■ 文｜珠海市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展中心 于方兆 盤潤洪 李望東 李勇 楊會兵 郭建誼

中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 朱克誠 郭華陽 劉寶鎖 張殿昌

一、前言

黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus），在分類學(xué)上隸屬于魚綱（Pisces），鱸形目（Perciformes），鯛科（Sparidae ），棘鯛屬（Acanthopagrus），廣泛分布于紅海、阿拉伯海、印度洋、西太平洋沿岸和中國臺灣、福建、廣東、廣西沿海。黃鰭棘鯛通常在靠近岸邊的海域和河口灣生活，為雜食性魚類，是國內(nèi)一種重要經(jīng)濟(jì)魚類。但黃鰭棘鯛從魚苗到成年所需的養(yǎng)殖周期較長，一般要經(jīng)過一年至一年半培養(yǎng)，才能成長到上市規(guī)格。近些年來，因?yàn)檫^度捕撈、環(huán)境污染等情況使得黃鰭棘鯛自然種群物種質(zhì)量出現(xiàn)嚴(yán)重衰退問題；同時由于黃鰭棘鯛養(yǎng)殖群體的近親繁殖、小規(guī)格親本人工育苗等原因，令養(yǎng)殖的黃鰭棘鯛種群物種質(zhì)量退化程度更嚴(yán)重，免疫力下降，養(yǎng)殖黃鰭棘鯛利潤減少等，因此急需進(jìn)行黃鰭棘鯛的良種選育工作。分子標(biāo)記輔助選擇育種是目前常用的物種選育手段之一，與目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的分子標(biāo)記可以用來對目標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，可以明確候選的分子標(biāo)記與個體表型間的關(guān)系，進(jìn)一步縮短育種年限。

水產(chǎn)養(yǎng)殖收益的檢驗(yàn)指標(biāo)之一是種群的生長速率，其受到物種本身的基因型和生存環(huán)境的影響，不同的基因型可能會改變蛋白質(zhì)的表達(dá)速度和數(shù)量，而處于溫度過高或過低、食物匱乏的環(huán)境中生存的生物無法以最大生長速度生長。環(huán)境可能會抑制魚類的生長速率，但魚類的最大生長潛力最終由基因型決定。隨著生物技術(shù)的不斷創(chuàng)新發(fā)展和遺傳學(xué)的深入研究，可以選擇分子標(biāo)記輔助選擇育種方法選擇魚類與其它物種的優(yōu)良性狀，提高后代生長速率。近年來分子標(biāo)記輔助選擇育種方法在全世界興盛，它通過利用已知功能的候選基因間接選擇目標(biāo)性狀，挑選得到目的性狀的基因型，結(jié)合傳統(tǒng)育種手段選育出帶有目的性狀品種。與傳統(tǒng)育種相比，它能更方便且準(zhǔn)確地選擇隱性的優(yōu)良性狀，具有選擇準(zhǔn)確度高、育種年限短、受環(huán)境影響小等一系列的優(yōu)點(diǎn)。

單核苷酸多態(tài)性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是一種遺傳標(biāo)記，SNP具有許多特點(diǎn)，一是數(shù)量多且分布廣泛。就人類基因組而言，SNP遍布整個基因組中，幾乎每1900bp的片段中就會包含一個SNP位點(diǎn)，正是由于數(shù)量巨大的SNP，從而彌補(bǔ)了基因組多態(tài)性的不足。二是富有代表性，一些SNP位于基因內(nèi)部編碼區(qū)，這些位點(diǎn)的不同分型可能對基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能，這類SNP可作為目標(biāo)性狀的分子選育位點(diǎn)。三是檢測方法簡單，規(guī)?；瘜?shí)驗(yàn)及檢測自動化方面要求低，可以大大縮短工作時間。SNP的堿基類型只有兩種，即雙等位基因。由于SNP具有雙等位基因的特性，在對SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測時只需對其兩種堿基進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，不需要把其所在DNA片段整段測序分析。四是遺傳穩(wěn)定性高，SNP是單核苷酸突變，突變率較低，與微衛(wèi)星等重復(fù)序列標(biāo)記相比，具有更高的遺傳穩(wěn)定性，因此被廣泛應(yīng)用于和水產(chǎn)動物生長性狀相關(guān)聯(lián)的研究中。本研究篩選得到黃鰭棘鯛MSTN1基因中分型穩(wěn)定、多態(tài)性好的SNP位點(diǎn)，并與黃鰭棘鯛生長性狀作關(guān)聯(lián)性分析，為黃鰭棘鯛分子標(biāo)記輔助育種進(jìn)程及生長性狀相關(guān)基因研究提供理論基礎(chǔ)。

二、材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)材料

黃鰭棘鯛（平均體重26.88±7.21g，平均體長10.08±0.96cm）來源于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地。

（1）實(shí)驗(yàn)所需儀器

本研究使用的儀器包括超低溫保存箱（DW-86L338J，青島海爾股份有限公司）、冰箱（BCD-205TBDZ，青島海爾股份有限公司）、不同最大量程的移液槍（Eppendorf）、渦旋振蕩儀（Vortex-Genie2，美國SI儀器公司）、微量離心機(jī)（Legend Micro21，賽默飛世爾科技公司）、分析天平（ClassicL，梅特勒-托利多公司）、電熱恒溫水槽（DK-8D，上海一恒科技有限公司）、高速冷凍離心機(jī)（Multifuge X1R，賽默飛世爾科技公司）、電子秤（YH-C，上海英衡電子秤有限公司）、電泳儀（DYY-6C，北京六一生物科技有限公司）、梯度PCR儀（MastercyclerRep gradient S，Eppendorf）、拍48核酸提取儀（上海玉博生物科技有限公司）、全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（Tanon3500，上海天能公司）、燒烤型微波爐（LG）、高壓滅菌鍋（GR85DR，Zealway）、-25℃醫(yī)用低溫箱（DW-YL270，中科美菱）。

（2）實(shí)驗(yàn)所需耗材和試劑

本研究使用的試劑和耗材包括磁珠法DNA提取試劑盒（D6310-0 3 B，上海玉博生物科技有限公司）、6×Loading Buffer（9156，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）、DL2,000DNAMarker（3427A，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）、無水乙醇（廣州普博公司）、Gelred核酸染料（廣州普博公司）、TB GreenRPremix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）（RR820A，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）、不同量程移液槍槍頭等耗材（北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司）、瓊脂糖（111860，上海微科生物技術(shù)有限公司）等。

2.實(shí)驗(yàn)方法

（1）用于進(jìn)行生長性狀關(guān)聯(lián)性分析研究的樣品采集

隨機(jī)挑選健康的，有活力的，同池塘養(yǎng)殖的黃鰭棘鯛171尾，測量其體長、體重等數(shù)據(jù)，做好記錄后取其尾鰭放入裝有無水乙醇的樣品瓶中，并做好標(biāo)記。

（2）黃鰭棘鯛DNA的提取

取浸泡在無水乙醇中的黃鰭棘鯛尾鰭樣品，用吸水紙擦干后剪下20mg樣品放入1.5mL離心管中用剪刀剪碎，后續(xù)提DNA操作用拍48核酸提取儀按上海玉博生物科技有限公司的磁珠法DNA提取試劑盒說明書的步驟提取DNA。將提取后的DNA溶液用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析凝膠條帶，檢查DNA的提取質(zhì)量。

（3）MSTN1基因擴(kuò)增和測序

基于黃鰭棘鯛基因組序列，應(yīng)用 Primer5軟件設(shè)計(jì)多對引物擴(kuò)增 MSTN基因（表1），研究采用100μL反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，含 2×PCRMIX50μL，正反向引物各2μL，DNA模板6μL，ddH2O40μL。實(shí)驗(yàn)開始前先進(jìn)行溫度梯度PCR確定引物的最適退火溫度，PCR反應(yīng)設(shè)置信息：先在94℃下預(yù)變性4min；按此設(shè)置循環(huán)30次：94℃變性40s，最適溫度退火40s，72℃延伸90s；循環(huán)結(jié)束后在72℃下延伸10min（若擴(kuò)增片段長度<600kb，設(shè)置改為：94℃預(yù)變性4min；按94℃變性30s，最適溫度退火30s，72℃延伸40s的時長循環(huán)30次；最后72℃延伸10min），延伸結(jié)束后在4℃保存。將PCR擴(kuò)增結(jié)束后的DNA溶液用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，分析凝膠條帶，隨后將pcr產(chǎn)物送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 本研究所設(shè)計(jì)引物的相關(guān)信息

（4）SNP位點(diǎn)的篩選和分型

根據(jù)體重?cái)?shù)據(jù)，將10份黃鰭棘鯛大魚DNA樣品和10份小魚DNA樣品進(jìn)行 PCR擴(kuò)增和測序后，用ClustalX軟件比對測序結(jié)果，篩選MSTN1基因中多態(tài)性較高的位點(diǎn)。根據(jù)篩選出的SNP位點(diǎn)，用Chromas軟件查看位點(diǎn)所在位置的測序峰圖，并對該位點(diǎn)進(jìn)行分型?；蛐透鶕?jù)峰圖決定，當(dāng)峰圖為單峰或雙峰中低峰峰值高度不到高峰一半時，此位點(diǎn)基因型認(rèn)定為是純合；當(dāng)雙峰中低峰峰值高度達(dá)到或超過高峰峰值的一半時，此位點(diǎn)基因型則認(rèn)定為是雜合（圖1）。

圖1 MSTN1 SNP819位點(diǎn)三種基因型峰圖

（5）SNP位點(diǎn)和生長性狀的關(guān)聯(lián)性分析

根據(jù)黃鰭棘鯛基因組序列設(shè)計(jì)包含SNP位點(diǎn)的短擴(kuò)增引物（表1），對用于性狀關(guān)聯(lián)性分析的171份黃鰭棘鯛DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增和測序。重復(fù)上述步驟后，利用excel表格記錄每個SNP位點(diǎn)在樣品序列中的位置和對應(yīng)的基因型。使用SPSS Statistics軟件對SNP位點(diǎn)與黃鰭棘鯛各項(xiàng)生長性狀進(jìn)行單因素ANOVA（one-way ANOVA）分析，分析與各項(xiàng)生長性狀間是否存在顯著性差異（P<0.05）。

三、結(jié)果與分析

1.基因組DNA質(zhì)量

提取的黃鰭棘鯛鰭條的基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，部分樣品的電泳檢測結(jié)果見圖2。圖中可見提取的基因組DNA條帶明顯且無拖帶現(xiàn)象，完整性較好，沒其它雜帶，提取結(jié)果優(yōu)良。

圖2 黃鰭棘鯛部分樣品DNA電泳結(jié)果圖

2.黃鰭棘鯛MSTN1基因多態(tài)性與生長性狀關(guān)聯(lián)性分析

采用上述引物擴(kuò)增來獲得黃鰭棘鯛MSTN1全長序列，混池測序發(fā)現(xiàn)MSTN1基因的內(nèi)含子存在1個SNP位點(diǎn)，將其命名為SNP819。

再以M1-SNP-R1/L1的引物對進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠圖中有均一條帶的樣品進(jìn)行測序。根據(jù)測序峰圖判斷潛在的SNPs位點(diǎn)，接著隨機(jī)選取養(yǎng)殖的黃鰭棘鯛個體171尾，并進(jìn)行基因分型。

經(jīng)過線性模型分析后，SNP819位點(diǎn)不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果如表2中所示。

表2 SNP819 位點(diǎn)不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

綜上所述，從表1 中可知，自5’端起第819位，其堿基為A或T的SNP位點(diǎn)的AA和AT基因型個體的軀干長大于TT基因型個體（P<0.05）；SNP位點(diǎn)的AA和AT基因型個體的尾長大于TT基因型個體（P<0.01）；SNP位點(diǎn)的AA和AT基因型個體的體長大于TT基因型個體（P<0.01）；SNP位點(diǎn)的AA和AT基因型個體的尾鰭長大于TT基因型個體（P<0.05）；SNP位點(diǎn)的AA和AT基因型個體的全長大于TT基因型個體（P<0.01）。

肌肉生長抑制基因（Myostatin）是控制動物骨骼肌生長的主要基因，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族，并包含TGF-β前肽域和TGFB域，MSTN基因通過抑制生肌決定因子（MyoD）的轉(zhuǎn)錄活性抑制肌細(xì)胞增殖和分化，限制肌纖維的數(shù)量和大小。該基因最先從小鼠骨骼肌的cDNA文庫中篩選獲得。當(dāng)MSTN基因發(fā)生突變會導(dǎo)致肌細(xì)胞增生、肌纖維肥大，比如敲除MSTN基因的斑馬魚的肌肉比對照組的明顯發(fā)達(dá)；向大黃魚幼魚注射MSTN1前肽基因其增重率顯著降低。此外還有真鯛、金頭鯛等均發(fā)現(xiàn)MSTN基因中突變位點(diǎn)與生長性狀之間存在著相關(guān)性。

采用單因素方差分析不同基因型（頻率低于2.5%的基因排除）與生長性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明，MSTN1 SNP819中TT基因型體長和全長顯著小于 AT和 AA基因型，為劣勢基因型。因此，本結(jié)果表明SNP-819位點(diǎn)可應(yīng)用于以快速生長為目標(biāo)的黃鰭棘鯛育種材料早期篩選，能夠有效提高育種的效率和縮短育種年限。