邵長(zhǎng)柳，唐漫群，劉炳楠，鐘文蔚*，龐玉新

“發(fā)汗”對(duì)龍腦樟中右旋龍腦和其他成分變化的影響及其GC-MS指紋圖譜相關(guān)性研究

邵長(zhǎng)柳1, 2，唐漫群2，劉炳楠2，鐘文蔚2*，龐玉新1, 3*

1. 貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025 2. 廣東藥科大學(xué)中藥資源學(xué)院，廣東 云浮 527300 3. 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室云浮分中心，廣東 云浮 527300

建立龍腦樟chvar.“發(fā)汗”處理GC-MS指紋圖譜與“發(fā)汗”前后龍腦樟粗提物中主成分含量測(cè)定方法，優(yōu)選得到最佳“發(fā)汗”工藝；結(jié)合GC-MS代謝組學(xué)探究“發(fā)汗”前后龍腦樟的成分差異，為其進(jìn)一步研究提供依據(jù)。采用直接堆積的方法對(duì)新鮮龍腦樟枝葉進(jìn)行“發(fā)汗”處理；基于GC-MS建立“發(fā)汗”前后龍腦樟中-龍腦的含量測(cè)定方法；運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）結(jié)合NIST17.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)構(gòu)建“發(fā)汗”前后龍腦樟指紋圖譜并進(jìn)行相似度和共有峰定性分析；通過(guò)SPSS 19.0軟件、Origin 2021軟件及SIMCA 14.1等軟件對(duì)“發(fā)汗”前后龍腦樟成分進(jìn)行多元數(shù)據(jù)分析。“發(fā)汗”4 d，15 ℃，RH 60%（S5組）為最佳工藝，該條件下的-龍腦含量顯著高于“未發(fā)汗”S10組含量；“發(fā)汗”組與“未發(fā)汗”組、不同“發(fā)汗”組之間，化合物的種類和含量均有不同程度差異；構(gòu)建的指紋圖譜共標(biāo)定9個(gè)共有峰，分別是α-蒎烯、莰烯、α-水芹烯、桉葉油素、樟腦、-龍腦、β-石竹烯、α-葎草烯、丁香烯，10批樣品相似度均≥0.982；龍腦樟“發(fā)汗”前后差異代謝物共計(jì)10種，-龍腦和樟腦上調(diào)，α-thujene、γ-松油烯、4-異丙基甲苯、4-萜烯醇下調(diào)?！鞍l(fā)汗”可以提高-龍腦含量，一定程度緩和天然冰片產(chǎn)量低的問(wèn)題，緩解其資源短缺現(xiàn)狀，為解決天然冰片產(chǎn)業(yè)化難題提供了一個(gè)新思路；建立的GC-MS指紋圖譜和-龍腦含量測(cè)定方法便捷可行、重復(fù)性好，且儀器精密度高。

龍腦樟；發(fā)汗；GC-MS；指紋圖譜；天然冰片；正交偏最小二乘-判別分析；聚類分析；主成分分析；-龍腦；樟腦；α-thujene；γ-松油烯；4-異丙基甲苯；4-萜烯醇

龍腦樟chvar.是提取天然冰片（-龍腦）的主要原料之一，具有開(kāi)竅醒神、清熱止痛之功效，主治熱病神昏、目赤、口瘡、咽喉腫痛、耳道流膿等病癥[1-2]。新鮮龍腦樟枝葉經(jīng)水蒸氣提取得到粗提物，再經(jīng)精制得到天然冰片。天然冰片廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域，然而，我國(guó)天然冰片資源缺乏，還需進(jìn)口，通過(guò)一種低成本方法提高天然冰片產(chǎn)量尤為必要[3-4]。

“發(fā)汗”作為一種中藥材產(chǎn)地初加工的傳統(tǒng)炮制方法，是將凈制后的新鮮藥材或經(jīng)加熱處理的藥材堆積悶汗，使藥材所含水分揮至表面。這種民間長(zhǎng)期生產(chǎn)生活總結(jié)出來(lái)的傳統(tǒng)炮制方式，早在《千金翼方》[5]便有論述：“夫藥所取，不依陰干、爆干，雖有藥名，終無(wú)藥實(shí)。”后經(jīng)過(guò)近代應(yīng)用與發(fā)展，常被用于茯苓、川續(xù)斷、白術(shù)、地黃等非揮發(fā)性中藥材及廣藿香等揮發(fā)性中藥材的加工處理。

中藥材在“發(fā)汗”過(guò)程中其化學(xué)成分會(huì)發(fā)生一定程度改變，可通過(guò)影響前體化合物使中藥材中的無(wú)效成分和有效成分相互轉(zhuǎn)化。如王婷等[6]對(duì)“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”丹參中10種活性成分進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明其主要活性成分有不同程度的提高；Cao等[7]基于UPLC/MS非靶向代謝組學(xué)進(jìn)一步研究丹參在“發(fā)汗”處理過(guò)程中的代謝物變化，表明丹參“發(fā)汗”處理后主要活性成分的綜合評(píng)分更高。相似的研究有基于多種分析方法，對(duì)廣藿香、玄參、杜仲、天麻“發(fā)汗”前后的主要活性成分含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果均表明各中藥材主要活性物質(zhì)有不同程度的升高[8-11]?！鞍l(fā)汗”可以改變某些中藥材的活性成分，但主要機(jī)制尚未明確。有相關(guān)研究表明，“發(fā)汗”可引起部分中藥材中多種氧化還原酶、水解酶、酪氨酸酶等酶活性，進(jìn)而引起中藥材性狀變化[12-13]；也有研究表明部分中藥材在“發(fā)汗”過(guò)程中，微生物菌群處于動(dòng)態(tài)變化的狀態(tài)，優(yōu)勢(shì)菌群通過(guò)代謝產(chǎn)生新化合物或前體化合物轉(zhuǎn)化為新化合物，從而使藥材中化學(xué)成分發(fā)生改變[14-15]。

目前，極少有關(guān)于龍腦樟“發(fā)汗”的研究，本研究通過(guò)堆積“發(fā)汗”，利用指紋圖譜并結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析，探究“發(fā)汗”前后龍腦樟各成分變化以及初步探討“發(fā)汗”對(duì)龍腦樟成分變化的機(jī)制；通過(guò)GC-MS指紋圖譜技術(shù)確定了“發(fā)汗”處理能顯著提高龍腦樟中冰片含量，為天然冰片大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)產(chǎn)量高低的難題提供了一個(gè)新思路。

1 儀器和材料

1.1 儀器

Agilent 8890-5977B型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；色譜柱Agilent J&W HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股股份有限公司；TC-15型套式電熱恒溫器，新華醫(yī)療器械廠；GR-200型分析天平，日本A&D有限公司；LRH-250-S型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試劑

-龍腦對(duì)照品，批號(hào)CN211003，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98，購(gòu)買(mǎi)于廣州安捷匯貿(mào)易有限公司；醋酸乙酯，批號(hào)2022020114，色譜純，購(gòu)買(mǎi)于上海穗試公司；無(wú)水硫酸鈉，批號(hào)2022010108，分析純，購(gòu)買(mǎi)于上海穗試公司；0.22 μm微孔濾膜，批號(hào)1840623，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 樣品

龍腦樟新鮮樣品采自湖南省懷化市新晃侗族自治縣（N27°23′15″，E109°18′60″）波洲鎮(zhèn)龍腦樟基地，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)龐玉新研究員鑒定，為樟科樟屬植物龍腦樟chvar.的新鮮枝葉。

2 方法與結(jié)果

2.1 粗提物的制備

天然冰片粗提物為龍腦樟經(jīng)水蒸氣蒸餾后，得到的油固混合物，這部分天然冰片粗品可經(jīng)進(jìn)一步的精制得到天然冰片。新鮮龍腦樟枝葉按照不同溫度、不同濕度、不同堆放時(shí)間進(jìn)行直接堆積“發(fā)汗”，每批1 kg。依據(jù)當(dāng)?shù)夭墒赵路莸臍夂驐l件，設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，因素水平及設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。

表1 龍腦樟“發(fā)汗”L9(34)正交試驗(yàn)因素水平、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果(,n = 3)

S1～S9為“發(fā)汗”組，S10為“未發(fā)汗”組；與空白對(duì)照組比較：*＜0.05；與S1比較：#＜0.05##＜0.01

S1—S9 are the “sweating” group, S10 is “non-sweating” group;*< 0.05blank control group;#< 0.05##< 0.01S1

將“發(fā)汗”后的龍腦樟枝葉清洗后陰干，剪碎，精密稱取40.00 g龍腦樟葉，放入1000 mL圓底燒瓶中，水蒸氣蒸餾法加熱回流2 h，收集得到龍腦樟粗提物。將粗提物用無(wú)水Na2SO4干燥后密封，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液的配制

不同批次的樣本經(jīng)“2.1”項(xiàng)下提取方法可得到粗提物，其由少量揮發(fā)油、大量天然冰片固體組成。將粗提物用醋酸乙酯溶解，無(wú)水Na2SO4除水后，置于25 mg/mL量瓶中定容。取1 mL溶液，醋酸乙酯稀釋20倍，過(guò)0.22 μm濾膜，即得。放入冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取20.00 mg-龍腦對(duì)照品置于10 mL量瓶中，加入醋酸乙酯定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL的對(duì)照品母液。加入醋酸乙酯將母液依次稀釋成2.000、1.000、0.500、0.250、0.125、0.063、0.031 mg/mL質(zhì)量濃度梯度的-龍腦對(duì)照品溶液。

2.4 d-龍腦含量的測(cè)定

2.4.1 GC-MS條件

（1）GC條件：色譜柱為Agilent J&W HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純度氦氣，色譜柱流量1 mL/min，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比20∶1；柱箱起始溫度60 ℃，保持1 min，按照10 ℃/min升至250 ℃，保持6 min。對(duì)照品溶液與S5供試品溶液的總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖1 d-龍腦對(duì)照品(A)和S5供試品(B) 的GC圖

（2）質(zhì)譜條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃；溶劑延遲3.5 min，質(zhì)譜掃描范圍/40～400，電子能量70 eV。

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下各梯度質(zhì)量濃度溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為1 μL。以-龍腦質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制-龍腦的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程為＝1.4×106－8.8×104，2＝0.999 2，表明-龍腦在0.031～2.000 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品母液1 μL，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定-龍腦峰面積，計(jì)算其RSD值，測(cè)得-龍腦峰面積的RSD為1.53%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下制備的S5粗提物供試品溶液，分別于2、4、6、8、10、12 h按照“2.4.1”項(xiàng)方法進(jìn)樣1 μL，測(cè)定-龍腦峰面積，測(cè)得-龍腦峰面積的RSD為2.07%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取S5粗提物6份，按照“2.2”項(xiàng)下方法分別配制成6份供試品溶液。按照“2.4.1”項(xiàng)方法進(jìn)樣1 μL，測(cè)定-龍腦含量，計(jì)算得-龍腦質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD為0.40%，且目標(biāo)峰分離度大于1.5，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 平行取S5中已知含量的龍腦樟樣品，共9份，每份約40 g。分別按照80%、100%、120%精密加入-龍腦對(duì)照品，混合樣品經(jīng)“2.1”項(xiàng)下方法水蒸氣回餾提取得到粗提物，按照“2.2”項(xiàng)下方法分別配制成供試品溶液。依照“2.4.1”項(xiàng)方法進(jìn)樣1 μL，計(jì)算-龍腦平均加樣回收率為100.37%，RSD為2.19%，表明該方法回收率良好。

2.4.7 含量測(cè)定與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 取“發(fā)汗”后的9批（S1～S9）龍腦樟和“未發(fā)汗”（S10）龍腦樟樣本，按照“2.1”項(xiàng)方法提取粗提物，再按照“2.2”項(xiàng)制備供試品溶液后，根據(jù)“2.4.1”項(xiàng)方法測(cè)定10批樣本（＝3），計(jì)算-龍腦平均含量，結(jié)果見(jiàn)表1。使用SPSS 19.0軟件對(duì)“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），結(jié)果表明，S1組與“未發(fā)汗”組-龍腦含量相近。除S1組外，“發(fā)汗”龍腦樟中-龍腦含量較“未發(fā)汗”均有不同程度增加。與“未發(fā)汗”組相比，“發(fā)汗”組中S3和S5中-龍腦含量差異性顯著，其中S5組可提高-龍腦含量27.08%。結(jié)合表1中-龍腦含量，4 d，15 ℃，RH 60%（S5）為最佳“發(fā)汗”條件。

2.4.8 “發(fā)汗”工藝驗(yàn)證 平行稱取龍腦樟3份，每份1 kg。3批樣本在15 ℃、RH 60%的條件下“發(fā)汗”6 d。每批樣本取40 g，水蒸氣回流提取粗提物。按照“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得3批樣本-龍腦平均質(zhì)量濃度為0.673 mg/mL，RSD為1.43%。表明優(yōu)選出的“發(fā)汗”工藝重復(fù)性較高且穩(wěn)定可行。

2.5 “發(fā)汗”龍腦樟GC指紋圖譜研究

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取S2供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定共有峰峰面積，計(jì)算RSD值。計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.17%，峰面積RSD值均小于2.77%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S2供試品溶液，按照“2.4.1”項(xiàng)下方法分別于制備后0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，測(cè)定共有峰峰面積，計(jì)算其RSD值。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.02%，峰面積RSD值均小于2.25%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S2粗提物，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，分別進(jìn)樣測(cè)定共有峰峰面積，計(jì)算其RSD值。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD值均小于0.19%，峰面積RSD值均小于2.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 指紋圖譜構(gòu)建與共有峰識(shí)別 分別按照“2.1”項(xiàng)下方法提取S1～S9“發(fā)汗”前后10批龍腦樟樣本，根據(jù)“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液后進(jìn)樣分析，得到色譜圖。運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）建立GC-MS指紋圖譜。以S1為參照?qǐng)D譜，得到對(duì)照?qǐng)D譜（R，共有模式圖）。10批“發(fā)汗”前后龍腦樟GC-MS疊加圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜，見(jiàn)圖2-A、B。通過(guò)NIST17.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)，以化合物相似度≥75%作為判斷依據(jù)，結(jié)合對(duì)照品及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[16-19]，對(duì)“發(fā)汗”龍腦樟的共有峰進(jìn)行定性分析。共鑒定出9個(gè)化合物，分別為α-蒎烯、莰烯、α-水芹烯、桉葉油素、樟腦、-龍腦、β-石竹烯、α-葎草烯、丁香烯。除此之外，還鑒定出芳樟醇、月桂烯、β-蒎烯、檸檬烯、α-松油醇等非共有化合物。通過(guò)面積歸一化法計(jì)算上述共有化合物的相對(duì)含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

1-α-蒎烯 2-莰烯 3-α-水芹烯 4-桉葉油素 5-樟腦 6-d-龍腦 7-β-石竹烯 8-α-葎草烯 9-丁香烯

2.5.5 相似度分析 使用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)“發(fā)汗”前后龍腦樟中10批樣本圖譜和共有模式圖譜（R）進(jìn)行比對(duì)，采用中位數(shù)法計(jì)算相似度，相似度詳見(jiàn)表3。結(jié)果顯示，建立的“發(fā)汗”龍腦樟指紋圖譜相似度均大于0.982，表明10批處理組主要成分相近，且S1～S9“發(fā)汗”工藝穩(wěn)定，符合指紋圖譜要求。結(jié)合圖3分析，S6和S8含有β-長(zhǎng)葉蒎烯，其他組無(wú)；S1、S4含有檜烯，其他組無(wú)；S1～S3含有異松油烯，其他組無(wú)；只有S2、S3及S5不含有α-松油醇，且只有S9不含有月桂烯。這些差異表明“發(fā)汗”工藝整體雖穩(wěn)定，但存在成分差異。

表2 共有峰化合物及相對(duì)含量

Table 2 Compounds and relative contents of common peak

峰號(hào)t/min化合物分子式相對(duì)含量/% S1S2S3S4S5S6S7S8S9 14.60α-蒎烯C10H163.734.023.293.941.762.652.691.951.42 24.84莰烯C10H161.922.562.192.021.231.621.711.301.05 35.60α-水芹烯C10H163.034.003.863.061.972.942.322.341.60 46.02桉葉油素C10H18O11.034.824.783.882.613.552.932.872.12 57.75樟腦C10H16O7.7712.1311.8710.9514.0012.1811.6112.4312.00 68.06d-龍腦C10H18O52.0958.1360.4357.6568.3662.3268.1667.6869.80 711.61β-石竹烯C15H243.483.493.633.743.553.862.913.135.63 812.04α-葎草烯C15H241.601.551.611.591.421.571.191.292.21 912.57丁香烯C15H242.172.372.342.062.162.171.451.733.04

表3 S1～S10組GC-MS指紋圖譜相似度

Table 3 Similarity of GC-MS fingerprints of S1—S10 groups

編號(hào)相似度 S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10R S11.0000.9820.9970.9990.9820.9980.9980.9970.9970.9890.999 S20.9821.0001.0000.9980.9980.9980.9970.9970.9820.9820.998 S30.9971.0001.0000.9980.9980.9990.9980.9980.9980.9840.999 S40.9990.9980.9981.0000.9981.0000.9990.9980.9970.9860.999 S50.9820.9980.9980.9981.0000.9990.9991.0000.9990.9830.999 S60.9980.9980.9991.0000.9991.0000.9990.9990.9990.9861.000 S70.9980.9970.9980.9990.9990.9991.0001.0000.9990.9830.999 S80.9970.9970.9980.9981.0000.9991.0001.0000.9990.9830.999 S90.9970.9820.9980.9970.9990.9990.9990.9991.0000.9890.999 S100.9890.9820.9840.9860.9830.9860.9830.9830.9891.0000.988 R0.9990.9980.9990.9990.9991.0000.9990.9990.9990.9881.000

2.6 多元數(shù)據(jù)分析

2.6.1 層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA） 將“發(fā)汗”和“未發(fā)汗”龍腦樟共有峰峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0軟件中，采用組間聯(lián)接法和平方歐式距法進(jìn)行HCA系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。當(dāng)平方歐式距為4時(shí)，HCA聚類分析將“發(fā)汗”龍腦樟分為5類，S2、S3為一類，S6、S4、S7、S8、S9為一類，S1、S10、S5各為一類。

2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） 將“未發(fā)汗”組S10、“發(fā)汗”組S1～S9中9個(gè)共有峰峰面積導(dǎo)入到SPSS 19.0軟件中進(jìn)行變量標(biāo)準(zhǔn)化處理。以成分特征值＞1為條件進(jìn)行PCA，提取得到3個(gè)主成分因子，方差貢獻(xiàn)率分別為44.53%、41.35%、12.18%，累積方差貢獻(xiàn)率為98.06%，如表4所示。圖4碎石圖顯示，特征值＞1的主成分因子有3個(gè)，且第3個(gè)成分因子后有明顯拐點(diǎn)，表明上述3個(gè)主成分因子可以涵蓋S1～S10樣本異同。以3個(gè)主成分因子為坐標(biāo)軸，繪制因子載荷圖（圖5）。因子載荷分析表明，峰1（α-蒎烯）、2（莰烯）、3（α-水芹烯）、4（桉葉油素）對(duì)第1主成分的貢獻(xiàn)率最大，可以反映第1主成分信息；峰7（β-石竹烯）、8（α-葎草烯）、9（丁香烯）對(duì)第2主成分貢獻(xiàn)率最大，可以反映第2主成分信息；峰5（樟腦）、6（-龍腦）對(duì)第3主成分貢獻(xiàn)率最大，可以反映第3主成分信息。

表4 特征值及方差貢獻(xiàn)率

Table 4 Eigenvalues and variance contribution rate

主成分初始特征值提取平方和載入 合計(jì)方差/%累積方差/%合計(jì)方差/%累積方差/% 14.00844.53044.5304.00844.53044.530 23.72241.35085.8803.72241.35085.880 31.09612.18098.0601.09612.18098.060

圖4 主成分因子碎石圖

圖5 主成分因子載荷圖

根據(jù)“2.6.2”項(xiàng)下提取的3個(gè)主成分方差貢獻(xiàn)率、特征值及每個(gè)因素權(quán)重值分別計(jì)算“發(fā)汗”前后S1～S10的主成分得分和綜合得分，得到線性模型，主成分因子得分見(jiàn)圖6。其中，1～3、為各主成分因子與綜合得分線性模型，zv1～zv9為峰1～9峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化值。由主成分因子得分圖可知，“未發(fā)汗”組與各“發(fā)汗”組存在一定差異。此外，10批“發(fā)汗”前后樣本被分成5類，其中S4、S6～S9為一類，S2、S3為一類，S1、S5、S10各為一類，結(jié)果與“2.6.1”項(xiàng)下聚類分析一致。

1＝0.375 zv1＋0.378 zv2＋0.392 zv3＋0.367 zv4＋0.313 zv5＋0.170 zv6－0.345 zv7－0.315 zv8－0.288 zv9

圖6 PCA得分圖

2＝0.307 zv1＋0.330 zv2＋0.309 zv3＋0.341 zv4－0.272 zv5－0.341 zv6＋0.339 zv7＋0.374 zv8＋0.375 zv9

3＝?0.181 zv1＋0.056 zv2＋0.079 zv3＋0.096 zv4＋0.525 zv5＋0.620 zv6＋0.288 zv7＋0.272 zv8＋0.361 zv9

＝0.445 31＋0.413 52＋0.121 83

2.7 堆積“發(fā)汗”GC-MS代謝組學(xué)分析

2.7.1 樣品處理與數(shù)據(jù)預(yù)處理 實(shí)驗(yàn)樣本同“1.3”項(xiàng)。本實(shí)驗(yàn)基于S5中最佳“發(fā)汗”條件，探究最優(yōu)“發(fā)汗”組與“未發(fā)汗”組代謝物差異。為提高數(shù)據(jù)可靠性，“發(fā)汗”處理組分別在3、6、9 d平行取樣3次，分別編號(hào)為ZJT-1、ZJT-2、ZJT-3、ZJS-1、ZJS-2、ZJS-3、ZJN-1、ZJN-2、ZJN-3。未發(fā)汗組取樣編號(hào)依次對(duì)應(yīng)為XY-1、XY-2、XY-3。粗提物樣品提取同“2.1”項(xiàng)，供試品溶液配置同“2.2”項(xiàng)。按“2.4.1”項(xiàng)GC-MS方法進(jìn)樣后，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰提取、對(duì)齊、積分等操作，處理后的峰面積值導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 19.0軟件中進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理。

2.7.2 “發(fā)汗”與“未發(fā)汗”組PCA與HCA 龍腦樟堆積“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”代謝物數(shù)據(jù)通過(guò)SIMCA 14.1軟件進(jìn)行PCA，分析得到2個(gè)主成分因子（R2＝0.998，2＝0.982），2個(gè)模型參數(shù)均大于0.5，表明PCA結(jié)果穩(wěn)定可靠，各組樣品聚集良好，所得差異物能反映龍腦樟堆積“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”組的生物學(xué)差異。PCA可將龍腦樟“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”樣本分為3類，如圖7所示，ZJT-1、ZJT-2、ZJT-3、ZJS-1、ZJS-2、ZJS-3聚為一類，XY-1、XY-2、XY-3聚為一類，ZJN-1、ZJN-2、ZJN-3聚為一類。由此可見(jiàn)，“未發(fā)汗”組與堆積“發(fā)汗”組的代謝產(chǎn)物有差異。在堆積“發(fā)汗”組內(nèi)，3、6、9 d的代謝產(chǎn)物各組均存在差異。將標(biāo)準(zhǔn)化處理后的“發(fā)汗”各組數(shù)據(jù)導(dǎo)入TBtools軟件中，結(jié)合NIST17. L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索各“發(fā)汗”組化合物繪制熱圖，結(jié)果見(jiàn)圖8。依據(jù)不同“發(fā)汗”處理組代謝物差異，可將“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”組分為3類，3類樣本可以明顯被區(qū)分，且各組區(qū)分效果良好。聚類熱圖顯示的結(jié)果與PCA中的結(jié)果相符合。

圖7 “發(fā)汗”前后PCA

2.7.3 “發(fā)汗”與“未發(fā)汗”組正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA） 將龍腦堆積“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”代謝物數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行OPLS-DA。OPLS-DA得分圖見(jiàn)圖9，各組數(shù)據(jù)被分為3組，其組間差異性良好，可以實(shí)現(xiàn)龍腦樟堆積“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”樣本間的有效區(qū)分。本次擬合的模型中，R2＝0.875，R2＝0.989，2＝0.984，3者均大于0.5表明擬合效果較好。經(jīng)過(guò)200次隨機(jī)置換檢驗(yàn)，2＝?0.669，小于0，且最右邊2大于最左邊2表明模型不存在過(guò)擬合，可用于龍腦堆積“發(fā)汗”與“未發(fā)汗”代謝物差異性分析。OPLS-DA將“未發(fā)汗”分為一類，堆積“發(fā)汗”3 d分為一類，6 d和9 d分為一類，與上述PCA結(jié)果一致。

2.7.4 發(fā)汗與未發(fā)汗組單變量統(tǒng)計(jì)分析 OPLS-DA分析結(jié)果中堆積“發(fā)汗”組與“未發(fā)汗”組的分離效果顯著。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)變量投影重要性指標(biāo)（variable importance in projection，VIP值）與值篩選差異化合物（VIP＞1，＜0.05），結(jié)果見(jiàn)表5。將2組峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst網(wǎng)站中（https://www.metaboanalyst. ca/）進(jìn)行單因素統(tǒng)計(jì)分析，峰面積歸一化法計(jì)算值，結(jié)合OPLS-DA所得VIP值篩選差異出10個(gè)化合物，通過(guò)NIST17.L標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)檢索分別為α-thujene、γ-松油烯、檜烯、4-異丙基甲苯、萜品油烯、反式-橙花叔醇、右旋樟腦、-龍腦、4-萜烯醇及()-γ-atlantone。

2.7.5 差異代謝物KEGG分析 本研究中，龍腦樟“發(fā)汗”前后差異代謝物共計(jì)10種，將這部分化合物進(jìn)行KEGG通路富集分析。篩選得到的“發(fā)汗”差異代謝物中，-龍腦、α-thujene、γ-松油烯、4-異丙基甲苯、4-萜烯醇及樟腦被注釋到萜類骨架生物合成和單萜生物合成通路中。其中，-龍腦和樟腦上調(diào)，α-thujene、γ-松油烯、4-異丙基甲苯、4-萜烯醇下調(diào)。

3 討論

天然冰片具有抗菌消炎、抗氧化等作用，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、日化用品等領(lǐng)域。然而，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局、歐美地區(qū)相關(guān)部門(mén)已經(jīng)明確禁止人工合成冰片在醫(yī)藥、食品等相關(guān)產(chǎn)品的添加，使得天然冰片的使用需求將會(huì)大大增加，市場(chǎng)前景也極為可觀。因此，通過(guò)某種方法提高龍腦樟中天然冰片產(chǎn)量尤為重要。

圖8 “發(fā)汗”前后聚類分析

圖9 “發(fā)汗”前后OPLS-DA得分(A)、置換檢驗(yàn)得分(B)

表5 “發(fā)汗”與“未發(fā)汗”組差異代謝物

Table 5 Differential metabolites of “sweating” and “non-sweating” group

化合物P值主成分特征值化合物P值主成分特征值化合物P值主成分特征值 α-thujene01.095萜品油烯01.095反式-橙花叔醇01.158 檜烯01.095右旋樟腦0.0041.054(E)-γ-atlantone01.092 4-異丙基甲苯01.056右旋龍腦01.054 γ-松油烯01.0954-萜烯醇01.095

本實(shí)驗(yàn)以-龍腦含量為指標(biāo)，對(duì)比研究“發(fā)汗”是否可用于龍腦樟原材料前處理。通過(guò)對(duì)分流比、升溫程序、色譜柱流量等條件優(yōu)化，得到“2.4.1”項(xiàng)下GC-MS條件，并應(yīng)用于-龍腦含量測(cè)定和指紋圖譜構(gòu)建中。結(jié)果表明，“發(fā)汗”組S5組的-龍腦含量顯著增加。除S1外，“發(fā)汗”組較“未發(fā)汗”組-龍腦含量整體升高。結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，表明在相關(guān)參數(shù)范圍內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)所涉及的“堆積發(fā)汗”工藝穩(wěn)定可行，但不同“發(fā)汗”組別的共有成分有一定差異。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，S1～S10只是成分上發(fā)生改變，未產(chǎn)生新化合物。GC-MS代謝組學(xué)進(jìn)一步探究龍腦樟“發(fā)汗”前后揮發(fā)性化合物的變化規(guī)律。

上述結(jié)果產(chǎn)生的原因主要集中在2方面，分別為生物酶活性、微生物菌群變化。從前者角度看，龍腦樟在“發(fā)汗”過(guò)程中，“發(fā)汗”組S5較“未發(fā)汗”組S10枝葉顏色更深，各組成分也存在差異。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和本實(shí)驗(yàn)中不同活性成分的多元數(shù)據(jù)分析，筆者認(rèn)為本研究中“發(fā)汗”龍腦樟顏色、成分變化和多酚氧化酶、過(guò)氧化物酶多種酶的生物活性有關(guān)[12]。需要注意的是，S5較S10中-龍腦含量顯著增加。造成其含量增加的原因可能是“發(fā)汗”提高了單萜相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)。天然冰片的合成和3個(gè)單萜合酶基因PS14-like1、TPS14-like2及TPS14-like3有關(guān)[20]，上述3個(gè)基因表達(dá)上調(diào)使天然冰片的含量增加。龍腦樟中焦磷酸合成酶（bornyl pyrophosphate synthetase，BPPS）將單萜前體牻牛兒基焦磷酸（geranylpyrophosphate，GPP）轉(zhuǎn)化為焦磷酸冰片（bornyl pyrophosphate，BPP），隨后水解得到天然冰片[21]。甲羥戊酸（mevalonate acid，MVA）途徑中的AACT-like基因和2--甲基--赤蘚糖醇-4-磷酸（2--methyl--erythritol 4-phosphate，MEP）途徑中的DXS-like基因可調(diào)控萜類化合物前體物質(zhì)的產(chǎn)生[22-24]。推測(cè)上述2個(gè)基因的差異性表達(dá)可以解釋S1～S10中芳樟醇、月桂烯、α-水芹烯、α-蒎烯等其他單萜類成分的含量變化。

本實(shí)驗(yàn)中，龍腦樟粗提物大多為單萜類化合物，這類化合物大多由MVA和MEP途徑合成[25]。前者發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)中，后者發(fā)生于質(zhì)體中，2種途徑分別在異戊烯基磷酸激酶、二磷酸丙戊酸脫羧酶及4-羥基-3-甲基丁-2-烯-1-基二磷酸還原酶等酶的作用下生成異戊烯基焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）及二甲基丙烯焦磷酸（dimethylallyl pyrophosphate，DMAPP），2種萜類化合物前體物質(zhì)經(jīng)二甲基烯丙基轉(zhuǎn)移酶合成GPP，最后經(jīng)相關(guān)的酶合成轉(zhuǎn)換成-龍腦、檸檬烯、α-松油醇及樟腦等不同次生代謝產(chǎn)物[26-27]。

此外，在單萜合成通路的中，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA，HMGS）起著重要作用，有研究基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，克隆得到陸英、山茱萸基因的全長(zhǎng)cDNA序列，進(jìn)一步揭示萜類化合物合成的分子機(jī)制[28-29]。本研究中，不同“發(fā)汗”組下龍腦樟的次生代謝物均有不同程度的差異，而代謝差異物集中在單萜類，因此筆者猜測(cè)，不同環(huán)境條件可能改變相關(guān)萜類成分合成酶的活性，進(jìn)而導(dǎo)致不同“發(fā)汗”組別活性成分的差異。

從微生物菌群角度看，優(yōu)勢(shì)菌群的動(dòng)態(tài)變化可以通過(guò)代謝或結(jié)合中藥材中的前體分子產(chǎn)生新的活性分子。如魏擔(dān)等[14]發(fā)現(xiàn)“發(fā)汗”可以改變厚樸中曲霉屬M(fèi)icheli和假絲酵母菌屬Berkhout等微生物群落的代謝，使其顏色改變。龍腦樟中優(yōu)勢(shì)菌落主要為青霉屬和曲霉屬，然而不同部位的優(yōu)勢(shì)真菌存在差異。龍腦樟的不同“發(fā)汗”時(shí)期，優(yōu)勢(shì)菌種處于動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程，可能導(dǎo)致不同時(shí)期的活性成分差異化。

本研究通過(guò)“發(fā)汗”顯著提高了-龍腦含量，確定本實(shí)驗(yàn)中的最優(yōu)“發(fā)汗”工藝為4 d，15 ℃，RH 60%（S5組）。優(yōu)化得到的“發(fā)汗”工藝可一定程度緩和天然冰片資源短缺的現(xiàn)狀，為闡明龍腦樟“發(fā)汗“機(jī)制提供數(shù)據(jù)支撐，同時(shí)為天然冰片的工業(yè)提取提供新思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effects of “sweating” inchvar.on-borneol and change in composition and its correlation with GC-MS fingerprint

SHAO Chang-liu1, 2, TANG Man-qun2, LIU Bing-nan2, ZHONG Wen-wei2, PANG Yu-xin1,3

1. School of Pharmacy, Guizhou University of Chinese Medicine, Guiyang 550025, China 2. School of Chinese Materia Medicinal Resource, Guangdong Pharmaceutical University, Yunfu 527300, China 3. Yunfu Sub-center of Lingnan Modern Agricultural Science and Technology Laboratory of Guangdong Province, Yunfu 527300, China

To establish a GC-MS fingerprint of “sweating” treatment and determination method of main components in Longnaozhang (chvar.) before and after the “sweating” treatment. To optimize the best “weating” conditions and evaluate quality ofchvar.before and after “sweating” treatment with GC-MS metabolomics, which provides the basis for further research.The method of “sweating” was applied to the leaves and branches of the freshchvar.by direct stacking. A method for the content determination of-borneol inchvar.before and after “sweating” was established based on GC-MS.(2012 edition) and NIST17.L standard mass spectrometer library were used to construct “sweating” fingerprint and conduct qualitative analysis of similarity of common peak. Multivariate data analysis was performed on the components ofchvar.before and after “sweating” by SPSS 19.0 software, Origin 2021 and SIMCA 14.1 software.The “sweating” 4 d, 15 ℃, RH 60% (S5 group) was confirmed as the optimal condition. The content of-borneol was significantly higher than that in “non-sweating” S10 group. The types and contents of compounds were differentbetween “sweating” and “non-sweating” groups, and between different “sweating” groups. A total of 9 common peaks were identified, namely α-pinene, camphene, α-phellandrene, eucalyptol, camphor,-borneol, β-caryophyllene, α-humulene, γ-himachalene. The similarity of 10 batches of samples was greater than 0.982. Altogether 10 metabolites differed before and after “sweating”, with up-regulated-borneol and camphor, down-regulated terpinen-4-ol and other compounds.“Sweating” can increase the content of-borneol, which can solve the problem that has low production ofto alleviate the current shortage of resources. The established GC-MS fingerprint and method of determining content of-borneol are convenient and feasible, with good reproducibility, and high precision of the instrument.

chvar.; sweating; GC-MS; fingerprint;; orthogonal partial least squares- discrimination analysis; cluster analysis; principal analysis;-borneol; camphor; α-thujene; γ-terpinene; 4-isopropyltoluene; terpinen-4-ol

R283.6

A

0253 - 2670(2023)17 - 5580 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.17.012

2023-03-02

廣東省科研機(jī)構(gòu)重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計(jì)劃（省級(jí)實(shí)驗(yàn)室分中心）（2021B0707010008）

邵長(zhǎng)柳（1998—），男，碩士，專業(yè)方向?yàn)橹兴庂Y源開(kāi)發(fā)與品質(zhì)評(píng)價(jià)。E-mail: shaochangliu178@163.com

鐘文蔚，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)榛谀み^(guò)程的中藥綠色制造。E-mail: wenwei.rachel.zhong@hotmail.com

龐玉新，男，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幟褡逅幯芯颗c開(kāi)發(fā)。E-mail: pyxmarx@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]