郭 爽, 王 棟, 聶 蕾, 何 玥, 涂 亮, 劉鵬飛,郭向陽, 王安貴, 祝云芳, 吳 迅,3, 陳澤輝

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 貴陽 550025; 2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所, 貴陽 550006;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部喀斯特山區(qū)作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550006)

玉米作為重要的糧食、飼料和工業(yè)原料作物,在社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。開花期相關(guān)性狀是植物響應(yīng)環(huán)境變化的關(guān)鍵性狀,在植物繁衍和適應(yīng)生態(tài)環(huán)境等方面都具有非常重要的作用[1],不同玉米品種對光照長度的響應(yīng)存在差異,表現(xiàn)出在長短日照條件下的開花期差異,如大部分熱帶玉米種質(zhì)在熱帶地區(qū)能正常開花,而到了溫帶地區(qū)則出現(xiàn)徒長不能正常開花結(jié)實(shí)的現(xiàn)象,也是熱帶玉米引種溫帶種植迫切需要解決的關(guān)鍵問題。植物花發(fā)育的過程一般要?dú)v經(jīng)開花誘導(dǎo)、花原基形成、花器官發(fā)育這3個階段[2]。玉米開花誘導(dǎo)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)主要分(光周期途徑、自主途徑、赤霉素途徑和年齡途徑)4個途徑[1],其作為典型的數(shù)量性狀,遺傳方式復(fù)雜且受環(huán)境影響嚴(yán)重。為了探究玉米開花期性狀的遺傳規(guī)律,多數(shù)研究者圍繞開花期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位和基因挖掘,以提高育種選擇效率。侯清桂等[3]以豫86×豫M1-7構(gòu)建的RIL群體為材料,對玉米開花期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL分析,共鑒定到48個開花期性狀相關(guān)的QTLs,包括18個抽雄期QTLs、16個吐絲期QTLs和14個散粉期QTLs。這些QTLs在除第4號和第8號染色體外的其他染色體上都有分布,其中單個QTL表型貢獻(xiàn)率在1.67%～20.33%之間。王迪等[4]以自交系齊319和掖478分別與黃早四雜交構(gòu)建的230個和235個F2∶3家系為材料,利用完備區(qū)間作圖方法,對不同生態(tài)環(huán)境玉米花期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位,其中在玉米Q/H群體的10個連鎖群上共定位到了85個QTLs,有30個QTLs在Y/H群體被檢測到,并呈現(xiàn)成簇分布。因此,較多研究者利用經(jīng)典遺傳學(xué)方法,通過數(shù)量性狀基因組(QTL)初步定位、精細(xì)定位,最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的圖位克隆。眾多學(xué)者也鑒定出一批與玉米開花相關(guān)的重要基因,如ZmCCT[5],Vgt1[6]、ZCN8[7]、Dwarf[8]和ZmCCT9[9]等。高媛等[10]在對Suwan種質(zhì)代表性自交系T32和QR273的開花相關(guān)基因差異表達(dá)模式的研究中發(fā)現(xiàn),長日照條件開花促進(jìn)基因ZmCOL、ZmELF4、ZmGI、ZmHd1、ZmHd6、ZCN8在光鈍感系QR273中的相對表達(dá)量顯著高于光敏感系T32;開花抑制基因ZmCCT9、ZmCCT10的相對表達(dá)量則顯著低于T32。這些研究為深度解析玉米開花相關(guān)性狀變異的遺傳機(jī)制以及育種改良利用提供了依據(jù)。綜上所述,針對開花期相關(guān)性狀定位到的QTL在數(shù)量、位置、基因效應(yīng)上因所用材料、標(biāo)記等不同而存在差異,玉米開花期性狀遺傳基礎(chǔ)和基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)較為復(fù)雜。因此,本研究通過選用熱帶種質(zhì)選育骨干親本QR273和T32為親本構(gòu)建的150份F2和F2∶3分離家系為材料,基于簡化基因組測序(GBS)技術(shù)對F2單株進(jìn)行基因型鑒定,同時對該群體的F2∶3家系進(jìn)行多個環(huán)境開花期相關(guān)性狀評價(jià),利用完備區(qū)間作圖法對開花期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL定位。在此基礎(chǔ)上,利用生物信息分析方法篩選玉米開花期相關(guān)的候選基因,為基于分子輔助的玉米開花期性狀改良提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以熱帶種質(zhì)選育玉米骨干親本QR273和T32為親本,構(gòu)建包含150個家系的F2、F2∶3家系為材料。T32是貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱糧研究所從Suwan種質(zhì)中選育而成的骨干自交系,表現(xiàn)為光周期敏感特點(diǎn),即在長日照地區(qū)會出現(xiàn)開花期延遲甚至不能正常開花結(jié)實(shí)等現(xiàn)象;QR273是以Suwan群體作基礎(chǔ)材料,經(jīng)過5年8代自交選育而成的優(yōu)良玉米骨干自交系,表現(xiàn)為光周期鈍感的特點(diǎn),即在長、短日照條件下均表現(xiàn)為正常開花結(jié)實(shí)的特征。

1.2 田間試驗(yàn)及測定方法

2021年10月,將構(gòu)建的F2分離群體與親本種植于海南省三亞市,對幼苗5葉期的單株進(jìn)行取樣,并采用改良CTAB法對DNA進(jìn)行提取,隨后DNA質(zhì)量檢測和GBS測序委托北京康普生生物有限公司完成,具體過程參照吳迅等[7]的方法。同時對F2植株進(jìn)行單株自交后可獲得F2∶3家系種子。

2022年4月以及2022年10月,將F2∶3群體以及親本材料分別種植于貴州省貴陽市、甘肅省張掖市和海南省三亞市,材料的種植采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),2次重復(fù),行長3 m,行距0.65 m。田間管理的方式與當(dāng)?shù)匾恢?。田間調(diào)查玉米抽雄期、散粉期、吐絲期,性狀評價(jià)參考石云素等[11]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過Excel軟件對表型數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分別計(jì)算3個環(huán)境下親本與不同家系的抽雄期、散粉期、吐絲期的平均值、變異系數(shù)、偏度、峰度、方差等,并進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 QTL定位與候選基因預(yù)測

對獲得的SNP標(biāo)記進(jìn)行篩選,刪除等位基因頻率MAF<0.05的SNP位點(diǎn)后,共獲得68 994個高質(zhì)量SNP標(biāo)記可用于后續(xù)分析。利用IciMapping4.1軟件中的完備區(qū)間作圖法(ICIM)對3個開花期相關(guān)性狀進(jìn)行QTL檢測。其中,作圖步長為1.00 cM,PIN為0.001,LOD閾值為2.50。根據(jù)3種環(huán)境中的定位結(jié)果和已報(bào)道的QTL相關(guān)信息,以是否存在重疊區(qū)域?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)對“一致性”QTL進(jìn)行判斷,若存在重疊區(qū)域,則認(rèn)為是“一致性”QTL[12]。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合B73參考基因組序列(RefGen_v4),查找在“一致性”QTL區(qū)間內(nèi)控制目標(biāo)性狀的候選基因,并結(jié)合基因功能注釋和已有研究報(bào)道,對關(guān)鍵候選基因進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1 開花期相關(guān)性狀數(shù)據(jù)分析

對開花期相關(guān)性狀的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,在張掖市和貴陽市,開花期相關(guān)性狀在基因型間表現(xiàn)出顯著差異。親本T32的抽雄期、散粉期、吐絲期的平均值均高于親本QR273。且這3個開花期相關(guān)性狀在不同家系間差異顯著。其開花期相關(guān)性狀的偏度和峰值的絕對值均小于1,符合正態(tài)分布,可作QTL定位分析(表1)。

表1 開花期相關(guān)性狀的描述性統(tǒng)計(jì)Table 1 The descriptive statistical of related traits at flowering stage

2.2 開花期性狀相關(guān)性分析

開花期相關(guān)性狀間的相關(guān)性分析結(jié)果列于表2。結(jié)果顯示,抽雄期與散粉期、吐絲期,散粉期與吐絲期在張掖市、貴陽市、三亞市三地均呈極顯著正相關(guān),說明3個開花期性狀通過相互協(xié)同作用促進(jìn)玉米生長發(fā)育的調(diào)控,這與劉穎等[13]研究結(jié)果一致。

表2 開花期性狀的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between related traits at flowering stage under three environments

2.3 SNP圖譜構(gòu)建

依據(jù)獲得的高質(zhì)量SNP標(biāo)記的物理圖譜,68 994個SNPs均勻地分布在染色體上(圖1)。各染色體上的標(biāo)記數(shù)量大小依次表現(xiàn)為Ch4、Ch2、Ch1、Ch3、Ch5、Ch8、Ch9、Ch7、Ch6、Ch10,其數(shù)量分別為8 901個、8 824個、8 725個、7 623個、7 174個、6 407個、5 782個、5 592個、5 432個、4 534個。

注:每一行代表一個SNP標(biāo)記,淺色表示標(biāo)記的密度較低,深色表示標(biāo)記的密度較高。圖1 遺傳圖譜Fig.1 Genetic map

2.4 控制開花期相關(guān)性狀的QTL

3個開花期相關(guān)性狀的QTL定位結(jié)果列于表3。結(jié)果顯示,3個環(huán)境下共檢測到98個開花期相關(guān)QTL,其中37個QTL與抽雄期相關(guān),分別位于1號、2號、5號、6號、7號、9號、10號染色體上,單個QTL的貢獻(xiàn)率在0.85%～12.43%之間,且12個QTL的增效基因來源于親本T32,23個QTL的增效等位基因來源于親本QR273;與散粉期有關(guān)的QTL27個,各個染色體上均有分布。單個QTL的貢獻(xiàn)率在3.29%～8.64%之間,且10個QTL的增效基因來源于親本T32,17個QTL的增效等位基因來源于親本QR273。

表3 玉米開花期相關(guān)性狀QTL定位結(jié)果Table 3 QTL mapping results of maize related traits at flowering stage

與吐絲期有關(guān)的QTL 30個,各個染色體上均有分布。單個QTL的貢獻(xiàn)率在1.78%～10.24%之間,其中有6個QTL的增效基因來源于親本T32,24個QTL的增效等位基因來源于親本QR273。共檢測到8個貢獻(xiàn)率大于8%的QTL,其中3個與抽雄期相關(guān),2個與散粉期相關(guān),3個與吐絲期相關(guān),分別位于第4號染色體上的142.2～142.4 Mb之間,第2號染色體上的5.3～5.8 Mb之間、第5號染色體上的115.2～115.4 Mb之間、第9號染色體上的76.4～76.6 Mb之間、第7號染色體上的55.0～55.1 Mb、第9號染色體上的76.4～76.6 Mb之間、第4號染色體上的133.1～133.2 Mb之間、第9號染色體上的88.0～89.1 Mb之間。

2.5 一致性QTL

通過比較不同環(huán)境下的QTL定位結(jié)果發(fā)現(xiàn),在第1,4,6,9號染色體上分別存在QTL富集區(qū)域即同一標(biāo)記區(qū)間影響多個目標(biāo)性狀。如在第1號染色體的68.0～68.3 Mb區(qū)間檢測到一個控制抽雄期和散粉期的QTL,在第4號染色體的63.2～63.4 Mb區(qū)間內(nèi)檢測到一個同時控制抽雄期和散粉期的QTL,在第4號染色體的133.1～134.1 Mb區(qū)間檢測到一個同時控制散粉期和吐絲期的QTL,在第6號染色體的129.3～129.5 Mb區(qū)間內(nèi)檢測到一個同時控制抽雄期和散粉期的QTL。在第9號染色體的76.5～76.6 Mb區(qū)間內(nèi)檢測到一個同時控制抽雄期和散粉期的QTL。與已公開QTL數(shù)據(jù)庫的比對發(fā)現(xiàn),本研究有8個檢測到的QTL與前人定位結(jié)果一致,分別控制抽雄期、散粉期和吐絲期的變異,可作為下一步精細(xì)定位的候選靶標(biāo)。

2.6 候選基因分析

結(jié)合Maize GDB數(shù)據(jù)庫的基因功能注釋信息以及前人的研究結(jié)果,對篩選出的8個一致性QTL進(jìn)行目標(biāo)候選基因分析,初步預(yù)測出12個候選基因與開花期相關(guān)(表4)。侯選基因中,Zm00001d052638、Zm00001d025735、Zm00001d025739、Zm00001d022350、Zm00001d005135參與編碼蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性。沈辰[14]通過實(shí)時定量PCR分析發(fā)現(xiàn),絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶基因在山核桃的多個器官中均有表達(dá),其中在花芽中表達(dá)量最高,且這些表達(dá)存在于山核桃雌花和雄花的整個發(fā)育過程。Zm00001d052585編碼苯丙素生物合成過程。武紹龍等[15]研究發(fā)現(xiàn),馬纓杜鵑花開花至代謝進(jìn)程中,苯丙素類代謝物表達(dá)量逐漸升高,表明苯丙素類代謝物表達(dá)可能與馬纓杜鵑花發(fā)育有關(guān),Zm00001d052637參與對激素的反應(yīng)。激素是調(diào)控植物生長發(fā)育重要的物質(zhì)之一,在植物的開花方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Zm00001d047632參與紅光、遠(yuǎn)紅光光傳導(dǎo),曹凱等[16]研究發(fā)現(xiàn),紅光與遠(yuǎn)紅光比值低的環(huán)境會抑制野生型番茄和phyB1突變體番茄開花。Zm00001d042717與乙烯激活的信號通路相關(guān),張華等[17]研究表明,75 mg/L乙烯利處理對植株花枝數(shù)、花朵數(shù)、始花期及開花總時長均有明顯的促進(jìn)作用。任小林等[18]研究發(fā)現(xiàn),秋施乙烯利可使牡丹的落葉期提前,萌芽期和開花期延遲,且顯著降低了開花率,減小了花徑,并且增加了畸形花的百分率。Zm00001d044325、Zm00001d003383均參與生長素激活的信號通路。也有研究表明,生長素對植物的開花具有影響。楊洪全等[19]研究發(fā)現(xiàn),光激活的CRY1和phyB能夠通過直接結(jié)合和穩(wěn)定AUX/IAA來抑制生長素信號通路,說明光和生長素可以拮抗調(diào)節(jié)AUX/IAA的穩(wěn)定性,從而平衡生長素和光對植物生長發(fā)育的影響。生長素能夠通過與細(xì)胞分裂素、茉莉素以及脫落酸之間的相互作用來共同影響植物的生長發(fā)育[20]。Zm00001d003379、Zm00001d042721參與脫落酸激活的信號通路,鄧全恩[21]用赤霉素對油茶花進(jìn)行處理時發(fā)現(xiàn),當(dāng)赤霉素濃度為400 mg/L時,油茶花始花期最早且盛花期集中,150 mg/L脫落酸處理時,始花期最晚;高英[22]對核桃花芽分化過程中脫落酸進(jìn)行原位分析發(fā)現(xiàn),由葉芽狀態(tài)向雌花芽轉(zhuǎn)化時,頂端分生組織中脫落酸的水平明顯降低,對生長素和脫落酸的進(jìn)行平衡分析后發(fā)現(xiàn)雌花芽的誘導(dǎo)需要較高水平的脫落酸/生長素。

表4 基因位置及功能注釋Table 4 The gene location and function annotation

3 結(jié)果與討論

本研究共定位到8個控制開花期相關(guān)性狀的一致性QTL,包括郭瑞[23]利用光周期敏感自交系CML288和光周期鈍感自交系黃早四為材料構(gòu)建F2∶3作圖群體,在第2號染色體和第9號染色體上分別檢測到1個與吐絲期相關(guān)的QTL和1個與抽雄期相關(guān)的QTL,對應(yīng)區(qū)間為26.1～120.3 Mb和127.0～139.5 Mb(B73RefGen_v4),本研究也在第2號染色體42.0～42.6 Mb和第9號染色體137.4～137.7 Mb分別定位到1個吐絲期QTL和1個散粉期QTL;郭瑞還利用光周期敏感自交系CML288和光周期鈍感自交系黃早四為材料構(gòu)建F2∶3作圖群體,在第2號染色體和10號染色體上分別檢測到2個與抽雄期相關(guān)的QTL,對應(yīng)區(qū)間為26.1～208.9 Mb和115.7～140.3 Mb(B73RefGen_v4);本研究也在第2號染色體160.4～160.5 Mb和第10號染色體127.7～128.2 Mb內(nèi)分別定位到1個散粉期QTL;魏海忠[24]以玉米自交系80007和80044衍生的包含355個家系的F9重組自交系(RIL)群為材料,采用SSR標(biāo)記在第3號染色體檢測到1個與散粉期相關(guān)QTL,對應(yīng)區(qū)間為224.5～225.3 Mb(B73 RefGen_v4);本研究在3號染色體225.2～225.3 Mb定位到1個散粉期QTL;李永明等[25]利用4個玉米自交系組配276/72//A188/交51四交群體,構(gòu)建了包含213個SSR分子標(biāo)記的遺傳連鎖圖譜在第3號染色體上和第7號染色體上分別檢測到1個與散粉期相關(guān)的QTL和1個與吐絲期有關(guān)的QTL,對應(yīng)區(qū)間為171.0～194.8 Mb和170.3～177.3 Mb(B73RefGen_v4);本研究在3號染色體178.1～178.4 Mb和第7號染色體175.8～176.1 Mb上也分別定位到1個散粉期QTL和1個吐絲期QTL。李志敏[26]在第4號染色體上檢測到1個與抽雄期相關(guān)的QTL,對應(yīng)區(qū)間為189.1～216.4 Mb(B73 RefGen_v4);本研究在第4號染色體195.2～195.5 Mb內(nèi)定位到了1個抽雄期QTL。由此推測這些一致性位點(diǎn)在玉米馴化過程中表達(dá)較穩(wěn)定,可作為進(jìn)一步精細(xì)定位并挖掘關(guān)鍵候選基因的候選靶標(biāo)。

除此之外,本研究還檢測出12個開花期相關(guān)的候選基因,主要參與激素合成、運(yùn)輸及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等,所編碼蛋白在作物生長發(fā)育過程中參與酶類調(diào)控和激素調(diào)節(jié)。與在山核桃、番茄等植物中的研究基本一致。研究結(jié)果能夠?yàn)楹罄m(xù)的精細(xì)定位與候選基因的圖位克隆提供新的靶標(biāo)。