王汝堤，徐浩，劉斌，李嘉興，李偉生，陳秋虹，貝昊洋，李明意（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，廣東湛江 524000）

原發(fā)性肝癌是我國第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高[1-3]。原發(fā)性肝癌包含肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）、肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）和混合型肝細(xì)胞癌-膽管癌（combined hepatocellular-cholangiocarcinoma，cHCC-CCA），其中HCC占75%～85%[4]，是肝癌最主要的病理類型。早發(fā)現(xiàn)、早治療是降低肝癌死亡率的有效途徑，目前主要通過聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物、影像學(xué)檢查、組織活檢等手段檢測腫瘤。1990-2017 年，隨著HCC 診斷靈敏性和治療效果的提高，中國年齡標(biāo)準(zhǔn)化死亡率下降了20.3%[2]。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）作為HCC 目前應(yīng)用最廣泛的腫瘤標(biāo)志物，已廣泛應(yīng)用于肝癌的術(shù)前診斷及術(shù)后檢測復(fù)發(fā)，但是AFP 在HCC 的陽性率僅為70%，且部分肝硬化及乙型病毒性肝炎患者上也呈AFP 陽性[5]，以AFP 為代表的生物標(biāo)志物的靈敏度和特異度已不能滿足當(dāng)今《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》對HCC 的防治要求[6]。近年來以循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）為代表的液體活檢技術(shù)因其高特異度、高靈敏度、實(shí)時性及微創(chuàng)性等優(yōu)勢開始興起，并在肝癌篩查與治療領(lǐng)域發(fā)揮重大的作用。本文對ctDNA 在肝癌術(shù)前診斷、預(yù)后評估、術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測及用藥指導(dǎo)等臨床應(yīng)用及挑戰(zhàn)方面的研究進(jìn)展作一綜述。

1 ctDNA 的研究內(nèi)容和檢測手段

液態(tài)活檢技術(shù)是一項微創(chuàng)、主要利用人體血液研究腫瘤生物學(xué)特性的技術(shù)，包括ctDNA、循環(huán)游離DNA（circulating free DNA，cfDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumour cell，CTC）、循環(huán)微RNA（circu-lating micro RNA，cmiRNA）等[7]。cfDNA 是在人體血液、尿液及其他體液中可以檢測到的高度降解DNA 片段，在正常人中大多數(shù)cfDNA 來源于白細(xì)胞甚至正常細(xì)胞，而血液中cfDNA 一般維持在較低水平，但在懷孕、劇烈運(yùn)動、創(chuàng)傷、感染、中風(fēng)、心肌梗死或手術(shù)后，cfDNA 含量會明顯升高[8-10]。ctDNA 從cfDNA 中發(fā)現(xiàn)，是由腫瘤細(xì)胞分泌或在腫瘤細(xì)胞壞死或調(diào)亡過程中釋放入循環(huán)系統(tǒng)中的DNA 片段，半衰期一般小于2 h，DNA 片段長度約為132～145 bp，ctDNA 攜帶來源于腫瘤細(xì)胞的遺傳學(xué)信息，如點(diǎn)突變、擴(kuò)增、重排、DNA甲基化等基因突變形式，可作為腫瘤早期診斷、療效評估及預(yù)后評估的重要指標(biāo)[11-12]。目前，肝癌的ctDNA 檢測技術(shù)主要有下一代測序（next-generation sequencing，NGS）、實(shí)時熒光定量 PCR（quantitative real-time PCR，RT-qPCR）、Sanger 法、數(shù)字PCR [dPCR，包括微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）和磁珠乳液擴(kuò)增法（beads emulsion，amplification and magnetics，BEAMing）]、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）、靶向深度測序技術(shù)等[8，13-14]。

2 ctDNA 在肝癌中的臨床應(yīng)用進(jìn)展

肝癌有著非常高的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率及死亡率，早發(fā)現(xiàn)、早治療及跟蹤檢測可顯著改善肝癌患者的總生存率（overall survival，OS）[15]。因此，尋找新的肝癌早期診斷生物標(biāo)志物是近年來的研究熱點(diǎn)。

2.1 ctDNA 作為肝癌早期診斷的生物標(biāo)志物

目前在肝癌領(lǐng)域常用的腫瘤生物標(biāo)志物是AFP、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原199（carbohydrate antigen 199，CA199）等，其中在肝癌患者中分別檢測血清AFP、CEA、CA199 的陽性率分別為76.19%、14.20%、45.20%，聯(lián)合檢測血清AFP、CEA、CA199 時陽性率為88.09%，而在肝硬化患者中陽性率也有58.33%[5]。傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物在肝癌早期診斷應(yīng)用中沒有滿意的特異性，ctDNA 因其高特異度及靈敏度成為近期的研究熱點(diǎn)，通過檢測ctDNA 中的點(diǎn)突變、擴(kuò)增、重排、DNA 甲基化等基因突變形式來早期識別腫瘤。研究表明，檢測血清中的RASSF1A 高甲基化可作為HCC 早期篩查的工具，且比AFP 有更高的檢出率，并且基因突變的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNA）與腫瘤大小的增加有相關(guān)性[16]。Huang 等[17]通過ddPCR 的方法在27 例HCC 患者術(shù)前的外周血中檢測到4 種基因位點(diǎn)突變[TP53（c.747G>T）、CTNNB1（c.121A>G 和c.133T>C）、TERT（c.1-124C>T）]，并排除了這些循環(huán)突變體的非腫瘤來源，證明ctDNA 可作為HCC 患者早期診斷的生物標(biāo)志物。Jiang 等[18]研究發(fā)現(xiàn)HCC 患者術(shù)前ctDNA 監(jiān)測中存在DNA 拷貝數(shù)變異，84.4% 的HCC 患者在1 號和8 號染色體的任意一條臂上至少有一個CNA，而32 例健康受試者中沒有出現(xiàn)相關(guān)的CNA，并存在CNA 陽性的乙肝病毒攜帶者和肝硬化患者在ctDNA 檢測后幾個月被診斷為肝癌案例，突出了其早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的潛質(zhì)。Xu 等[19]通過在715 個HCC患者的ctDNA 樣本和560 個正常人的cfDNA 樣本中建模，應(yīng)用該模型的訓(xùn)練數(shù)據(jù)集里，HCC 的靈敏度為85.7%，特異度為94.3%；而在383 例HCC 和275 例正常樣本的驗證數(shù)據(jù)集里，HCC 的靈敏度為83.3%，特異度為90.5%，顯示了ctDNA 比AFP 有著更高的靈敏度和特異度，ctDNA 作為一種新型生物標(biāo)志物有著廣泛的前景。

2.2 ctDNA 對肝癌預(yù)后的評估

ctDNA 有微創(chuàng)性及標(biāo)本易取等優(yōu)勢，因此可對肝癌治療的全程進(jìn)行跟蹤監(jiān)測，也可以實(shí)時對肝癌治療效果及預(yù)后進(jìn)行評估。Yu 等[20]對485 例經(jīng)肝切除術(shù)的乙肝表面抗原陽性患者的XRCC1 rs25487 多態(tài)性和249 號密碼子TP53 突變進(jìn)行直接測序，發(fā)現(xiàn)rs25487的A 等位基因（AA/AG）可能與不良預(yù)后相關(guān)，實(shí)時檢測肝癌的腫瘤負(fù)荷對腫瘤的預(yù)后評估及治療選擇有積極意義。Cai 等[21]整合了ctDNA 突變譜以評估HCC患者的腫瘤負(fù)荷，提前檢測微小殘留病變（minimal residual disease，MRD），并預(yù)測患者的無復(fù)發(fā)生存期（relapse free survival，RFS）（P=0.001）和OS（P=0.001）的預(yù)后結(jié)局。已有研究發(fā)現(xiàn)ctDNA 陰性的HCC 患者比ctDNA 陽性患者有更長的RFS[22]。Liao 等[23]應(yīng)用MiSeqTM系統(tǒng)分析41 例HCC 患者的血漿和相關(guān)腫瘤DNA 樣本3 個常見基因突變，包括TERT、CTNNB1和TP53 基因，研究顯示在血漿ctDNA 中檢測到與腫瘤相關(guān)突變的患者的中位RFS 是89 d（34～299 d），而在血漿ctDNA 中未檢測到腫瘤相關(guān)突變的患者的中位RFS 是365 d（36～600 d）。這些研究結(jié)果表明ctDNA 陽性預(yù)示著不良的預(yù)后。

2.3 ctDNA 監(jiān)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)

已有研究表明ctDNA 可以監(jiān)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)，ctDNA 的半衰期較短，一般小于2 h，而傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物半衰期卻要數(shù)天至數(shù)周，ctDNA 不僅能實(shí)時動態(tài)監(jiān)測腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)，而且能更早提示MRD 的出現(xiàn)，術(shù)后ctDNA 陽性的HCC 患者比術(shù)后ctDNA 陰性者更容易出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[11，21]。Ono 等[24]分析了46 例接受肝切除術(shù)或肝移植的HCC 患者的全基因組測序數(shù)據(jù)，其中7 例在術(shù)前100 mL 血清樣本中檢測到ctDNA，且隨著疾病進(jìn)展而增加，ctDNA 陽性組的累計復(fù)發(fā)和肝外轉(zhuǎn)移發(fā)生率明顯高于ctDNA 陰性組，多因素分析發(fā)現(xiàn)ctDNA 可作為門靜脈微血管浸潤（vascular invasion of the portal vein，VP）的獨(dú)立預(yù)測因子，ctDNA 的存在反映了腫瘤的進(jìn)展，檢測ctDNA可以預(yù)測VP 和肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)，特別是2 a 內(nèi)的肝外轉(zhuǎn)移。DNA 甲基化等表觀遺傳修飾在調(diào)節(jié)癌細(xì)胞和正常細(xì)胞的基因活性方面起著關(guān)鍵作用[25]。Wong 等[26]在調(diào)查p15 和p16 甲基化在HCC 中的臨床相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，并發(fā)腫瘤甲基化與復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的發(fā)展之間存在顯著關(guān)聯(lián)，p15 和p16 甲基化異?？勺鳛镠CC 的診斷和預(yù)后標(biāo)志。Cai 等[21]通過對34 例HCC 患者ctDNA 的SNVs 和CNVs 信息進(jìn)行了綜合譜分析，評估各類變異與患者臨床病程的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ctDNA可提前4.6 個月發(fā)現(xiàn)腫瘤，明顯優(yōu)于血清生物標(biāo)志物DCP、AFP 和AFP-l3%。Xia 等[22]在回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，在肝切除術(shù)后無主要病理緩解（major pathological response，MPR）的患者中更容易出現(xiàn)ctDNA 陽性，其中突變最多的3 個基因是TP53（75%）、CTNNB1（33%）、TERT（33%），顯示了ctDNA 對HCC 術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值。Liao 等[23]在血漿ctDNA 中檢測到腫瘤相關(guān)突變的患者比那些未檢測到的患者更容易復(fù)發(fā)，且14 例隨訪期腫瘤未復(fù)發(fā)的患者的ctDNA 為陰性。

2.4 ctDNA 在肝癌治療中用藥的指導(dǎo)作用

靶向免疫治療在治療肝癌的一大挑戰(zhàn)就是腫瘤的異質(zhì)性。腫瘤的異質(zhì)性是指同一原發(fā)腫瘤內(nèi)的不同腫瘤細(xì)胞群的遺傳和表觀遺傳譜不同，或同一患者的腫瘤轉(zhuǎn)移情況不同。腫瘤異質(zhì)性使得普通的靶向免疫治療無法對肝癌進(jìn)行針對性治療，而ctDNA 檢測可以全面分析患者腫瘤細(xì)胞釋放的DNA，且在遺傳和表觀遺傳改變方面保持腫瘤異質(zhì)性，在靶向免疫治療上克服腫瘤異質(zhì)性帶來的挑戰(zhàn)，揭示耐藥機(jī)制，提供更好的靶向免疫治療方案[12，27]。ctDNA 監(jiān)測可以為HCC 患者提供基因組圖譜從而指導(dǎo)用藥并及時評估藥物療效。Ikeda 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，1 例CDKN2A 失活及CTNNB1 激活突變患者在接受帕博西尼（CDK4/6抑制劑）和塞來昔布（COX-2/Wnt 抑制劑）2 個月的治療后發(fā)現(xiàn)AFP 基線水平較低，且脫-γ-羧基凝血酶原（des-gamma-carboxy prothrombin，DCP）水平較治療前下降了84%；另1 例PETN 失活及MET 激活突變的患者在接受西羅莫司（雷帕霉素抑制劑的機(jī)制靶點(diǎn)）和卡博替尼（MET 抑制劑）治療后，AFP 水平下降63%。靶向免疫治療的原發(fā)性耐藥也是當(dāng)前肝癌治療的一大難點(diǎn)，ctDNA 可以識別原發(fā)性耐藥的預(yù)測因子。研究發(fā)現(xiàn)在使用酪氨酸激酶抑制劑后，PI3K/MTOR 通路未發(fā)生突變的HCC 患者的PFS 明顯比有這些突變的患者長[29]。HCC 患者產(chǎn)生耐藥性時，ctDNA 會檢測到不同的遺傳或表觀遺傳特征，可通過監(jiān)測ctDNA 來設(shè)計及調(diào)整治療方案[12]。侖伐替尼（lenvatinib，LEN）治療4 周后可降低變異等位基因頻率（variant allele frequencies，VAFs）和獲得更長的PFS，ctDNA 譜分析是LEN 治療期間了解疾病進(jìn)展的有效標(biāo)志[30]。

3 ctDNA 在肝癌應(yīng)用方面面臨的挑戰(zhàn)

目前，ctDNA 未能在臨床肝癌應(yīng)用推廣的主要因素有以下幾點(diǎn)：其一，ctDNA 的成本高昂，讓本就經(jīng)濟(jì)壓力較大的肝癌患者難以承擔(dān)。但隨著技術(shù)的進(jìn)步，ctDNA 的檢測成本正在逐步下降，這將有助于這項技術(shù)的臨床推廣應(yīng)用[14，31]。其二，ctDNA 目前最常用的方法是NGS、ddPCR 等，不同方法甚至不同基因公司所檢測ctDNA 的特異度及靈敏度都有所差異，目前監(jiān)測ctDNA 尚未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，我國已有基于NGS檢測ctDNA 的專家共識[11]。此外ctDNA 結(jié)果會受不同的提取樣本量、采血保存時間以及是否為原發(fā)性腫瘤等差異而受影響，因此我們?nèi)孕韪咏y(tǒng)一的檢測標(biāo)準(zhǔn)對ctDNA 的樣本收集和處理、檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)、結(jié)果報告解析和臨床實(shí)踐應(yīng)用進(jìn)行規(guī)范[32-33]。其三，ctDNA在肝癌血液中的含量較低，即使在腫瘤晚期含量也不高，要在肝癌早期檢測到ctDNA 需要更高靈敏度的ctDNA 檢測技術(shù)。近年來分離ctDNA 的技術(shù)進(jìn)步使得DNA 甲基化作為HCC 生物標(biāo)志物得到更好的發(fā)展應(yīng)用，ctDNA 聯(lián)合AFP 等生物標(biāo)志物共同進(jìn)行肝癌的早期診斷、評估預(yù)后及術(shù)后復(fù)發(fā)可獲得更高的靈敏度及特異度[12，21，34]。

4 小結(jié)與展望

目前，肝癌的治療仍是以手術(shù)為主的綜合治療。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療時代的來臨，靶向和免疫治療逐漸嶄露頭角，并發(fā)揮著越來越重要的作用，讓原來不可能治愈的肝癌變得可控，通過術(shù)前新輔助治療可以縮小腫瘤病灶甚至減少腫瘤數(shù)量，從而達(dá)到手術(shù)可切除的標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后輔助治療可讓患者獲得長PFS。靶向免疫治療有著高度特異性，而肝癌又有著高度的腫瘤異質(zhì)性，這就需要更精準(zhǔn)且實(shí)時的基因檢測。ctDNA 高特異度、微創(chuàng)、易采集的特性讓其成為靶向免疫治療可靠的配套監(jiān)測。與其他蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物相比較，ctDNA 表現(xiàn)出更好的靈敏度和特異度，可作為肝癌早期診斷的生物標(biāo)志物，評估預(yù)后及預(yù)測術(shù)后復(fù)發(fā)，同時通過實(shí)時監(jiān)測ctDNA 可以同步指導(dǎo)臨床用藥及評估用藥療效。ctDNA 的高成本仍然限制了其在臨床的應(yīng)用，檢測技術(shù)的進(jìn)步讓其成本不斷下降，有望在未來成為一項在經(jīng)濟(jì)上能夠為普通患者所接受的檢查。目前ctDNA 在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等領(lǐng)域研究較為成熟[35]，而在肝癌領(lǐng)域應(yīng)用的研究較少且樣本量不夠大，仍需更多前瞻性研究來發(fā)掘ctDNA 這個寶庫，從而為肝癌的精準(zhǔn)醫(yī)療奠定更堅實(shí)的理論基礎(chǔ)。