官瑩瑩?李詩敏?袁干軍?易厚琴?張同科

摘要：目的 探究植物源抗菌天然產(chǎn)物鼠尾草酸、α-倒捻子素分別與抗生素的聯(lián)合應(yīng)用效果，發(fā)現(xiàn)不同聯(lián)合應(yīng)用效果的抗菌組合物。方法 分別以敏感金黃色葡萄球菌ATCC25923、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA 01為指示菌株，采用微量肉湯稀釋法，測定鼠尾草酸、α-倒捻子素和不同作用機制抗生素對指示菌株的最低抑菌濃度；再采用棋盤格法，分別測定鼠尾草酸、α-倒捻子素與不同作用機制抗生素聯(lián)用對測試菌株的部分抑菌濃度指數(shù)（fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI）。結(jié)果 鼠尾草酸、α-倒捻子素聯(lián)合硫酸慶大霉素對測試菌株的FICI范圍分別為0.28～0.62、0.31～0.50，前者對兩株測試菌株分別顯示協(xié)同或無關(guān)作用，后者均顯示協(xié)同作用；鼠尾草酸、α-倒捻子素分別與其他抗生素對測試菌株的FICI范圍為0.52～1.12，均顯示無關(guān)作用。結(jié)論 靶向細胞膜的鼠尾草酸、α-倒捻子素與作用于核糖體影響細胞膜的氨基糖苷類慶大霉素聯(lián)用時，主要呈現(xiàn)協(xié)同的聯(lián)合抗菌效果，進一步證實了課題組發(fā)現(xiàn)的聯(lián)合用藥效果的相關(guān)規(guī)律；組合物鼠尾草酸/硫酸慶大霉素對金黃色葡萄球菌的不同菌株既可顯示協(xié)同，又可顯示無關(guān)作用，為聯(lián)合用藥防細菌耐藥的進一步研究打下了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：抗生素；聯(lián)合用藥；鼠尾草酸；α-倒捻子素；金黃色葡萄球菌

中圖分類號：R978文獻標(biāo)志碼：A

Antibacterial effects of carnosic acid or α-mangostin combined with various antibiotics with different mechanisms to Staphylococcus aureus

Guan Ying-ying1，2， Li Shi-min1， Yuan Gan-jun1，2， Yi Hou-qin1 and Zhang Tong-ke1

（1 Biotechnological Engineering Center for Pharmaceutical Research and Development， Jiangxi Agricultural University，

Nanchang 330045; 2 College of Bioscience and Engineering， Jiangxi Agricultural University， Nanchang 330045）

Abstract? ? Objective To explore the combinational effects of carnosic acid and α-mangostin， originated from plant antimicrobial natural products， respectively combined with antibiotics， and to discover drug combinations with different combinational effects. Methods The minimum inhibitory concentration （MIC） of carnosic acid， α-mangostin， and antibiotics with various action mechanisms to Staphylococcus aureus ATCC25923 and methicillin-resistant S. aureus （MRSA） MRSA 01， used as indicator strains， were determined using broth microdilution method. Then， the fractional inhibitory concentration indices （FICIs） of carnosic acid or α-mangostin in combination with antibiotics with various action mechanisms were tested using checkerboard method. Results The FICIs of carnosic acid or α-mangostin in combination with gentamycin sulfate against tested strains respectively ranged from 0.28 to 0.62， and from 0.31 to 0.50. The former shows synergistic or independent effects， and the latter shows synergistic effects. Those of carnosic acid or α-mangostin in combination with other antibiotics ranged from 0.516 to 1.125， and all showed indifferent effects. Conclusion Cell membrane-targeted carnosic acid and α-mangostin in combination with gentamycin sulfate， an aminoglycoside antibiotic acting on the ribosome and affecting the cell membrane， mainly showed synergistic effects， and which further confirmed the relevant law of drug combinational effect discovered by our research group. Another， the combinations of carnosic acid and gentamicin sulfate， showing synergistic or indifferent effects on different strains of S. aureus， provide a solid foundation for further research on drug combinations to prevent bacterial resistance.

Key words Antibiotics; Drug combination; Carnosic acid; α-Mangostin; Staphylococcus aureus

近年來，多重耐藥菌對各種結(jié)構(gòu)類型的臨床抗生素相繼耐藥，成為超級耐藥菌，嚴重威脅著人類公共健康和全球經(jīng)濟增長，有效防細菌耐藥的策略研究和臨床實踐迫在眉睫[1-3]。應(yīng)對細菌耐藥的策略和措施涉及面廣且復(fù)雜[2，4-7]，其中合理地聯(lián)合用藥不僅可有效提高抗菌藥物的臨床療效，充分利用現(xiàn)有的抗菌藥物資源減少細菌耐藥幾率，為研究新的抗生素贏得時間和空間[6，8-10]。

隨著聯(lián)合用藥研究的深入，植物來源天然產(chǎn)物與抗生素聯(lián)合應(yīng)用的報道不斷增加，結(jié)果顯示其中某些天然產(chǎn)物與抗生素聯(lián)合用藥不僅可協(xié)同增效，有的還可逆轉(zhuǎn)抗生素的抗藥性、增加抗生素的敏感性[11-12]，如表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）等化合物[11]。本課題組在抗菌天然產(chǎn)物的研究實踐中發(fā)現(xiàn)迷迭香所含的鼠尾草酸具有良好的抗耐藥金黃色葡萄球菌作用，且與苯唑西林鈉等β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用時可產(chǎn)生相加或協(xié)同效果[13]；同時，在植物源抗菌藥物先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)的過程中注意到從山竹中分離得到的α-倒捻子素具有很強的抗金黃色葡萄球菌活性[14]。

本課題組前期發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥的效果與兩抗菌藥物的作用機制密切相關(guān)[15]，即作用于同一代謝途徑不同代謝位點的抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用，產(chǎn)生協(xié)同抗菌效果的概率較大，而非傳統(tǒng)認為不同作用機制抗菌藥物聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同的可能性較大。這一發(fā)現(xiàn)隨后得到Brochado等[16]國際學(xué)者從不同角度系統(tǒng)深入研究的證實。但研究中均為選用臨床抗生素得出的結(jié)論，而并未考察植物天然抗菌化合物與臨床抗生素的聯(lián)合應(yīng)用情況。因此，本文擬對植物天然抗菌產(chǎn)物鼠尾草酸、α-倒捻子素分別與不同作用機制的抗生素聯(lián)合應(yīng)用的抗金黃色葡萄球菌效果進行研究，以進一步從更廣的角度證明課題組發(fā)現(xiàn)的聯(lián)合用藥效果規(guī)律的科學(xué)性和合理性，并由此期望獲得合適的植物抗菌天然產(chǎn)物與臨床抗生素的藥物組合，為課題組發(fā)現(xiàn)的聯(lián)合用藥規(guī)律的進一步驗證完善打下基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

精密電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；凈化工作臺（無錫易純凈化設(shè)備有限公司）；96孔細胞培養(yǎng)板（上海依科賽生物制品有限公司）；超純水機（石家莊泰斯特儀器設(shè)備有限公司）；恒溫搖床（金壇市億能實驗儀器廠）；生化培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；超聲波清洗機（深圳市潔康洗凈電器有限公司）；移液槍（大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司）。

1.2 材料

藥品及試劑：鼠尾草酸（純度99.2%）：粗品（純度70%）由海南舒普生物科技有限公司友情贈送，并經(jīng)課題組參考文獻方法純化制備[13]；α-倒捻子素（成都普思生物科技股份有限公司，純度＞98%）；硫酸慶大霉素（上海源葉生物科技有限公司，USP級，590 u/mg）；多西環(huán)素（USP級，純度＞88%～94%）和羅紅霉素（USP級，＞940 u/mg）（生工生物工程（上海）股份有限公司）；阿扎霉素F由實驗室分離制備，純度98.2%，已廣泛用于相關(guān)試實驗研究；分析純二甲基亞砜（西隴科學(xué)股份有限公司），水為超純水。

培養(yǎng)基：稱取酸水解酪蛋白17.5 g，可溶性淀粉1.5 g，牛肉浸膏3 g，1000 mL超純水，用1 mol/L?NaOH調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，分裝至50 mL錐形瓶中，121℃高壓滅菌20 min，得MHB培養(yǎng)基，置于超凈工作臺中冷卻備用。上述MHB培養(yǎng)基的配制過程中添加17.0 g瓊脂粉，同樣操作滅菌后倒平板，即得MHA培養(yǎng)基。

指示菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 25923源于美國典型培養(yǎng)物保藏中心；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA 01由中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院提供，已廣泛用于本課題組的抗菌活性研究[13，15，17]。

2 方法

2.1 菌懸液的制備

將保存于斜面的菌株用MHA平板活化，從平板中用接種針沾取菌種，接種于20 mL MHB液體培養(yǎng)基中，置160 r/min的搖床上，37℃培養(yǎng)5～7 h，用MHB培養(yǎng)基稀釋，得濃度為1×106 CFU/mL的菌懸液，用于測定試藥的最低抑菌濃度及聯(lián)合抗菌效果，菌懸液制備30 min后不可使用。

2.2 供試藥液的配制

稱取硫酸慶大霉素適量，分別用無菌MHB培養(yǎng)基配制成濃度為512 μg/mL的供試藥液；稱取多西環(huán)素、羅紅霉素、鼠尾草酸、阿扎霉素F和α-倒捻子素適量，先用適量二甲基亞砜（DMSO）溶解，再分別用無菌MHB培養(yǎng)基倍半稀釋制得512 μg/mL的供試藥液（DMSO濃度低于5%）；另外，用無菌MHB培養(yǎng)基配制濃度為5%的DMSO溶液，作為溶劑對照。

2.3 最低抑菌濃度（MIC）的測定

參考文獻方法[15，17]，設(shè)置不同藥物實驗組、溶劑對照組和空白對照組，采用微量肉湯稀釋法進行實驗。主要過程如下：在96孔板上，采用倍半稀釋法，用無菌MHB培養(yǎng)基制得系列濃度為256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/mL的藥液100 μL；空白對照組的每孔入100 μL無菌MHB培養(yǎng)基。最后，往所有操作孔中加入100 μL菌懸液（1×106 CFU/mL），蓋緊96孔板，35℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果，無肉眼可見細菌生長的最低藥物濃度即為該藥對測試菌株的MIC。

2.4 聯(lián)合抗菌作用的測定

參考文獻[15，17]，運用棋盤格法設(shè)計試驗，采用微量肉湯稀釋法，測定鼠尾草酸、α-倒捻子素分別聯(lián)合羅紅霉素、多西環(huán)素、阿扎霉素F、硫酸慶大霉素的抗金黃色葡萄球菌效果。以鼠尾草酸與羅紅霉素的聯(lián)合抗菌測定為例，具體過程如下：采用倍半稀釋法，根據(jù)各藥物對特定金黃色葡萄球菌菌株的MIC，分別配制濃度范圍為4 MIC～1/16 MIC的各測試藥物溶液；然后在96孔細菌培養(yǎng)板上，除A行和1列的孔中分別單獨加入設(shè)計濃度的鼠尾草酸和羅紅霉素溶液各50 μL外，其余各孔分別加入設(shè)計濃度的鼠尾草酸和羅紅霉素溶液各50 μL；然后除A行和1列的孔中加入50 μL外，其余各孔均加入100 μL稀釋的指示菌菌懸液（1×106 CFU/mL），蓋緊96孔板，35℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察結(jié)果。無肉眼可見細菌生長的最低藥物濃度即為兩藥對測試菌株的聯(lián)合MIC，聯(lián)合用藥的部分抑菌濃度指數(shù)（FICI）的計算公式為：

其中，MICA聯(lián)合和MICB聯(lián)合為A和B聯(lián)用時最低抑菌濃度中A和B的濃度；MICA單獨和MICB單獨即為A和B單用時各自的最低抑菌濃度；A為羅紅霉素、多西環(huán)素、阿扎霉素F或硫酸慶大霉素，B為鼠尾草酸或α-倒捻子素。判斷聯(lián)用效果的標(biāo)準(zhǔn)為：FICI≤0.5，協(xié)同作用；0.5＜FICI≤4，無關(guān)作用；FICI＞4，拮抗作用。

3 結(jié)果

3.1 最低抑菌濃度（MIC）

各測試藥物的MIC結(jié)果見表1，鼠尾草酸和α-倒捻子素對敏感和耐藥金黃色葡萄球菌S. aureus ATCC 25923和MRSA 01均表現(xiàn)出較強的抗菌活性，尤其是α-倒捻子素的抑菌活性更為顯著，其對敏感和耐藥金黃色葡萄球菌的MIC均為0.5 μg/mL。

3.2 聯(lián)合抗菌作用

運用棋盤格法設(shè)計試驗，采用微量肉湯稀釋法，在96孔細菌培養(yǎng)板上測定鼠尾草酸、α-倒捻子素分別聯(lián)合羅紅霉素、多西環(huán)素、阿扎霉素F、硫酸慶大霉素的抗金黃色葡萄球菌作用，結(jié)果見表2。由表可知：在測試的藥物聯(lián)合中硫酸慶大霉素僅與α-倒捻子素或鼠尾草酸有協(xié)同增效的效果，而且硫酸慶大霉素與鼠尾草酸只對耐藥金黃色葡萄球菌具有協(xié)調(diào)增效的作用，對敏感菌S. aureus ATCC25923呈現(xiàn)無關(guān)的作用（FICI為0.62），其余藥物的聯(lián)合用藥均表現(xiàn)為無關(guān)作用（0.62≤FICI≤1.25）。

4 討論

隨著抗菌藥物抗藥性形勢的日益嚴峻，植物來源的抗菌天然產(chǎn)物研究不斷增加，很多植物天然產(chǎn)物雖然抗菌效果不如臨床抗生素顯著，但由于它們中很多來源于人們?nèi)粘５乃卟撕筒妥里嬍?，因而安全性相對較高；同時有些化合物還可增強臨床抗生素的抗菌效果、逆轉(zhuǎn)其抗藥性等。所以，有關(guān)植物源抗菌天然產(chǎn)物與抗生素的聯(lián)合用藥研究逐漸受到重視。鼠尾草酸為從迷迭香中分離得到的食品抗氧化劑，α-倒捻子素為從水果山竹中分離得到的天然產(chǎn)物，兩者均具有良好的安全性[18-19]。課題組對兩化合物聯(lián)合不同作用機制抗生素的抗菌效果進行研究，發(fā)現(xiàn)靶向細胞膜的鼠尾草酸和α-倒捻子素均與作用于細菌核糖體復(fù)合物、干擾蛋白質(zhì)合成及影響細胞膜的慶大霉素具有較強的協(xié)同抗金黃色葡萄球菌作用，但與其它作用于細胞膜的阿扎霉素F和作用于核糖體的羅紅霉素和多西環(huán)素等顯示無關(guān)作用。

課題組前期發(fā)現(xiàn)在作用于同一代謝途徑不同代謝位點的抗菌藥物中發(fā)現(xiàn)協(xié)同抗菌藥物組合的概率較大[15]，而非傳統(tǒng)認為不同作用機制抗菌藥物聯(lián)合產(chǎn)生協(xié)同的可能性較大。其結(jié)論和發(fā)現(xiàn)得到了Brochado等[16]學(xué)者深入證明，然而植物抗菌天然產(chǎn)物與抗生素聯(lián)用的效果是否也與這一規(guī)律吻合有待進一步研究。因此，課題組選用報道較多的鼠尾草酸和α-倒捻子素為對象，對其聯(lián)合不同作用機制的抗菌效果進行研究。盡管此兩個化合物與抗生素的聯(lián)合用藥有一定報道，但有些報道之間結(jié)論相差較大[18，20-24]，本研究結(jié)果表明：在8個組合物中僅2個組合物有協(xié)同增效的聯(lián)合抗菌效果，而且僅1個組合物對所有測試菌株有協(xié)同抗菌作用。雖然其結(jié)果與某文獻報道的結(jié)論稍有不同[18]，但總體結(jié)論一致，并與課題組前期的研究結(jié)果共同證明上述抗生素聯(lián)合應(yīng)用效果規(guī)律的科學(xué)性和合理性[13]。雖然這兩個植物天然產(chǎn)物的具體抗菌機制尚未完全闡明，但從文獻報道可知[18，25]：鼠尾草酸和α-倒捻子素均可靶向細胞膜，并分別抑制藥物的外排泵和損傷細胞膜。而慶大霉素通過細胞膜后則不僅可與核糖體復(fù)合物結(jié)合干擾蛋白質(zhì)的合成，還可由此導(dǎo)致無功能異常蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，這些蛋白與細胞膜結(jié)合后，最終可引起細胞膜的破裂和滲透性增加。對于極性非常強、水溶性高的慶大霉素來說，跨細胞膜過程是其限速步驟。由此可以推斷：鼠尾草酸或α-倒捻子素聯(lián)合慶大霉素產(chǎn)生協(xié)同的效果，可能與其均可作用于細胞膜有關(guān)，而這種多重細胞膜損傷又促進了慶大霉素的跨膜過程，并與異常蛋白的產(chǎn)生和對膜的損傷形成放大效應(yīng)，從而產(chǎn)生了協(xié)同增效的效果。所以，兩者聯(lián)合后涉及對膜蛋白合成、正常膜蛋白在細胞膜上的插入及膜蛋白生理功能賴以發(fā)揮的膜穩(wěn)態(tài)環(huán)境這一細胞代謝過程的干擾，故在某種程度上進一步支持了課題組和Brochado等發(fā)現(xiàn)的聯(lián)合用藥效果方面的規(guī)律。

鼠尾草酸、α-倒捻子素和阿扎霉素F均可損傷金黃色葡萄球菌的細胞膜，和傳統(tǒng)觀點一樣，三者具有相同的作用機制，呈現(xiàn)非協(xié)同效果的概率大；盡管它們損傷細胞膜的具體機制（尚不明確）可能不同，但鼠尾草酸、α-倒捻子素與阿扎霉素F作用于細胞膜的具體機制在代謝途徑上有無相關(guān)性尚不能確定。同時，鼠尾草酸和α-倒捻子素還可抑制藥物的外排泵，阿扎霉素F還可靶向金黃色葡萄球菌的胞外毒力因子脂磷壁酸[26]，雖然兩者屬于不同的作用機制，但兩者之間也無明顯的相關(guān)性，所以鼠尾草酸、α-倒捻子素與阿扎霉素F聯(lián)合不屬于同一代謝途徑的不同位點，呈現(xiàn)非協(xié)同的概率較大，這與本研究的實驗結(jié)果相吻合。由此，從反面進一步支持了課題組和Brochado等發(fā)現(xiàn)的聯(lián)合用藥效果方面的規(guī)律。

不同藥物對同一病原菌不同菌株的MIC不同，耐藥菌株也只是針對特定結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)類型的藥物或幾類藥物來說的，并非對所有藥物都產(chǎn)生耐藥。這可以解釋表1中表現(xiàn)出來的鼠尾草酸對耐藥金黃色葡萄球菌MRSA 01較敏感菌S. aureus ATCC25923更敏感。鼠尾草酸聯(lián)合硫酸慶大霉素的協(xié)同抗菌試驗表明：兩者聯(lián)合應(yīng)用對其較為敏感的MRSA 01可以產(chǎn)生協(xié)同抑菌效果，而對S. aureus ATCC25923則表現(xiàn)為無關(guān)的聯(lián)合抗菌效果，這一現(xiàn)象進一步支持了課題組前期報道的推斷[15]，即兩藥聯(lián)合應(yīng)用時對敏感菌株較對不敏感或耐藥菌株產(chǎn)生協(xié)同抗菌效果的可能性更大。

文獻報道顯示[18]，α-倒捻子素具有很強的抗金黃色葡萄球菌活性，且與多種結(jié)構(gòu)類型的抗菌藥物對測試革蘭陽性菌顯示無關(guān)的聯(lián)合抗菌作用，本文研究結(jié)果與文獻報道的總體相似，與多數(shù)抗生素的聯(lián)合顯示無關(guān)的抗菌作用。明顯不同的是，本研究中α-倒捻子素與氨基糖苷類的硫酸慶大霉素聯(lián)用時顯示出明顯的協(xié)同抗金黃色葡萄球菌作用。這可能與不同菌株對藥物的敏感度及其藥物聯(lián)用效果的不同有關(guān)，這點在聯(lián)合用藥研究中比較常見[13，15]。

在抗菌藥物聯(lián)合應(yīng)用的研究中，課題組發(fā)現(xiàn)無論聯(lián)合用藥的效果是協(xié)同、無關(guān)，還是拮抗，按照突變選擇窗理論，一個藥物均可通過增加其用量窄化另一個藥物的突變選擇窗[15]；同時很多植物天然產(chǎn)物安全性相對較高。因此，課題組在IC2AR 2019國際學(xué)術(shù)會議上提出[27]：選擇作用安全性較好的植物抗菌天然產(chǎn)物與抗菌藥物進行聯(lián)合用藥，無論協(xié)同與否，最好是協(xié)同，通過增加聯(lián)合用藥時植物天然產(chǎn)物的比例和用量窄化臨床抗菌藥物的突變選擇窗，以減少或避免抗菌藥物的耐藥，延緩細菌耐藥的演變和發(fā)展。由此，本研究不僅獲得了具有顯著協(xié)同抗菌的藥物組合α-倒捻子素/硫酸慶大霉素，還獲得了針對不同菌株既可顯示協(xié)同，又可顯示無關(guān)作用的抗菌組合物鼠尾草酸/硫酸慶大霉素，從而為聯(lián)合用藥規(guī)律的進一步研究打下了基礎(chǔ)。

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