蘇總?cè)A,周小南,王曉薇,楊朝云,丁燕玲,張巖峰,李承隆,曾 靈,明文軒,史遠(yuǎn)剛,康曉龍

(寧夏大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

在家畜飼養(yǎng)過(guò)程中,飼料利用率是評(píng)價(jià)生產(chǎn)成本最重要的指標(biāo)之一。在肉牛養(yǎng)殖過(guò)程中,飼料成本占總成本支出的70%以上[1]。因此,提高動(dòng)物飼料利用率能夠直接降低飼料成本,減少甲烷排放[2]。使用剩余采食量(Residual feed intake,RFI)不僅能夠精準(zhǔn)測(cè)定家畜的飼料利用效率[3],而且能夠排除動(dòng)物生長(zhǎng)性狀以及生長(zhǎng)速率的影響[4];RFI具有中等遺傳力(h2=0.29～0.46)[5-8],并在眾多畜禽飼料效率研究中得到開(kāi)展,通過(guò)獲得RFI相關(guān)的SNP位點(diǎn)[9]、表達(dá)調(diào)控相關(guān)基因[10]、QTL[11]、GWAS[12]等數(shù)據(jù),為從遺傳角度進(jìn)行RFI解析提供依據(jù)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA)在各種生物過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,與其相關(guān)染色質(zhì)修飾、基因組印記、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等眾多生物學(xué)領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注[13-14]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,lncRNA參與調(diào)控牛的多種生產(chǎn)性能,例如奶牛泌乳性能[15]、乳腺炎[16]、骨骼肌發(fā)育[17]、熱應(yīng)激[18]、酸中毒[19]和精子發(fā)生等[20]。飼料效率屬于復(fù)雜性狀,涉及飼料消化代謝、脂肪代謝、運(yùn)動(dòng)等多個(gè)層面。下丘腦作為重要的調(diào)節(jié)中樞,能夠整合機(jī)體代謝、神經(jīng)內(nèi)分泌信號(hào)協(xié)調(diào)動(dòng)物的攝食行為及能量平衡。在下丘腦相關(guān)研究中,已經(jīng)確定弓狀核在調(diào)節(jié)動(dòng)物食欲方面具有關(guān)鍵作用,其通過(guò)2個(gè)神經(jīng)元群調(diào)節(jié)采食量[21]。如促食欲神經(jīng)肽NPY(Neuropeptide Y)和AGRP(Agouti-related peptide),能夠促進(jìn)動(dòng)物采食[22];相反的,厭食神經(jīng)肽如α-MSH(α-Melanocyte-stimulating hormone),通過(guò)產(chǎn)生飽腹感抑制動(dòng)物進(jìn)食[22]。除了神經(jīng)肽,其他調(diào)節(jié)因子,如激素、受體、酶類、轉(zhuǎn)錄因子等多種分子能將外周組織與中樞神經(jīng)系統(tǒng)形成相互關(guān)聯(lián)的神經(jīng)內(nèi)分泌和代謝途徑網(wǎng)絡(luò)[23],從而對(duì)下丘腦參與調(diào)控機(jī)體食物攝入發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前,已有研究分別從某一組織器官的分子功能予以揭示lncRNA相關(guān)調(diào)控分子的功能作用:骨骼肌[24]、肝臟[25-26]、腎上腺[27]、瘤胃[28],但采食中樞相關(guān)的lncRNA是否參與RFI表型變化尚不明確。本研究選取不同RFI表型安格斯肉牛,采集下丘腦組織,篩選肉牛下丘腦中與RFI相關(guān)差異表達(dá)lncRNA,預(yù)測(cè)其靶基因、相關(guān)生物學(xué)通路及其在肉牛能量平衡、飼料效率的潛在作用,研究結(jié)果將為提高動(dòng)物飼料利用率及開(kāi)展肉牛RFI研究提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 研究動(dòng)物與數(shù)據(jù)收集

本試驗(yàn)個(gè)體選自寧夏某養(yǎng)殖場(chǎng)22月齡、初生體質(zhì)量一致、健康狀態(tài)良好的安格斯公牛。試驗(yàn)群體(30頭)按照NRC(2000)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行飼養(yǎng),個(gè)體限欄飼喂,每天喂食2次,每次采食1.5 h,自由飲水。每周測(cè)量收集采食量(Feed intake,FI)數(shù)據(jù),測(cè)定當(dāng)天早晚各1次,利用試驗(yàn)期內(nèi)(81 d)每個(gè)個(gè)體采食量觀測(cè)值和預(yù)期采食量之差表示RFI。使用FI對(duì)中期代謝體質(zhì)量 (Midpoint metabolic body weight,MMBW0.75)和平均日增質(zhì)量 (Average daily gain,ADG)進(jìn)行多元線性回歸估算個(gè)體RFI,RFI統(tǒng)計(jì)分析模型如下[3,29]:

RFI=FI-(b0+b1ADG+b2MMBW0.75)

式中b1和b2分別為MMBW0.75和ADG的偏回歸相關(guān)系數(shù),b0為表型殘差。依據(jù)計(jì)算結(jié)果,RFI大于0的個(gè)體定義為高剩余采食量組,小于0的個(gè)體定義為低剩余采食量組。

1.2 下丘腦樣本采集

根據(jù)所收集數(shù)據(jù),選取剩余采食量極端差異個(gè)體各5頭,分為高剩余采食量(H組)和低剩余采食量(L組)2組,依次編號(hào)為H1～H5和L1～L5。人道方法屠宰試驗(yàn)牛后立即打開(kāi)腦腔,采集下丘腦PBS清洗后放入無(wú)菌、無(wú)酶的凍存管,凍存于液氮中保存。

1.3 RNA提取與檢測(cè)

根據(jù)制造商提供的說(shuō)明書(shū),使用TRIzol試劑對(duì)采集樣本提取總RNA。對(duì)提取的總RNA分別使用1%瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop、Agilent 2100驗(yàn)證RNA降解程度與是否被污染。保證樣本濃度≥500 ng/μL,從而滿足后續(xù)測(cè)序試驗(yàn)條件。

1.4 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

樣本提取合格總RNA后,使用去核糖體RNA的方法構(gòu)建鏈特異性cDNA文庫(kù)。按照Illumina TruseqTM樣品試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。文庫(kù)先使用Qubitu 2.0初步定量,稀釋至1 ng/μL,之后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的插入片段大小進(jìn)行檢測(cè),隨后使用Q-PCR對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2 nmol/L),最后利用Illumina平臺(tái)測(cè)序,產(chǎn)生150 bp的雙端原始測(cè)序數(shù)據(jù)(Raw data)。

1.5 質(zhì)控、比對(duì)和轉(zhuǎn)錄本組裝

為確保比對(duì)過(guò)程中提供高質(zhì)量的數(shù)據(jù),使用FastQC軟件對(duì)Raw data進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估,再利用軟件Trim Galore并使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行質(zhì)控,去除接頭序列(adapter)和低質(zhì)量片段序列(reads)及Poly-N等[30]。將Clean data通過(guò)HISAT2[31]軟件比對(duì)到牛參考基因組(ARS-UCD1.2),得到sam格式比對(duì)文件。利用samtools將sam文件轉(zhuǎn)化為bam格式并排序,之后利用StringTie進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本拼接與定量[32],采用FPKM(Fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments)表示轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量。

1.6 lncRNA的篩選

在篩選之前,先使用cuffmerge軟件,將各樣本拼接得到的轉(zhuǎn)錄本文件進(jìn)行合并,去掉鏈方向不確定的轉(zhuǎn)錄本,得到完整的轉(zhuǎn)錄樣信息。根據(jù)lncRNA的結(jié)構(gòu)和編碼能力特征,對(duì)合并的轉(zhuǎn)錄本集合設(shè)置嚴(yán)格的5步篩選條件[33]:①轉(zhuǎn)錄本exon個(gè)數(shù)篩選(篩選exon≥2的轉(zhuǎn)錄本);②轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度篩選(篩選轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度≥200 bp的轉(zhuǎn)錄本);③通過(guò)Cuffcompare軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本已知注釋篩選(篩選去除與數(shù)據(jù)庫(kù)注釋exon區(qū)域有重疊的轉(zhuǎn)錄本);④通過(guò)Cuffquant軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量篩選(篩選FPKM≥0.5的轉(zhuǎn)錄本);⑤使用CNCI[34]、CPC2[35]、Pfam-scan[36]3種軟件判斷轉(zhuǎn)錄本是否具有編碼潛能,取3種軟件的分析結(jié)果中沒(méi)有編碼潛能的轉(zhuǎn)錄本的交集用于后續(xù)分析。

1.7 主成分分析

本研究對(duì)測(cè)序后轉(zhuǎn)錄本使用R包factoextra進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis,PCA),用方差來(lái)衡量數(shù)據(jù)的差異性和相似性。根據(jù)PCA結(jié)果,剔除掉異常樣本,平衡在試驗(yàn)和測(cè)序過(guò)程產(chǎn)生的誤差,同時(shí)保證在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.8 差異lncRNA篩選及潛在靶基因的識(shí)別

使用R包edgeR,在lncRNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)矩陣中篩選H組和L組差異表達(dá)lncRNA,設(shè)置參數(shù)為|log2(Fold Change)|>1和padj<0.05,使用層次聚類的方法對(duì)差異lncRNA表達(dá)值進(jìn)行聚類。接著對(duì)篩選測(cè)得的差異lncRNA潛在靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),設(shè)置co-location閾值為lncRNA上下游100 kb篩選順式靶基因。再根據(jù)樣本間lncRNA與mRNA表達(dá)量相關(guān)性(pearson,r= 0.95)篩選反式靶基因。

1.9 功能富集分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

使用R包c(diǎn)lusterProfiler和enrichplot對(duì)篩選得到的順式靶基因和反式靶基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析[37],設(shè)置篩選參數(shù)P<0.05。GO富集可以進(jìn)一步明確lncRNA靶基因的主要生物學(xué)功能。KEGG通路富集可用于了解差異lncRNA通過(guò)靶基因參與調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。根據(jù)GO和KEGG結(jié)果使用string(https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)將相關(guān)基因進(jìn)行蛋白互作分析,分析靶基因蛋白在生物系統(tǒng)中的相互作用關(guān)系。接著將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件,使用插件MCODE設(shè)置參數(shù)(Degree Cutoff=2,Node Score Cutoff=0.2,K-core=2,max depth=100)篩選得到核心基因簇。

1.10 差異表達(dá)lncRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可靠性,隨機(jī)選取差異表達(dá)上調(diào)lncRNA:LNC_001283、LNC_014918、LNC_007183、LNC_002434;差異表達(dá)下調(diào)lncRNA:LNC_015216、LNC_015680、LNC_017103、LNC_001739進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,選擇GAPDH作為內(nèi)參基因,引物信息見(jiàn)表1。反應(yīng)體系:TB Green Taq Ⅱ 10 μL,Rox Dye Ⅱ 0.4 μL,200 ng/μL cDNA 2 μL,10 nmol/L上下游引物各0.8 μL,加ddH2O至總體積20 μL。qRT-PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,循環(huán)39次;65～95 ℃ 5 s,每個(gè)基因3個(gè)重復(fù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)分析

相關(guān)數(shù)據(jù)使用非參數(shù)檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)分析處理組與對(duì)照組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,所有分析均使用R軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 安格斯牛剩余采食量表型值

在飼養(yǎng)的30頭公牛中,去除一頭公牛意外死亡,剩余29頭公牛測(cè)量數(shù)據(jù)如表2所示,利用采食量構(gòu)建多元線性回歸計(jì)算模型,計(jì)算公式如下:

RFI=FI-(6.343 5+0.070 7×MMBW0.75+0.745 4×ADG)

式中RFI(剩余采食量)、FI(采食量)、MMBW0.75(中期代謝體質(zhì)量)、ADG(平均日增質(zhì)量)。

根據(jù)上述公式,測(cè)序樣本剩余采食量表型值如表3。

表3 測(cè)序樣本RFI值

2.2 lncRNA測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量及比對(duì)情況

原始數(shù)據(jù)下機(jī)后經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控得到Clean reads(表4)。Clean data中Q20≥95.00%,Q30≥89.00%,GC含量占比均衡、穩(wěn)定,說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。之后將Clean data比對(duì)到牛參考基因組后,其中能比對(duì)到參考基因組的reads占比在93.00%以上,有唯一比對(duì)位置的reads占比在79.00%以上,且在H組和L組中比對(duì)率平均值較為接近,比對(duì)結(jié)果良好(表5)。

表4 樣本測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

表5 測(cè)序reads基因組比對(duì)統(tǒng)計(jì)

2.3 lncRNA篩選

基于轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果,對(duì)lncRNA分步篩選(圖1-A),并將各軟件識(shí)別出的非編碼轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖1-B),最終得到20 996個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄本集進(jìn)行后續(xù)分析。

A.lncRNA篩選步驟統(tǒng)計(jì)圖;B.lncRNA篩選結(jié)果韋恩圖,表示3種軟件分析到的lncRNA數(shù)目。

2.4 牛RFI相關(guān)的下丘腦lncRNA表達(dá)分布及與mRNA結(jié)構(gòu)特征分析

對(duì)lncRNA進(jìn)行定量分析后,共得到20 996個(gè)lncRNA,后續(xù)分析lncRNA均基于此數(shù)據(jù)集,其中antisense_lncRNA(反義lncRNA)占比9.5%,主要產(chǎn)生于編碼鏈的反義鏈;intronic_lncRNA(內(nèi)含子lncRNA)占比47.5%,主要產(chǎn)生于編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域;lincRNA(基因間lncRNA)占比43.0%,主要產(chǎn)生于2個(gè)編碼基因的中間區(qū)域(圖2-A)。

A.lncRNA類型分布;B.lncRNA與mRNA結(jié)構(gòu)特征分析(lncRNA與mRNA的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度、lncRNA與mRNA外顯子數(shù)目、lncRNA與mRNA ORF長(zhǎng)度)。

將篩選得到的lncRNA及比對(duì)組裝的mRNA對(duì)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度、外顯子個(gè)數(shù)、開(kāi)放閱讀框(Open reading frames,ORF)長(zhǎng)度進(jìn)行比較分析,具體分析情況以核密度圖展示(圖2-B)。統(tǒng)計(jì)分析顯示,lncRNA轉(zhuǎn)錄本的平均長(zhǎng)度為2 423 bp,比mRNA轉(zhuǎn)錄本的平均長(zhǎng)度2 040 bp長(zhǎng)383 bp,但根據(jù)圖2-B發(fā)現(xiàn)lncRNA峰值轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度小于mRNA。lncRNA平均外顯子數(shù)目為5.5個(gè),mRNA平均外顯子為10.0個(gè),但lncRNA與mRNA外顯子數(shù)目均集中于2～5個(gè)。統(tǒng)計(jì)分析ORF發(fā)現(xiàn)lncRNA平均ORF長(zhǎng)度為255 bp,mRNA平均ORF長(zhǎng)度為534 bp。

2.5 樣本相關(guān)性和差異性

使用PCA衡量樣本總體的相關(guān)性及差異性,剔除掉異常樣本。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在HRFI組中H1和H5明顯偏離總體水平,在LRFI組中L5偏離總體水平(圖3)。為消除組內(nèi)誤差和增強(qiáng)結(jié)果可靠性,從HRFI中剔除掉H1和H5 2個(gè)樣本,從LRFI組中剔除掉L3和L5 2個(gè)樣本,剩余樣本進(jìn)行后續(xù)分析。最后對(duì)剩余表型H2、H3、H4、L1、L2、L4對(duì)應(yīng)重新分組命名為HRFI組:HRFI1、HRFI2、HRFI3;LRFI組:LRFI1、LRFI2、LRFI3。

圖3 測(cè)序樣本PCA分析

2.6 差異lncRNA篩選及聚類分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量篩選RFI肉牛下丘腦差異lncRNA,在HRFI和LRFI組中共有105個(gè)顯著差異的lncRNA轉(zhuǎn)錄本,其中46個(gè)lncRNA在LRFI組下調(diào),59個(gè)lncRNA上調(diào)(圖4-A),上下調(diào)中高表達(dá)lncRNA包括LNC_001285、LNC_007644、LNC_020193、LNC_013521等(表6)。

A.差異表達(dá)lncRNA火山圖;B.差異表達(dá)lncRNA聚類分析,每一列代表一個(gè)樣本,每一行代表一個(gè)差異lncRNA。

表6 差異上調(diào)或下調(diào)的lncRNA(Top5)

聚類分析用于判斷HRFI和LRFI組中l(wèi)ncRNA的表達(dá)模式,根據(jù)差異lncRNA的FPKM值為表達(dá)水平做層次聚類分析,將表達(dá)模式相同或者相近的lncRNA聚集成類(圖4-B)。聚類分析越接近的lncRNA,其表達(dá)規(guī)律越接近,表達(dá)模式相近的lncRNA可能有相同或者相關(guān)的功能。對(duì)差異lncRNA進(jìn)行聚類分析表明,同一組樣本之間的差異很小,同一基因的表達(dá)水平在相同組內(nèi)具有類似表達(dá)模式。

2.7 差異lncRNA與mRNA靶向關(guān)系

根據(jù)lncRNA與mRNA的位置關(guān)系及表達(dá)量預(yù)測(cè)差異lncRNA靶向關(guān)系。結(jié)果顯示,差異表達(dá)lncRNA共預(yù)測(cè)得到2 640個(gè)靶向mRNA,其中共表達(dá)預(yù)測(cè)到2 163個(gè)靶向mRNA,共定位預(yù)測(cè)到477個(gè)靶向mRNA。分析發(fā)現(xiàn):顯著差異的lncRNA中LNC_007569及LNC_004079可能調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素結(jié)合蛋白(Corticotropin releasing hormone-binding protein,CRH-BP),該蛋白是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin releasing hormone,CRH)的重要調(diào)節(jié)劑,能夠抑制垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH)[38]。同時(shí)表達(dá)變化最明顯的上調(diào)和下調(diào)的前5個(gè)lncRNA中,其中共有7個(gè)lncRNA顯著富集到靶向mRNA(圖5)。這些潛在調(diào)控關(guān)系為研究lncRNA調(diào)控基因表達(dá)進(jìn)而影響RFI提供新的素材。

2.8 差異表達(dá)lncRNA靶基因富集分析及蛋白互作分析

本研究選取差異lncRNA預(yù)測(cè)共表達(dá)及共定位靶基因進(jìn)行GO富集分析,將所有基因進(jìn)行富集分析,共挑選顯著富集的前5條GO富集條目并展示相關(guān)靶基因(圖6-A),結(jié)果發(fā)現(xiàn)前5條GO條目中,有4條GO條目為細(xì)胞組分(CC):線粒體被膜(Mitochondrial envelope)、線粒體內(nèi)膜(Mitochondrial inner membrane)、線粒體膜(Mitochondrial membrane)、含蛋白線粒體復(fù)合物(Mitochondrial protein-containing complex),一條生物過(guò)程(BP)的GO條目:TOR信號(hào)的正向調(diào)節(jié)(Positive regulation of TOR signaling)。這些GO條目表明,差異表達(dá)lncRNA靶基因mRNA主要與線粒體功能及TOR信號(hào)通路有關(guān)。

A.靶向mRNA的GO富集分析;B.靶向mRNA的KEGG富集分析。

將差異表達(dá)lncRNA靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析,挑選富集最顯著的20個(gè)通路進(jìn)行分析(圖6-B)。圖中橫坐標(biāo)表示基因比率,縱坐標(biāo)表示富集到的信號(hào)通路,氣泡大小表示富集到此信號(hào)通路的差異lncRNA靶基因的數(shù)量。在這些信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)生熱作用(Thermogenesis),氧化磷酸化(Oxidative phosphorylation)與動(dòng)物的能量利用聯(lián)系密切,且分析發(fā)現(xiàn),上述通路中相關(guān)基因(ATP酶、呼吸鏈復(fù)合物)主要與差異表達(dá)lncRNA(LNC_006637、LNC_007569、LNC_012079、LNC_005449)相關(guān)。蛋白互作分析共得到46個(gè)核心基因(Hub gene),有595條相互作用關(guān)系(圖7),主要為調(diào)控線粒體活性及電子呼吸鏈功能的線粒體核糖蛋白及泛醌氧化還原酶亞基等。例如MRPL12基因,該基因不僅是線粒體核糖體的關(guān)鍵成分,而且能夠增強(qiáng)線粒體DNA編碼RNA的能力[39]。NDUFA4、SDHD、UQCRH被提出在LRFI牛中表達(dá)量更高[40]。

2.9 差異表達(dá)lncRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇的8個(gè)差異表達(dá)的lncRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(圖8)。結(jié)果表明,這些lncRNA驗(yàn)證結(jié)果與測(cè)序結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)一致,說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)較為可靠,為差異lncRNA的后續(xù)功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

圖8 差異表達(dá)lncRNA的qRT-PCR驗(yàn)證

3 結(jié)論與討論

肉牛生產(chǎn)成本一直是養(yǎng)殖業(yè)最關(guān)注的問(wèn)題,而動(dòng)物飼料效率是影響動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育速率的關(guān)鍵因素,提高飼料效率是集約化肉牛生產(chǎn)最有效的方法之一。除了研發(fā)優(yōu)質(zhì)飼料,深入挖掘影響肉牛飼料效率的遺傳因素仍是育種工作者重要的科研方向之一。長(zhǎng)鏈非編碼RNA通常缺乏蛋白編碼能力,通過(guò)轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)調(diào)控功能[41],目前,lncRNA如何影響靶基因轉(zhuǎn)錄與翻譯水平,并影響肉牛剩余采食量的分子機(jī)制相對(duì)缺乏。因此,對(duì)其功能的研究仍然需要結(jié)合其他表達(dá)信息才能解釋。迄今為止,許多研究表明,非編碼RNA在下丘腦-垂體-腎上腺素軸[27]、脂質(zhì)代謝[26]、神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[42]中起著重要的調(diào)節(jié)作用。如在豬脂肪組織中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析確定了在高飼料效率和低飼料效率中17個(gè)差異表達(dá)的基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNA與RFI相關(guān)[43];在雞的肝組織中,應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)也發(fā)現(xiàn)了影響飼料效率的差異lncRNA[26]。這些研究表明,目前主要采用測(cè)序方法對(duì)不同組織差異lncRNA進(jìn)行表征,從而為解釋家畜采食量差異的遺傳因素提供依據(jù),但lncRNA的調(diào)節(jié)機(jī)制復(fù)雜,對(duì)其功能的探究需要結(jié)合其他調(diào)控分子才能闡明其調(diào)控作用原理。

在本研究中,在高、低RFI肉牛中發(fā)現(xiàn)了20 996個(gè)lncRNA,將得到的lncRNA與編碼基因比較發(fā)現(xiàn),lncRNA具有更短的轉(zhuǎn)錄本、更少的外顯子數(shù)目、更短的ORF長(zhǎng)度,這說(shuō)明lncRNA編碼蛋白能力弱,符合lncRNA的表達(dá)特征[44]。在lncRNA差異表達(dá)分析中,共鑒定出差異表達(dá)lncRNA 105個(gè),其中46個(gè)lncRNA在LRFI組下調(diào),59個(gè)lncRNA上調(diào)。多數(shù)lncRNA不具備蛋白編碼能力,主要通過(guò)結(jié)合一種或多種蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的調(diào)控機(jī)能[45]。lncRNA能夠與順式或反式靶基因互作調(diào)節(jié)生物表型變異,為了明確RFI和差異表達(dá)lncRNA之間的關(guān)系,本研究選擇差異表達(dá)lncRNA,預(yù)測(cè)其靶基因,其中預(yù)測(cè)到共表達(dá)靶向靶基因2 163個(gè),共定位靶基因477個(gè)。對(duì)靶基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),GO條目主要富集到線粒體相關(guān)細(xì)胞組分,在線粒體被膜、線粒體內(nèi)膜、線粒體膜等被顯著富集。在KEGG富集信號(hào)通路中,相關(guān)通路主要富集于與能量代謝有關(guān),包括生熱作用及氧化磷酸化信號(hào)通路,這與GO條目主要富集在線粒體功能上相對(duì)應(yīng)。線粒體功能及產(chǎn)熱效率方面的研究已經(jīng)被證明其與家畜的生產(chǎn)性能及飼料效率表型差異有關(guān)[46]。富集在這些通路上的靶基因主要是ATP酶基因(ATP5F1B、ATP5IF1、ATP5MC2、ATP5MF、ATP5PO等)和呼吸鏈復(fù)合物(COXA3、COX7A1、NDUFB7、NDUFS3等),而這些靶基因主要由差異表達(dá)lncRNALNC_006637、LNC_007569、LNC_012079、LNC_005449調(diào)節(jié)。下丘腦是協(xié)調(diào)信號(hào)傳輸?shù)闹匾袠邢到y(tǒng),能夠調(diào)節(jié)機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)及形成厭食和飽食信號(hào)調(diào)控采食量。根據(jù)前人關(guān)于RFI研究,本試驗(yàn)進(jìn)一步在下丘腦差異lncRNA靶向關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)顯著差異的lncRNA中LNC_007569及LNC_004079可能調(diào)節(jié)促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素結(jié)合蛋白,該蛋白是促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的重要調(diào)節(jié)劑,能夠抑制垂體分泌促腎上腺皮質(zhì)激素[38]。研究表明,下丘腦-垂體-腎上腺素(Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸是影響RFI變異的重要因素之一[47],其通過(guò)調(diào)控動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)對(duì)動(dòng)物的采食量及熱量消耗產(chǎn)生影響;HPA軸激活會(huì)導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)分泌皮質(zhì)醇,參與分解代謝,產(chǎn)生葡萄糖,激活免疫系統(tǒng)并降低食欲[48]。線粒體產(chǎn)生大約90%的細(xì)胞能量,大量存在于代謝活躍的細(xì)胞,如肝、腎、肌肉和腦細(xì)胞。線粒體功能及產(chǎn)熱效率方面的變化已經(jīng)被證明與許多畜牧業(yè)動(dòng)物的生產(chǎn)速率和飼料效率的表型差異有關(guān)[46,49],其主要通過(guò)氧化磷酸化過(guò)程產(chǎn)生能量。氧化磷酸化在新陳代謝中起著核心作用,它將呼吸作用與ATP的產(chǎn)生聯(lián)系起來(lái),但是這種偶聯(lián)不是完全緊密的,偶爾質(zhì)子可以回到線粒體基質(zhì)中產(chǎn)生熱量而不是ATP,這將降低氧化磷酸化的效率[50]。先前研究表明,LRFI動(dòng)物的線粒體呼吸的速率增加[51],電子傳遞鏈的偶聯(lián)得到提升[47],呼吸鏈復(fù)合物(Ⅰ～Ⅴ)的活性更高[52],每千克代謝體質(zhì)量 (BMW,Metabolic body weight)的產(chǎn)熱量更低[2]。另外,電子傳遞鏈也被公認(rèn)為ROS(Reactive oxygen species)的產(chǎn)生部位,升高的ROS通過(guò)增加各種細(xì)胞成分氧化損傷的敏感性,對(duì)細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。在家禽的其他研究中發(fā)現(xiàn)高飼料效率的動(dòng)物中,其氧化應(yīng)激現(xiàn)象也相應(yīng)較低[46,52-53]。在富集到的靶基因中,細(xì)胞色素c氧化酶(COX Ⅱ;復(fù)合物Ⅳ)在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量產(chǎn)生過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,催化電子從還原的細(xì)胞色素c轉(zhuǎn)移到分子氧中,并參與質(zhì)子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[54]。Kelly等[10]提出在LRFI動(dòng)物中COX Ⅱ的轉(zhuǎn)錄豐度更高;Kong等[55]發(fā)現(xiàn)在高飼料效率肉牛中線粒體基因表達(dá)量更高及線粒體基因拷貝數(shù)更低,這也說(shuō)明了LRFI肉牛線粒體活性可能更強(qiáng)、轉(zhuǎn)錄率更高。此外,本研究GO富集到TOR信號(hào)的正向調(diào)節(jié)(Positive regulation of TOR signaling),Cota等[56]提出mTOR(Mammalian TOR)蛋白能夠通過(guò)感知能量狀態(tài)的變化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)周期,也證明了mTOR信號(hào)在響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、調(diào)節(jié)能量平衡的大腦機(jī)制中發(fā)揮重要作用,這也可以作為后續(xù)研究依據(jù)進(jìn)行分析。

挖掘影響動(dòng)物采食效率的生物機(jī)制對(duì)集約化畜牧業(yè)發(fā)展意義重大,飼料效率的提高不僅可以提高生產(chǎn)效益,還可以減少肉牛生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的環(huán)境污染。RFI作為飼料效率研究的主要經(jīng)濟(jì)性狀,對(duì)家畜RFI的遺傳調(diào)控研究將為深入解析家畜RFI變異提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ),也為節(jié)糧型家畜的培育提供依據(jù)。

本研究表征了不同RFI肉牛下丘腦組織中l(wèi)ncRNA轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜,差異lncRNA及其主要參與生熱作用和氧化磷酸化信號(hào)通路對(duì)線粒體功能調(diào)節(jié)產(chǎn)生重要作用,這對(duì)于理解下丘腦神經(jīng)中樞對(duì)家畜采食行為的調(diào)控提供了參考依據(jù),而這一調(diào)節(jié)過(guò)程是否通過(guò)HPA軸發(fā)揮作用,仍然需要細(xì)胞及分子試驗(yàn)才能明確。