現(xiàn)出更高的細(xì)胞毒性[8]。

NK細(xì)胞在肝內(nèi)淋巴細(xì)胞中的占比顯著高于其在其他臟器和組織中的比例。人血液循環(huán)中NK細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的占比大約為5%～15%,而肝臟中NK細(xì)胞在淋巴細(xì)胞中的占比高達(dá)50%。人類肝臟中不僅有通過血液循環(huán)遷移而來的常規(guī)循環(huán)自然殺傷(conventional circulating natural killer,cNK)細(xì)胞,也有特殊的肝臟駐留自然殺傷(liver-resident NK,LrNK)細(xì)胞。LrNK細(xì)胞首次在大鼠肝臟電子顯微鏡(簡(jiǎn)稱電鏡)檢查中被發(fā)現(xiàn),并被定義為Pit細(xì)胞[9]。后續(xù)的研究[10]結(jié)果表明,LrNK細(xì)胞是駐留于肝血竇中的高細(xì)胞毒性的NK細(xì)胞。血液循環(huán)中CD56brightNK細(xì)胞亞群占比較低,肝臟中CD56brightNK細(xì)胞占比與CD56dimNK細(xì)胞相當(dāng),同時(shí)CD56brightNK細(xì)胞群高表達(dá)組織駐留與活化標(biāo)志物CD69、趨化因子受體(chemokine receptor,CCR)5和趨化因子CXC亞家族受體(CXCR)6,其中CCR可與肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞上的相應(yīng)配體結(jié)合,從而選擇性定位于肝血竇中。目前,主要通過轉(zhuǎn)錄因子Tbet和Eomes的表達(dá)水平來區(qū)分cNK和LrNK,EomeshiTbetlo(即Eomes高表達(dá),T-bet低表達(dá))LrNK細(xì)胞亞群占人NK細(xì)胞的50%,cNK則不表達(dá)Eomes而高表達(dá)Tbet。肝臟NK細(xì)胞的異質(zhì)性及相對(duì)豐富性提示其在肝臟免疫微環(huán)境中的重要作用,進(jìn)一步研究這群細(xì)胞有助于了解其在肝臟疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的作用[11]。

2 肝纖維化與NK細(xì)胞

肝臟具有高度再生能力,肝臟受到損傷后,可以通過再生恢復(fù)肝細(xì)胞數(shù)量和功能。然而,持續(xù)的慢性損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞反復(fù)受損,再生功能發(fā)生障礙,致使瘢痕形成和纖維化。肝纖維化的病理特征是細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積。持續(xù)的損傷因素刺激肝細(xì)胞和肝巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)等非實(shí)質(zhì)細(xì)胞釋放大量促炎因子,激活靜息態(tài)的HSC,HSC進(jìn)而轉(zhuǎn)化為具有增殖性和成纖維性的肌成纖維細(xì)胞,產(chǎn)生大量纖維蛋白原和細(xì)胞外基質(zhì),導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生。因此,HSC一直是肝纖維化研究的重點(diǎn)。近年來的研究[12]結(jié)果表明,NK細(xì)胞有著抗纖維化作用。研究者對(duì)不同類型免疫缺陷小鼠進(jìn)行慢性肝纖維化誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn),缺乏T、B、NK細(xì)胞的SCID BEIGE小鼠[即重度聯(lián)合免疫缺陷病(SCID)小鼠與NK細(xì)胞缺陷(BEIGE)小鼠雜交的小鼠]相較于缺乏T、B淋巴細(xì)胞的SCID小鼠肝纖維化程度更高,且SCID BEIGE小鼠肝臟IFN-γ水平也明顯下降,提示NK細(xì)胞具有抗纖維化的作用[13]。臨床上,丙型肝炎(簡(jiǎn)稱丙肝)患者尤其是纖維化晚期階段患者的NK細(xì)胞出現(xiàn)功能及表型缺陷導(dǎo)致其活性下降,為丙肝病毒逃避NK細(xì)胞監(jiān)視提供基礎(chǔ),且NK細(xì)胞功能與自身肝硬化程度呈負(fù)相關(guān)[14]。

NK細(xì)胞拮抗纖維化的具體作用機(jī)制主要與其表面活化性受體及抑制性受體傳遞的活化或抑制信號(hào)的變化相關(guān)。靜息態(tài)HSC在肝內(nèi)主要負(fù)責(zé)攝取、儲(chǔ)存和釋放視黃酸,纖維化早期活化的HSC(activated HSC,aHSC)產(chǎn)生更多的視黃酸,進(jìn)而促進(jìn)其表面NK細(xì)胞活化性受體殺傷細(xì)胞凝集素樣受體亞家族K成員1(killercell lectinlike receptor subfamily K1,KLRK1)即NKG2D的配體視黃酸早期誘導(dǎo)基因-1(retinoic acid early inducible gene 1,RAE-1)的表達(dá)上調(diào)[15]。另有研究[16]結(jié)果表明,aHSC表面同時(shí)表達(dá)NK細(xì)胞另一活化性受體天然細(xì)胞毒性觸發(fā)受體(natural cytotoxicity triggering receptor 1,NCR1)NKp46/NCR1的配體,NK細(xì)胞也可通過NKp46介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用殺傷aHSC。除了NK細(xì)胞激活信號(hào)傳遞增加,抑制信號(hào)的減少更提高了NK細(xì)胞的活化程度。HSC在損傷信號(hào)刺激下,不僅活化性受體的配體表達(dá)上調(diào),且抑制性受體配體MHC-Ⅰ表達(dá)下調(diào),傳遞給NK細(xì)胞的抑制信號(hào)減少,殺傷能力進(jìn)一步提升。體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,siRNA敲低NK細(xì)胞的抑制性受體后,增強(qiáng)了其對(duì)HSC的殺傷能力并改善纖維化[17]。NK細(xì)胞不僅可以通過直接殺傷HSC來改善纖維化,其分泌的效應(yīng)分子IFN-γ也可以通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)1依賴的方式抑制HSC增殖和誘導(dǎo)其凋亡干預(yù)纖維化進(jìn)程[18]。盡管IFN-γ在小鼠肝纖維化模型中可顯著改善肝纖維化,臨床試驗(yàn)[19]結(jié)果表明IFN-γ療法在乙型肝炎和丙肝患者中的療效有限且肝病晚期患者并不能從中獲益。HSC在肝纖維化過程中可以合成大量TGF-β,TGF-β是肝纖維化過程中最重要的促纖維化因子,其可通過下調(diào)NKG2D的表達(dá)來抑制NK細(xì)胞的殺傷功能。體外HSC和NK細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提示,離體培養(yǎng)4 d(早期活化)的HSC可以通過NKG2D-RAE1機(jī)制促進(jìn)NK細(xì)胞活化,而這一激活效果在離體培養(yǎng)8 d(中期活化)的HSC中明顯下降,其原因在于離體培養(yǎng)8 d的HSC合成的TGF-β顯著增多,抑制了HSC的激活。此外,NK細(xì)胞STAT依賴的IFN-γ的分泌也受到了干擾,活化HSC視黃醇代謝的增加激活了細(xì)胞因子信號(hào)傳送阻抑物(suppressor of cytokine signaling,SOCS1),進(jìn)而抑制了STAT1活性影響IFN-γ的分泌[20]。上述研究提示了NK細(xì)胞的抗纖維化作用集中在纖維化早期,隨著疾病進(jìn)展其抗纖維化作用受到抑制,IFN-γ治療進(jìn)展期肝纖維化的臨床試驗(yàn)收效甚微的原因或在于此。

NK細(xì)胞對(duì)HSC細(xì)胞的作用可以作為治療肝纖維化的潛在靶點(diǎn),NK細(xì)胞活性的提升雖能殺傷HSC,但其對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的損傷也不能忽視。肝細(xì)胞本身也表達(dá)NK細(xì)胞活化性受體的配體,如FasL、MICA/MICB和B7-H6,爆發(fā)性病毒性肝炎中,NK細(xì)胞的活化反而會(huì)通過Fas/FasL、NKG2D/NKG2D配體方式損傷肝細(xì)胞,造成更嚴(yán)重的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞炎性壞死,反而有利于病毒的持續(xù)存在[21-23]。以NK細(xì)胞為基礎(chǔ)的療法仍需更多的體內(nèi)研究驗(yàn)證其安全性及可靠性。

3 圍手術(shù)期肝臟損傷與NK細(xì)胞

3.1 肝IRI 肝IRI是肝部分切除術(shù)和肝移植手術(shù)過程中不可避免的病理生理過程,主要分為缺血期缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷和再灌注后免疫炎癥反應(yīng)兩個(gè)階段。肝缺血使肝細(xì)胞缺氧、ATP耗竭、pH值變化,以及代謝應(yīng)激而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷或死亡。再灌注后,肝臟代謝受到進(jìn)一步干擾并誘發(fā)相關(guān)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞損傷加重。肝臟IRI可分為熱缺血和冷缺血兩種類型。熱IRI主要與肝切除術(shù)、出血性休克、外傷、心臟驟停或肝竇阻塞綜合征所致的肝組織血管閉塞相關(guān)。冷IRI則主要發(fā)生在肝移植手術(shù)中,供肝在移植到患者體內(nèi)前保存于低溫缺氧的環(huán)境中[24]。

肝臟缺血1 h、再灌注2 h后,肝實(shí)質(zhì)中NK細(xì)胞浸潤(rùn)增多;而NK細(xì)胞清除后,肝臟CXCL-2表達(dá)顯著下調(diào),中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少,肝臟IRI程度減輕[25]。肝移植模型中,同種異體移植物的NKG2D基因表達(dá)水平顯著增高,提示NK細(xì)胞活化,而抗去唾液酸單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂預(yù)處理供體清除其NK細(xì)胞后,NKG2D表達(dá)水平下調(diào)時(shí)肝內(nèi)細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8)和NK細(xì)胞分泌的效應(yīng)分子(穿孔素、顆粒酶B)水平也均下降,早期中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)亦隨之減少[26]。

以上研究結(jié)果表明,NK細(xì)胞在冷IRI和熱IRI中均起到重要作用,損傷發(fā)生后NK細(xì)胞通過募集進(jìn)入肝臟,活化并激活炎癥反應(yīng)的同時(shí)分泌炎癥因子及效應(yīng)分子,從而加重肝臟的IRI程度[27-28]。肝臟IRI的嚴(yán)重程度與肝移植患者早期同種異體移植物功能障礙(early allograft dysfunction,EAD)直接相關(guān),可降低移植物短期存活率[29]。

3.2 移植后免疫排斥與免疫耐受 NK細(xì)胞與免疫介導(dǎo)的同種異體移植物損傷有關(guān),同時(shí)也有越來越多的證據(jù)表明,NK細(xì)胞也可能促進(jìn)同種異體移植物的免疫耐受性[30]。肝移植早期階段,供體來源的LrNK細(xì)胞和cNK細(xì)胞同時(shí)進(jìn)入受體的血液循環(huán)中,其中EomeshiLrNK細(xì)胞較為長(zhǎng)壽,其可在移植物中停留長(zhǎng)達(dá)十余年;而供體來源的EomeslocNK細(xì)胞則是停留在受體的血液循環(huán)中,移植數(shù)年后幾乎無法在血液中再檢測(cè)出這群NK細(xì)胞[31]。EomeshiLrNK細(xì)胞表面抑制性受體的表達(dá)水平較低,且分泌的穿孔素和顆粒酶B水平較低,呈低細(xì)胞毒性;EomeslocNK細(xì)胞則相反,其高細(xì)胞毒性表現(xiàn)使其在進(jìn)入受體血液循環(huán)后首先攻擊受體肝臟內(nèi)浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞,導(dǎo)致早期異體移植物排異反應(yīng);EomeshiLrNK則由于其長(zhǎng)壽特性得以長(zhǎng)期停留在受體肝臟中,有助于肝臟產(chǎn)生更耐受的環(huán)境[31]。臨床研究[32]顯示,接受骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞回輸?shù)母我浦不颊唧w內(nèi)供體來源的NK細(xì)胞增多,促進(jìn)了免疫耐受環(huán)境的建立。受體本身的NK細(xì)胞在移植后數(shù)小時(shí)內(nèi)就進(jìn)入移植物中,但其具體介導(dǎo)免疫排異還是免疫耐受反應(yīng)仍存爭(zhēng)議,還需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明確其表型變化及響應(yīng)移植后機(jī)體生理變化的機(jī)制。這將有助于研究者更好地了解如何靶向調(diào)控NK細(xì)胞以調(diào)節(jié)移植后的免疫反應(yīng)。

4 總結(jié)與展望

慢性肝損傷導(dǎo)致的肝纖維化是慢性肝臟疾病的共同病理過程,也是慢性肝病向肝硬化進(jìn)展的必經(jīng)之路。有效的病因治療可以減輕甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化,但特殊原因(如自身免疫因素、代謝因素等)導(dǎo)致的慢性肝病仍缺乏可行的抗纖維化治療方法。進(jìn)展至肝硬化或肝癌的終末期慢性肝病患者的治療手段則更為缺乏。肝部分切除術(shù)和肝移植等手術(shù)治療是目前最為有效的方法。然而,基于慢性肝病的肝臟手術(shù)還面臨著圍手術(shù)期肝臟損傷與術(shù)后移植物免疫反應(yīng)的巨大挑戰(zhàn)。NK細(xì)胞作為肝臟淋巴細(xì)胞的主要組成部分,無論是在慢性肝病患者疾病進(jìn)展階段還是肝臟手術(shù)的術(shù)中和術(shù)后階段均起著重要作用。近年來,隨著免疫療法的興起,NK細(xì)胞在慢性肝病及肝移植圍手術(shù)期的作用更不容忽視。NK細(xì)胞在肝臟中的特殊亞群及其在纖維化、IRI、移植物免疫反應(yīng)中的作用及其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。以NK細(xì)胞為靶點(diǎn),尤其是其在肝臟中的特殊亞群,或許能為不同階段的慢性肝病患者提供新的療法和個(gè)性化治療思路。