高璐瑤,曹嘉健,王春華,武 濤,杜亞琳

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,湖南 長沙 410128;2.園藝作物種質(zhì)創(chuàng)作與新品種育種工程研究中心,湖南 長沙 410128;3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物(蔬菜、茶葉等)基因資源評(píng)價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南 長沙 410128)

黃瓜(CucumissativusL.)是我國重要的蔬菜作物之一,其口味清爽、品種多樣,深受廣大消費(fèi)者喜愛[1-3]。GDSL(GDSL lipase,Gly-Asp-Ser-Leu)基因參與表皮角質(zhì)的聚合過程,影響脂質(zhì)、次級(jí)代謝產(chǎn)物和細(xì)胞壁生物合成等主要過程[4-5]。明確黃瓜中CsGDSL的表達(dá)模式,有助于進(jìn)一步探究CsGDSL影響黃瓜角質(zhì)層發(fā)育的作用機(jī)制,為黃瓜表皮光澤的研究奠定基礎(chǔ)。表皮光澤是蔬菜作物重要的商品性狀之一,光澤性較強(qiáng)的蔬菜在市場(chǎng)上更具有競(jìng)爭力[6-7]。表皮光澤作為外觀性狀,必然與植物表皮組分差異有著一定的聯(lián)系[8]。

植物表皮主要成分為角質(zhì)層,是植物表皮外的一層疏水保護(hù)層,形成于陸生植物表皮細(xì)胞壁外表面的脂質(zhì)保水層[9-10]。其通常由角質(zhì)和蠟質(zhì)組成,而蠟質(zhì)則又分為內(nèi)層蠟質(zhì)與外層蠟質(zhì),外層蠟質(zhì)通常稱為蠟粉;角質(zhì)是角質(zhì)層的主要結(jié)構(gòu)成分,其主要組分是聚酯[11-14]。這三者均對(duì)植物表皮的形態(tài)特征有所影響[15-17]。GDSL脂肪酶屬于α/β水解酶折疊蛋白超家族,其二級(jí)結(jié)構(gòu)一般由多個(gè)α-螺旋、β-折疊組成,在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、抗逆性和組織器官的形態(tài)建成等眾多方面發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[18-20]。目前,Uttam等[21]發(fā)現(xiàn),在具有光澤的高粱突變體的葉和稈表面上表皮蠟積累發(fā)生變化,對(duì)其遺傳圖譜進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)注釋為GDSL的基因座最可能與表皮蠟沉積相關(guān)的基因。Girard等[22]研究表明,當(dāng)對(duì)番茄SlGDSL1基因進(jìn)行RNAi干擾時(shí),部分轉(zhuǎn)基因植株番茄果實(shí)由于角質(zhì)層沉積發(fā)生缺陷,角質(zhì)層厚度變薄,番茄果皮光澤性變強(qiáng)。Petit等[23]發(fā)現(xiàn)在番茄果皮光澤性強(qiáng)的突變體中,其蠟質(zhì)、角質(zhì)的含量和構(gòu)成物以及角質(zhì)層厚度等方面都有一定變化,對(duì)其中的角質(zhì)缺陷突變體進(jìn)行遺傳作圖發(fā)現(xiàn),存在一個(gè)具有剪接突變的GDSL2基因。以光澤性不同的2份辣椒為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析,結(jié)果表明,GDSL基因在提高角質(zhì)含量中起著重要作用[24]。

雖然前人已在番茄中初步研究了GDSL基因?qū)τ谥参锝琴|(zhì)層及果實(shí)表皮光澤的影響,但在黃瓜中關(guān)于GDSL基因的克隆與表達(dá)模式分析的研究尚未報(bào)道。本研究參考葫蘆科基因組數(shù)據(jù)庫,對(duì)CsGDSL基因進(jìn)行克隆。通過蛋白序列比對(duì)以及進(jìn)化樹構(gòu)建,分析黃瓜CsGDSL脂解酶基因的保守性,并通過qRT-PCR技術(shù)明確了該基因在黃瓜不同組織部位中的表達(dá)差異。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)研究材料為黃瓜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良團(tuán)隊(duì)實(shí)驗(yàn)室繁育的高代自交系華南型黃瓜649,于2021年6月種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園基地大棚中(長沙)。取莖、卷須、根、生長點(diǎn)、開花當(dāng)天的雄花與雌花以及0,3 d的子房。所有材料取后立即置于液氮中,保存在-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

本研究所有克隆引物由軟件 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì),北京擎科生物科技有限公司合成并測(cè)序(表1)。

表1 引物信息

1.2 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

TRIzol法(全式金,北京)提取莖、卷須、根、生長點(diǎn)、開花當(dāng)天的雄花、雌花以及0,3 d的子房的總RNA,試驗(yàn)步驟參照說明書。以總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈(諾唯贊,南京),置于-20 ℃?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄程序如下,第1步:Oligo(dT)23VN(50 μmol/L)1 μL,Total RNA 10 pg～5 μg,RNase-free ddH2O補(bǔ)至12 μL;將反應(yīng)液于65 ℃加熱5 min,迅速置于冰上驟冷,并在冰上靜置2 min;第2步:取4×gDNA wiper Mix 4 μL加于上述反應(yīng)液中,用移液器輕輕吹打混勻。42 ℃ 2 min;第3步:反應(yīng)液中加入10 × RT Mix 2 μL,HiScript II Enzyme Mix 2 μL,50 ℃ 45 min,85 ℃ 2 min,-20 ℃保存。

1.3 黃瓜CsGDSL基因的克隆與序列分析

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板,參照黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(http://cucurbitgenomics.org/organism/20)檢索出的CsGDSL基因序列設(shè)計(jì)基因特異性引物,利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(諾唯贊,南京),以克隆目的基因。反應(yīng)體系如下:2 × Phanta Max Buffer 25 μL,dNTP Mix(10 mmol/L)1 μL,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL,GDSL-F 1 μL,GDSL-R 1 μL,cDNA 1 μL,ddH2O補(bǔ)至50 μL,反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,35次循環(huán);75 ℃ 5 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,并回收目的條帶,連接T載體(擎科,北京),轉(zhuǎn)化大腸桿菌,選取陽性克隆測(cè)序。

1.4 CsGDSL基因的生物信息學(xué)分析

利用 NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析CsGDSL基因結(jié)構(gòu)。通過Expasy Protparam(http://web.expasy.org/trans-late/)分析CsGDSL理化性質(zhì),如相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等。使用SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測(cè)該基因二級(jí)結(jié)構(gòu),PHYRE2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測(cè)該基因三級(jí)結(jié)構(gòu)。根據(jù)CsGDSL的氨基酸序列,在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過Blast程序搜索得到與CsGDSL蛋白同源性高的植物蛋白序列,使用MEGA 6軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 黃瓜CsGDSL脂解酶基因在黃瓜不同部位中表達(dá)量的分析

取莖、卷須、根、生長點(diǎn)、開花當(dāng)天的雄花、雌花以及0,3 d的子房的總RNA進(jìn)行qRT-PCR,以明確CsGDSL在黃瓜不同組織部位中的表達(dá)情況。內(nèi)參選用黃瓜actin基因,所用引物序列見表1。qRT-PCR反應(yīng)體系如下:Hieff?miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix 10 μL,Forward Primer(10 μmol/L)0.4 μL,Reverse Primer(10 μmol/L)0.4 μL,cDNA 2 μL,ddH2O補(bǔ)至20 μL(翌圣,上海)。利用iCycler iQTM 5 real-time PCR 檢測(cè)系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA,美國)進(jìn)行qRT-PCR,反應(yīng)程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,40次循環(huán),每個(gè)反應(yīng)3次生物學(xué)重復(fù),3次技術(shù)重復(fù)。使用 2-ΔΔCt算法分析CsGDSL在不同組織部位中相對(duì)定量 mRNA水平。

1.6 CsGDSL啟動(dòng)子功能分析

通過黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫獲得CsGDSL啟動(dòng)子序列,并利用啟動(dòng)子分析網(wǎng)站PLANTCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)對(duì)黃瓜CsGDSL啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜CsGDSL基因的克隆與序列分析

以黃瓜cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得CsGDSL(Gene ID:XM_004143264.3)CDS長度為1 059 bp,且與葫蘆科數(shù)據(jù)庫中一致,表明該基因克隆成功(圖1)。CsGDSL編碼352個(gè)氨基酸,推測(cè)蛋白分子量為39.04 ku,理論等電點(diǎn)為8.55,親水性為-0.138(該值為負(fù)則代表親水性,為正則代表疏水性)。對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),表明CsGDSL編碼蛋白序列中包含無規(guī)卷曲45.45%,α-螺旋33.24%,延伸連13.35%以及β-轉(zhuǎn)角7.95%(圖2)。

M.DM2000 DNA Marker;1.目的片段。

A.CsGDSL二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè):卷曲;B.CsGDSL三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2.2 黃瓜CsGDSL基因的生物信息學(xué)分析

CsGDSL編碼的蛋白經(jīng)protein Blast黃瓜中GDSL蛋白與甜瓜(XP 008462554.1)、冬瓜(XP 03883064.1)、南瓜(XP_023544735.1、KAG7034511.1、XP_022925945.1、XP_022979129.1)等變種同源性超過88%(圖3-A),表明該基因在進(jìn)化過程中較為保守,均包含GDSL脂解酶保守結(jié)構(gòu)。通過NCBI數(shù)據(jù)庫Blast檢索CsGDSL在不同作物中的同源蛋白,從檢索結(jié)果中選取不同作物中的10個(gè)同源性較高的蛋白序列:甜瓜(Cucumismelo)、冬瓜(Benincasahispida)、灰籽南瓜(Cucurbitaargyrosperma)、中國南瓜(Cucurbitamoschata)、美洲南瓜(Cucurbitapepo)、印度南瓜(Cucurbitamaxima)、美洲櫟(Quercuslobata)、葡萄(Vitisvinifera)。利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明,黃瓜CsGDSL與甜瓜CmGDSL蛋白關(guān)系最為緊密(圖3-B)。

A.CsGDSL氨基酸序列同源比對(duì);紅框中為保守結(jié)構(gòu)域;B.CsGDSL進(jìn)化發(fā)育樹分析。

2.3 黃瓜CsGDSL組織表達(dá)特異性分析

取莖、卷須、根、生長點(diǎn)開花當(dāng)天的雄花、雌花以及0,3 d的子房的總RNA進(jìn)行qRT-PCR分析,以明確CsGDSL在黃瓜不同組織部位中的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明,CsGDSL在黃瓜各組織部為中均有表達(dá),CsGDSL在開花當(dāng)天的雄花中表達(dá)量最高,雌花次之,0 d的子房中表達(dá)量最低。同時(shí),CsGDSL在開花3 d后子房中的表達(dá)量顯著高于開花當(dāng)天的子房,該結(jié)果表明CsGDSL在黃瓜生長發(fā)育過程中起著重要作用(圖4)。

不同小寫字母表示處理時(shí)間之間在0.05水平存在顯著差異。

2.4 CsGDSL在不同黃瓜品種中保守性分析

選取6種光澤性不同的黃瓜,分別對(duì)CsGDSL基因CDS進(jìn)行克隆,對(duì)其序列進(jìn)行分析表明,在不同品種中,CsGDSL基因序列并未發(fā)生變化,表明在不同光澤性的品種中該基因功能高度保守(圖5)。

黃瓜表皮光澤并不受CsGDSL基因編碼區(qū)所影響,推測(cè)光澤性可能由CsGDSL基因啟動(dòng)子調(diào)控。

2.5 CsGDSL啟動(dòng)子元件分析

為進(jìn)一步明確CsGDSL基因功能,以黃瓜649 DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲得CsGDSL啟動(dòng)子長度為1 975 bp(圖6)。對(duì)其進(jìn)行分析表明,該基因啟動(dòng)子中鑒定出29個(gè)元件(表2)。其中包括,ARE、MBS及TC-rich repeats等與厭氧、干旱、防御和脅迫等逆境相關(guān)的響應(yīng)元件;ABRE參與脫落酸反應(yīng)的激素相關(guān)元件;Box4、CAG-motif、G-Box、GT1-motif、TCT-motif等與光反應(yīng)相關(guān)的元件?；诖祟A(yù)測(cè)結(jié)果,推測(cè)CsGDSL與逆境脅迫、激素及光等具有響應(yīng)。

圖 5 6個(gè)品種中CsGDSL核苷酸序列分析

M.DM 2000 DNA Marker;1.目的片段。

表2 CsGDSL啟動(dòng)子調(diào)控元件分析

3 結(jié)論與討論

GDSL基因不僅能夠影響植物表皮角質(zhì)層的結(jié)構(gòu),還有研究表明,GDSL對(duì)于植物育性也有著一定的影響[25-26]。玉米細(xì)胞核雄性不育基因ZmMs30(MALESTERILITY30)編碼GDSL脂解酶,當(dāng)ZmMs30功能喪失,導(dǎo)致花藥角質(zhì)層缺陷、花粉外壁的不規(guī)則甚至完全雄性不育[27];玉米ZmIPE2(IRREGULARPOLLENEXINE2)基因同樣編碼GDSL脂解酶,IPE2功能障礙導(dǎo)致絨氈層和中層延遲變性,導(dǎo)致花藥表皮和花粉外壁形成缺陷,完全雄性不育,同時(shí)脂肪代謝發(fā)生很大變化,脂質(zhì)成分C16/C18脂肪酸及其衍生物的含量在ipe2發(fā)育的花藥中顯著降低[28]。因而,GDSL基因在花藥及花粉發(fā)育中具有一定功能。本研究中CsGDSL在黃瓜開花當(dāng)天的雄花、雌花中的表達(dá)量顯著高于莖、子房、根、卷須、子房等其他部位,可能是由于在這一發(fā)育時(shí)期,基因主要作用于花器官的發(fā)育。并且,CsGDSL基因在花后3 d的子房表達(dá)含量高于開花當(dāng)天,推測(cè)可能隨著黃瓜果實(shí)的發(fā)育成熟,CsGDSL基因表達(dá)量逐步上調(diào),進(jìn)而參與黃瓜果實(shí)角質(zhì)層的形成過程。

角質(zhì)層因作為植物的疏水屏障,在植物抗逆性上也起著一定的作用。本研究中,對(duì)黃瓜CsGDSL啟動(dòng)子功能進(jìn)行了初步預(yù)測(cè),其具有與厭氧、干旱、防御和脅迫等逆境相關(guān)的響應(yīng)元件。目前,已有研究表明,角質(zhì)層發(fā)育對(duì)厭氧、干旱等脅迫起著顯著作用,在大豆中GDSL 型酯酶/脂肪酶蛋白GmGELP28(GDSL-type esterase/lipase proteins 28) 對(duì)干旱、鹽分和ABA處理的明顯,轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆植株表現(xiàn)出耐旱耐鹽表型[29];水楊酸、乙烯和茉莉酸甲酯處理誘導(dǎo)辣椒葉中GDSL型脂解酶CaGLIP1(GDSL-type lipase)基因表達(dá),并且在種子萌發(fā)和植物生長過程中,CaGLIP1轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出耐旱性[30],但CsGDSL是否通過影響角質(zhì)層的發(fā)育,進(jìn)而影響黃瓜抗逆性還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究參考黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫,通過基因克隆、生物信息學(xué)分析及qRT-PCR技術(shù),獲得了CsGDSL基因,明確了CsGDSL在黃瓜各組織部位中表達(dá)模式,為研究CsGDSL對(duì)于黃瓜果皮角質(zhì)層發(fā)育及光澤性的影響奠定了基礎(chǔ)。