王朝杰，張夢(mèng)迪，2，白圖雅，2，胡玉霞，2，3，李君，2，3，王蕾，蘇敏，楊帆，4，常福厚，2

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院，3.新藥安全評(píng)價(jià)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)新藥篩選工程研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010110；4.內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古包頭 014010）

糖異生是生物體將多種非糖物質(zhì)轉(zhuǎn)變成葡萄糖或糖原的過(guò)程，對(duì)維持空腹?fàn)顟B(tài)下血糖正常水平具有重要意義［1］。肝是人體糖脂代謝重要器官，是糖異生或糖原分解產(chǎn)生內(nèi)源性葡萄糖主要場(chǎng)所，糖異生受一系列轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中，果糖-1，6-二磷酸酶1（fructose-1，6-bisphosphatase 1，F(xiàn)BP1）、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1（phospho?enolpyruvate carboxykinase，PCK1）是糖異生限速酶，是糖異生途徑關(guān)鍵環(huán)節(jié)［2-5］。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族一員，主要在肝中表達(dá)，對(duì)肝糖代謝具有重要作用。研究表明，F(xiàn)GF21 過(guò)表達(dá)可促進(jìn)小鼠肝糖異生，增加肝葡萄糖含量［6］。

肝糖異生異?？蓪?dǎo)致多種代謝性疾病，與苯并芘（benzo[a]pyrene，BaP）和2，3，7，8-四氯二苯-p-二英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）等環(huán)境危險(xiǎn)因子密切相關(guān)。BaP 是存在于香煙煙霧中的一種典型的環(huán)境污染物，是芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）的配體，TCDD和BaP 均可誘導(dǎo)AhR 下游基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致毒性作用［7］。研究發(fā)現(xiàn)，TCDD 可以促進(jìn)AhR 與FGF21 啟動(dòng)子直接結(jié)合并誘導(dǎo)其表達(dá)，說(shuō)明FGF21 是AhR的直接靶標(biāo)［8］。Hoyeck 等［9］發(fā)現(xiàn)，暴露于TCDD 的小鼠胰島功能受損，加速了高血糖發(fā)生，誘發(fā)2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）。此外，實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，BaP 與AhR 結(jié)合可降低小鼠葡萄糖耐量和胰島素耐量［10］。但BaP 激活A(yù)hR 后對(duì)肝糖異生影響及其機(jī)制尚不明確。本研究主要觀察BaP 通過(guò)激活A(yù)hR 后對(duì)小鼠肝和HepG2 細(xì)胞中FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21表達(dá)的影響，探究BaP 對(duì)糖代謝的作用機(jī)制，為防治由環(huán)境污染物誘發(fā)的糖尿病及代謝性相關(guān)疾病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

BaP 粉末（Sigma 公司，美國(guó)）；BCA 蛋白定量分析試劑盒（Thermo Scientific 公司，美國(guó)）；總RNA 提取試劑盒（DP419）RNA simple Total RNA Kit〔天根生化科技（北京）有限公司，中國(guó)〕；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Rever Tra Ace qPCR RT Kit 和熒光定量檢測(cè)（SYBR Green）試劑盒QPK-201（Toyobo 公司，日本）；AhR 抑制劑CH223191（MCE 公司，中國(guó)）；一抗：兔抗小鼠FBP1 單克隆抗體、兔抗小鼠PCK1單克隆抗體、兔抗小鼠G6Pase單克隆抗體、兔抗小鼠FGF21 單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體（二抗）（Abcam 公司，英國(guó)）。DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；PBS（碧云天，中國(guó)）。

多模式微孔板檢測(cè)儀（Multiskan Mk3）（Perkin Elmer 公司，美國(guó)）；冷凍切片機(jī)（CM1850）高內(nèi)涵共聚焦微組織成像系統(tǒng)（PerkinElmer，美國(guó)）；組織研磨儀（天根生化科技有限公司，中國(guó)）；BIO-RAD基礎(chǔ)電泳儀〔伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司〕；熒光定量PCR 儀（PiKorea196）和臺(tái)式高性能離心機(jī)（Thermo fisher公司，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

60 只4～6 周齡C57BL/6 雄性小鼠，體重17～23 g（北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司），動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：SCXK（京）2020-0006，飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)中心。飼養(yǎng)環(huán)境為SPF 級(jí)，溫度為（24±1）°C，相對(duì)濕度（60±5）%，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，倫理批準(zhǔn)號(hào)為（YKD202002049）。人肝癌細(xì)胞株（HepG2）（北京協(xié)和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所）。

1.3 動(dòng)物和細(xì)胞分組及處理

①C57BL/6 小鼠普通飼料喂養(yǎng)7 d 后，分為5 組，每組12只，分別為正常對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（ig給予玉米油10 mL·kg-1）、BaP 0.90 和1.80 mg·kg-1組。給藥12周后，75%乙醇全身消毒，開(kāi)胸腔，剪開(kāi)心包膜，從左心室緩慢勻速推注10 mL生理鹽水，直到肝變白，停止推注，取肝。肝組織按照100 mg 組織加入4 ℃預(yù)冷組織細(xì)胞裂解液800 μL，使用電動(dòng)勻漿器在4 ℃勻漿，隨后4 ℃4000×g離心5 min，取上清。②HepG2 細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、BaP 0.1，1.0 和10.0 μmol·L-1。③HepG2 細(xì)胞分為細(xì)胞對(duì)照組、BaP 1μmol·L-1、CH223191 1 μmol·L-1、BaP 1 μmol·L-1+CH223191 1 μmol·L-1組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞，均勻鋪于6 孔板內(nèi)，加含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基后，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞密度至約60%后，按照分組加入相應(yīng)濃度藥物，以含10% FBS 的高糖DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.4 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)HepG2 細(xì)胞中FGF21 蛋白水平

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，均勻鋪于12孔板內(nèi)，取1.3 ②和③分組的細(xì)胞，待細(xì)胞匯合度達(dá)到約70%開(kāi)始進(jìn)行染色步驟。用新鮮配制的30%丙酮+70%甲醇固定液固定細(xì)胞10 min。磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3 遍，每次5 min。2%二抗同源血清封閉60 min，染色前加入1抗（抗FGF21，稀釋比為1∶250），4 ℃冰箱孵育，>18 h。PBS 洗3遍，每次5 min。避光加入PBS 配制的二抗（稀釋比為1∶1000），室溫（20～35 ℃）孵育45 min。避光PBS 洗4 遍，每次5 min。避光加入PBS 配制的0.5 mg·L-1DAPI 染色10 min 后避光用PBS 簡(jiǎn)單洗3 遍，去除多余的DAPI，洗完后加入少量PBS，用高內(nèi)涵共聚焦微組織成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，使用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度表示蛋白表達(dá)水平。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)肝組織和HepG2 細(xì)胞中肝糖異生相關(guān)分子mRNA表達(dá)水平

取1.3 ①～③分組處理的組織和細(xì)胞，使用Trizol 試劑提取總RNA，檢測(cè)RNA 純度及含量，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取適量cDNA 模板進(jìn)行qPCR。設(shè)定qPCR 儀程序?yàn)椋?5 ℃，30 s，95 ℃，5 s，60 ℃，10 s，72 ℃，15 s，40個(gè)循環(huán)；計(jì)算各組基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量（目的基因相對(duì)表達(dá)量分析方法基于2-△△Ct原理進(jìn)行）。每個(gè)樣本平行重復(fù)3 次，取平均值進(jìn)行分析。以β 肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)參對(duì)照，引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.6 Western 印跡法檢測(cè)肝組織和HepG2 細(xì)胞中肝糖異生相關(guān)分子蛋白表達(dá)水平

取1.3 ①～③分組處理的組織和細(xì)胞，用PBS將樣品洗滌3 次，加入含1 mmol PMSF 的RIPA 裂解液，提取全蛋白。采用BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)得其蛋白濃度。采用10% SDS-PAGE（150 V，2 h）電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗（抗FBP1、G6Pase，PCK1 和FGF21，稀釋比均為1∶1000）孵育過(guò)夜，沖洗掉一抗，再用二抗（抗β 肌動(dòng)蛋白，1∶1000）孵育1 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白質(zhì)，采用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)積分吸光度值。以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行分析。對(duì)于符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用±s表示，組間差異采用單因素方差分析法或非參數(shù)秩和檢驗(yàn)法進(jìn)行檢驗(yàn)，組間比較采用Dunnettt檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BaP對(duì)HepG2細(xì)胞中FGF21蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果如圖1 和圖2 所示，與細(xì)胞對(duì)照組進(jìn)行比較，BaP 0.1，1.0 和10.0 μmol·L-1處理HepG2 細(xì)胞后，F(xiàn)GF21 蛋白熒光強(qiáng)度顯著升高（P<0.01）。

Fig.1 Effect of benzo（a）pyrene（BaP）on FGF21 protein expression in HepG2 cells by immunofluorescence assay（×200）. HepG2 cells were treated with BaP for 24 h. B was the semi-quantitative result of A. Green fluorescence represents the protein expression of FGF21 and blue fluorescence indicates a DAPI-stained nucleus. FI：fluorense intensity. x±s，n=3. ＊＊P<0.01，compared with cell control group.

Fig.2 Effect of BaP and CH223191 on FGF21 protein expression in HepG2 cells by immunofluorescence assay（×200）. The cells were treated with BaP 1 μmol·L-1 or CH223191 1 μmol·L-1 for 24 h. B was the semi-quantitative result of A. ±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，compared with BaP group.

與細(xì)胞對(duì)照組相比，BaP 組HepG2 細(xì)胞中FGF21蛋白熒光強(qiáng)度顯著升高（P<0.01）；與BaP 1 μmol·L-1組相比，BaP 1 μmol·L-1+CH223191 1 μmol·L-1組HepG2 細(xì)胞中FGF21 蛋白熒光強(qiáng)度顯著降低（P<0.05）（圖2）。表明BaP 通過(guò)AhR 促進(jìn)FGF21蛋白表達(dá)。

2.2 BaP 對(duì)小鼠肝組織和HepG2 細(xì)胞中糖異生相關(guān)分子G6Pase，PCK1，F(xiàn)BP1 和FGF21 mRNA 表達(dá)的影響

2.2.1 小鼠肝組織

結(jié)果如表2 所示，與溶劑對(duì)照組相比，BaP 0.9和1.80 mg·kg-1組小鼠肝組織中的G6Pase，PCK1，F(xiàn)BP1和FGF21mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01），而B(niǎo)aP 0.45 mg·kg-1組小鼠肝組織中的G6Pase，PCK1，F(xiàn)BP1和FGF21mRNA表達(dá)無(wú)顯著變化。

Tab.2 Effect of BaP on mRNA expressions of FBP1，G6Pase，PCK1 and FGF21 in mouse liver tissue by real time quantitative PCR

2.2.2 HepG2細(xì)胞

表3結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BaP 1.0和10.0 μmol·L-1組G6Pase，PCK1，F(xiàn)BP1和FGF21mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05，P<0.01）。表4結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BaP 組FBP1，G6Pase，PCK1 和FGF21 mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.01），CH223191 組無(wú)顯著變化。與BaP 1.0 μmol ·L-1組相比，BaP 1 μmol·L-1+CH223191 1 μmol·L-1組FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21mRNA 表達(dá)均顯著降低（P<0.05）。

Tab.3 Effect of BaP on mRNA expressions of FBP1，G6Pase，PCK1 and FGF21 in HepG2 cells by real time quantita?tive PCR

Tab.4 Effect of BaP and CH223191 on mRNA expressions of FBP1，G6Pase，PCK1 and FGF21 in HepG2 cells by real time quantitative PCR

2.3 BaP對(duì)小鼠肝組織和HepG2細(xì)胞中糖異生相關(guān)分子G6Pase，PCK1，F(xiàn)BP1和FGF21蛋白表達(dá)的影響

2.3.1 小鼠肝組織

Western 印跡結(jié)果如圖3 所示，與正常對(duì)照組相比，BaP 0.45，0.90 和1.80 mg·kg-1組小鼠肝組織中的G6Pase，PCK1，F(xiàn)BP1 和FGF21 表達(dá)水平顯著升高（P<0.05，P<0.01）。

Fig.3 Effect of BaP on protein expressions of FBP1，G6Pase，PCK1 and FGF21 in mouse liver tissue by Western blotting.See Tab.2 for the mouse treatment. A2 and B2 were the semi-quantitative result of A1 and B1，respectively. IA：integrated absor?bance.±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with vehicle control group.

2.3.2 HepG2細(xì)胞

與細(xì)胞對(duì)照組相比，BaP 1.0 和10.0 μmol·L-1組G6Pase，PCK1，F(xiàn)BP1 和FGF21 蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05，P<0.01）（圖4）。

Fig.4 Effect of BaP on protein expressions of FBP1，G6Pase，PCK1 and FGF21 in HepG2 cells by Western blotting.See Fig.2 for the cell treatment. A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1，B1，respectively. ±s，n=3. ＊P<0.05，＊＊P<0.01，com?pared with cell control group.

圖5 結(jié)果顯示，與細(xì)胞對(duì)照組相比，BaP 組HepG2細(xì)胞中FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；與BaP 1 μmol·L-1組相比，BaP 1 μmol·L-1+CH223191 1 μmol·L-1組HepG2細(xì)胞中FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21的蛋白表達(dá)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖5）。

Fig.5 Effect of BaP and CH223191 on protein expressions of FBP1，G6Pase，PCK1 and FGF21 in HepG2 cells by Western blotting. The cells were treated with BaP or CH223191 for 24 h. A2 and B2 was semi-quantitative result of A1，B1，respec?tively.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，compared with BaP group.

3 討論

本研究結(jié)果表明，經(jīng)BaP 處理后不僅能提高肝糖異生相關(guān)分子FBP1，G6Pase 和PCK1 表達(dá)，而且能顯著增加糖脂代謝關(guān)鍵因子FGF21表達(dá)，這一過(guò)程需要借助AhR來(lái)實(shí)現(xiàn)。說(shuō)明，BaP通過(guò)AhR促進(jìn)了肝糖異生關(guān)鍵酶的活性，干擾了肝正常糖異生的穩(wěn)態(tài)，表現(xiàn)為異常上升糖異生水平。FBP1，G6Pase 和PCK1 為糖異生限速酶，蛋白和mRNA的表達(dá)量可以評(píng)估糖異生水平，其對(duì)機(jī)體血糖穩(wěn)態(tài)十分重要，常作為T(mén)2D 治療靶點(diǎn)［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制高表達(dá)FBP1糖異生限速酶的活性，可以降低肝葡萄糖水平，達(dá)到治療T2D 的效果［13-14］。此外，G6Pase和PCK1均與糖尿病密切相關(guān)，G6Pase和PCK1 的上調(diào)，會(huì)導(dǎo)致高血糖和T2D，PCK1 的持續(xù)升高則會(huì)造成高胰島素血癥［15-18］。表明，糖異生限速酶FBP1，G6Pase 和PCK1 的高表達(dá)會(huì)誘發(fā)糖代謝相關(guān)疾病。

BaP 是AhR 經(jīng)典外源性配體，在無(wú)配體存在情況下，AhR 和熱休克蛋白90、p23、乙型肝炎病毒X相關(guān)蛋白2在胞漿中形成無(wú)活性復(fù)合物［19］。當(dāng)BaP和AhR 結(jié)合后，AhR 脫離復(fù)合物與ARNT 形成二聚體，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，激活下游相關(guān)因子如細(xì)胞色素P450 酶家族［20］。研究發(fā)現(xiàn)，AhR 在肝中糖原分解、糖異生和脂肪酸氧化中具有重要作用，可通過(guò)誘導(dǎo)TiPARP 表達(dá)影響肝糖異生［21］。FGF21 是一種新型糖脂代謝調(diào)節(jié)靶點(diǎn)，對(duì)糖代謝相關(guān)疾病和肥胖有著積極的作用，但相對(duì)與正常人群而言，肥胖及糖尿病患者血液中FGF21水平卻顯著上升，這一現(xiàn)象得到了廣泛的關(guān)注。Fisher 等［22］首次發(fā)現(xiàn)了FGF21 抵抗現(xiàn)象，證實(shí)了肥胖小鼠血液中FGF21含量升高，但降低循環(huán)中甘油三酯和改善糖耐量生物效應(yīng)顯著減弱。此外，Jeon 等［23］發(fā)現(xiàn)T2D 患者發(fā)生FGF21 抵抗現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)BaP處理后FGF21 表達(dá)升高，在給與AhR 抑制劑后，F(xiàn)GF21 的表達(dá)上升趨勢(shì)被抑制。Girer等［24］研究發(fā)現(xiàn)，AhR可與FGF21啟動(dòng)子中的異源物反應(yīng)元件結(jié)合進(jìn)而影響FGF21 表達(dá)，說(shuō)明AhR 可直接影響FGF21 表達(dá)，本研究結(jié)果相似，表明BaP 能通過(guò)AhR/FGF21信號(hào)通路，提高肝FGF21含量，并可能引發(fā)FGF21抵抗，造成糖脂代謝紊亂。

綜上所述，BaP 可提高肝糖異生限速酶FBP1，G6Pase，PCK1 和FGF21 表達(dá)，進(jìn)而提高肝糖異生水平，其機(jī)制可能與激活A(yù)hR/FGF21 信號(hào)通路有關(guān)，有可能引起FGF21抵抗和相關(guān)糖代謝疾病。