朱常才，劉蕊蕊，冀志江，趙春艷，王靜，解帥，郭春紅

（中國建筑材料科學(xué)研究總院有限公司 綠色建筑材料國家重點實驗室，北京 100024）

0 引 言

建筑內(nèi)墻涂料對提高居住舒適性及美化室內(nèi)環(huán)境具有重要作用。功能化建筑內(nèi)墻涂層對控制室內(nèi)建筑環(huán)境有一定的幫助作用，如具有甲醛及VOC 凈化功能的涂料和具有抗菌功能的建筑涂層[1-2]。由于新冠疫情的爆發(fā)，人們對于建筑涂料的功能又有了新的需求，抗病毒涂料成為研究和關(guān)注重點[2-3]，也推動了抗病毒涂料的快速發(fā)展。在公共場所，尤其是兒童娛樂場所（如幼兒園、兒童游樂場等）、養(yǎng)老機構(gòu)和醫(yī)院等特殊人群聚集場所，人與建筑室內(nèi)涂層之間的接觸不可避免，所以研究抗病毒涂層具有重要的意義。

抗菌涂料的測試方法已經(jīng)發(fā)展了很多年，標準體系已經(jīng)相對成熟，而抗病毒涂料相關(guān)標準的發(fā)展相對滯后，我國抗病毒涂料相關(guān)標準主要有中國涂料工業(yè)協(xié)會發(fā)布的團體標準T/CNCIA 01014—2020《抗菌及抗病毒涂料》和T/CNCIA 03002—2020《涂料（漆膜）抗病毒性能測試方法》，廣東省涂料行業(yè)協(xié)會發(fā)布的團體標準T/GDTL 011—2020《抗菌、抗病毒涂料》，所用病毒均為人類病毒，過程操作困難且對測試條件要求較高。并且未針對涂層孔隙對測試方法進行區(qū)分，涂層孔隙的存在對病毒具有吸附作用，抗病毒測試方法的不同可能影響病毒的吸附與脫附，從而影響抗病毒測試結(jié)果。國際上較為通用的材料抗病毒測試方法標準有ISO 21702：2019《塑料和其他非多孔表面抗病毒活性的測定》，此標準主要是針對致密無孔表面的抗病毒活性測試，與我國標準類似，所用病毒為人類病毒。除此之外，國際上對于致密表面的抗病毒測試方法標準還包括ISO 18071：2016《精細陶瓷（先進陶瓷、高技術(shù)陶瓷）-在室內(nèi)照明環(huán)境下半導(dǎo)體光催化材料的抗病毒活性測定-噬菌體Q-beta 試驗法》、ISO 18061：2014《精細陶瓷（先進陶瓷、高技術(shù)陶瓷）-半導(dǎo)體光催化材料的抗病毒活性測定-用噬菌體Q-beta 試驗法》，這2 項標準所用病毒為噬菌體，噬菌體相比于人類病毒培養(yǎng)操作過程更為簡單，且測試條件要求較低，安全性更高。對于多孔材料（織物）表面抗病毒測試方法標準較為通用的為ISO 18184：2019《紡織品-紡織品抗病毒活性評價》，但是此標準不適用于多孔建筑涂層抗病毒測試。由于多孔建筑涂層孔隙的存在對病毒具有吸附作用，在多孔涂層抗病毒測試中除了涂層中抗病毒成分對病毒具有滅活作用，涂層對病毒的吸附同樣表現(xiàn)出抗病毒效果。為此研究多孔涂層抗病毒測試中各因素對測試結(jié)果的影響，有助于進一步優(yōu)化多孔建筑涂層抗病毒測試方法，提高測試結(jié)果的準確性。

本研究選用天然多孔材料硅藻土為填料，以苯丙乳液為基料制備多孔建筑涂料，選擇粒徑大小不同的2 種噬菌體MS2（26 nm）和φA039（90 nm）作為非包膜病毒模型，研究了病毒儲備液種類、涂層表面病毒懸液滴加量和滴加病毒懸液的濃度對多孔涂層抗病毒測試結(jié)果的影響，并探討了抗病毒測試中應(yīng)該注意的相關(guān)問題。

1 實 驗

1.1 主要原材料及儀器設(shè)備

煅燒硅藻土：吉林遠通礦業(yè)有限公司；苯丙乳液：固含量50%，德國巴斯夫；纖維素：250-HBR，亞什蘭化工（南京）有限公司；多功能助劑：AMP-95，陶氏化學(xué)；乙二醇：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；消泡劑：NXZ 和A10，圣諾普科有限公司；潤濕劑：X-100，陶氏化學(xué)；分散劑：5040，圣諾普科有限公司；增稠劑：ASE-60，陶氏化學(xué)；水：自制去離子水。以上未表明純度的原材料均為工業(yè)級。Luria-Bertani（LB）肉湯、Luria-Bertani（LB）瓊脂：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂、瓊脂粉：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；氯化鈉（NaCl）：分析純，天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；SM 緩沖液：北京依塔生物科技有限公司。大腸桿菌噬菌體MS2（ATCC 15597-B1）及其宿主大腸桿菌（ATCC 15597，E.coli）：北納生物；維氏氣單胞菌噬菌體φA039 及其宿主維氏氣單胞菌A039：集美大學(xué)提供。實驗所用儀器設(shè)備如表1 所示。

表1 實驗儀器設(shè)備

1.2 涂層及培養(yǎng)液的制備

多孔建筑涂料的基本質(zhì)量配比為：水40.50%，纖維素0.15%，多功能助劑0.15%，乙二醇1.30%，消泡劑NXZ 0.20%，消泡劑A10 0.20%，潤濕劑0.15%，分散劑1.00%，硅藻土30.00%，苯丙乳液25.70%，增稠劑0.65%。按照配比依次將原材料加入到燒杯中，充分攪拌后過濾出料。

涂層涂覆：抗病毒樣品和FE-SEM 測試涂層樣品采用機械涂膜的方法，將液態(tài)涂料均勻涂覆在普通平板窗戶玻璃基底（25 mm×25 mm）表面（見圖1），涂覆厚度為500 μm。壓汞測試樣品采用機械涂膜將涂料均勻負載于聚酯膜表面，涂覆厚度為500 μm，待涂膜干燥后將其裁成10 mm×10 mm 小片測試。涂覆完的涂料樣品，在室內(nèi)環(huán)境下干燥7 d 后置于玻璃干燥器中，至少放置7 d 后再進行性能測試。

圖1 涂料在玻璃表面涂覆示意

生理鹽水：稱取4.25 g NaCl 加入去離子水中溶解，然后定容至500 mL 得到濃度為0.85%的生理鹽水。半固營養(yǎng)瓊脂（0.5%）：將1.8 g 營養(yǎng)肉湯粉和0.5 g 瓊脂粉加入100 mL 去離子水中加熱溶解。半固LB 瓊脂（0.5%）：將2.5 g LB 肉湯粉和0.5 g 瓊脂粉加入100 mL 去離子水中加熱溶解。1/500 肉湯培養(yǎng)基：取1 mL 肉湯培養(yǎng)基（營養(yǎng)肉湯或LB 肉湯）與500 mL 去離子水混合均勻。其他培養(yǎng)基按產(chǎn)品說明配制，培養(yǎng)基、生理鹽水及其他實驗所用器皿于121 ℃下高壓蒸汽滅菌15 min。

1.3 病毒儲備液制備

病毒肉湯儲備液制備：噬菌體MS2 和φA039 肉湯儲備液根據(jù)ISO 18071：2016 制備。噬菌體MS2 和E.coli 用營養(yǎng)肉湯和營養(yǎng)瓊脂進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37 ℃，搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為170 r/min；噬菌體φA039 和維氏氣單胞菌A039 用LB 肉湯和LB瓊脂培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為120 r/min。培養(yǎng)的菌液和噬菌體肉湯先在8500 r/min 離心10 min，然后取上清液，用注射過濾器過濾3 次，濾液置于4 ℃冷藏。制備的噬菌體MS2 和φA039 的儲備液濃度分別為1×1012、1×109PFU/mL。

病毒SM 緩沖液儲備液制備：取培養(yǎng)12 h 的雙層瓊脂培養(yǎng)基頂層瓊脂置于10 mL 聚乙烯離心管中，然后加入2 mL SM 緩沖液，將頂層瓊脂于SM 緩沖液中充分分散，置于4 ℃冷藏過夜，過夜后于8500 r/min 離心10 min，取上清液用注射過濾器過濾3 次，濾液置于4 ℃冷藏。制備的噬菌體MS2 和φA039 儲備液濃度分別為1×1012、1×109PFU/mL。

1.4 孔隙特征和抗病毒測試方法

根據(jù)GB/T 21650.1—2008《壓汞法和氣體吸附法測定固體材料孔徑分布和孔隙度 第1 部分：壓汞法》測試涂層孔隙特性；用3D 數(shù)字顯微鏡觀察涂層斷面形貌，并測試干燥后的涂層厚度；用FE-SEM 對干燥后的建筑涂層表面形貌進行觀察，加速電壓為20 kV。

建筑多孔涂層抗病毒測試參照薄膜粘附法[4-5]，在此基礎(chǔ)上進行了一定的修改。選用MS2 和φA039 作為非包膜病毒模型進行抗病毒測試。測試前將樣品置于紫外燈下照射1 h滅菌。用1/500 營養(yǎng)肉湯（MS2）或LB 肉湯（φA039）將噬菌體儲備液（肉湯儲備液和SM 緩沖液儲備液）稀釋至特定濃度，各測試條件下病毒稀釋濃度見表2。然后取特定量稀釋后的噬菌體懸液滴加至樣品表面，各測試條件下滴加量見表2。滴加懸液后在樣品表面覆透明薄膜，輕輕按壓薄膜使噬菌體懸液分布于整個樣品表面，覆膜后將樣品置于帶蓋一次性塑料平皿中。最后將裝有樣品的一次性平皿置于恒溫恒濕箱孵育，溫濕度設(shè)置見表2，分別孵育2、4、8、12 h 后用10 mL 生理鹽水（0.85%）沖洗樣品表面。再用1 mL 移液槍吸取沖洗液反復(fù)沖洗樣品表面15 次，并在沖洗液中漂洗覆膜。然后用生理鹽水對沖洗液進行梯度稀釋。取稀釋后的噬菌體懸液100 μL 與100 μL 宿主菌液混合（MS2 感染E.coli，φA039 感染A039），混合均勻后室溫靜置侵染10 min，然后向侵染后的菌液中加入4 mL 半固瓊脂，混合均勻后倒入平板瓊脂培養(yǎng)基，制備雙層瓊脂平板培養(yǎng)基，待雙層瓊脂平板冷卻凝固后將平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（E.coli 培養(yǎng)溫度37 ℃，A039 培養(yǎng)溫度28 ℃）。雙層瓊脂平板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h 后計數(shù)噬斑。負載病毒樣品在恒溫恒濕箱中孵育后表面噬菌體MS2 和φA039 回收濃度（N）通過噬斑數(shù)量和稀釋倍數(shù)計算。

表2 影響抗病毒測試各因素測試條件

初始病毒濃度（N0）是將稀釋后的噬菌體懸液滴加至玻璃基底表面，覆膜后直接用生理鹽水沖洗，稀釋后培養(yǎng)計數(shù)噬斑，計算0 h 樣品表面病毒回收濃度。根據(jù)病毒濃度降低的對數(shù)值確定病毒滅活量，按Lg（N/N0）確定病毒滅活量。對建筑多孔涂層表面病毒滅活量的評估重復(fù)2~3 次，實驗中每個樣品平行稀釋2 組。

2 結(jié)果與討論

2.1 多孔建筑涂層的表征

硅藻土涂層斷面數(shù)字顯微照片、表面SEM 照片和填料堆積模型如圖2 所示。

圖2 硅藻土涂層的斷面數(shù)字顯微照片、掃描電鏡照片和填料堆積模型

由圖2（a）可以看出，在低放大倍數(shù)下硅藻土涂層表面較為平整，無明顯缺陷，通過數(shù)字顯微鏡無法觀察到涂層填料微觀結(jié)構(gòu)。通過對3~5 張涂層斷面顯微鏡照片進行厚度統(tǒng)計，得到干燥后的硅藻土涂層厚度為（181±8）μm，涂層收縮率較大，為63.77%。由圖2（b）、（c）可以看出，涂層表面存在大量孔隙，且涂層中煅燒硅藻土形狀各異，既存在長條形顆粒也存在粒徑大小不均的塊狀顆粒，所用硅藻土具有寬的粒徑分布。形狀及粒徑大小分布不均的硅藻土更容易形成堆積孔隙[見圖2（d）]。此外，涂層中還有結(jié)構(gòu)較為完整的多孔硅藻土顆粒，能夠進一步豐富涂層的孔隙結(jié)構(gòu)。這種多孔結(jié)構(gòu)的存在有助于提高涂層對表面物質(zhì)的吸附作用，在抗病毒測試中硅藻土涂層表面的多孔結(jié)構(gòu)有助于涂層對病毒的吸附。

對于開孔且孔隙較大的孔結(jié)構(gòu)多以壓汞法表征涂層孔隙分布[6-7]。采用壓汞法測得硅藻土涂層的孔徑分布如圖3 所示。

圖3 硅藻土涂層的孔徑分布

由圖3 計算可得，干燥后硅藻土涂層的中值孔徑為2.91 μm，孔隙率為34.49%，總孔容為0.38 mL/g。涂層孔徑在0.83~11.32 μm，具有寬的孔徑分布。由于所選用的煅燒硅藻土為大小不一、形狀各異的顆粒，導(dǎo)致在涂料成膜過程中尺寸較大且形狀不規(guī)則的顆粒容易形成堆積孔隙。此外，尺寸較小且形狀較為規(guī)則的硅藻土可填充部分較大堆積孔隙，一定程度上加寬了涂層孔徑分布。涂層中不規(guī)則且大小不一的硅藻土堆積而成的涂層孔隙多為尺寸較大的微米級孔隙，屬于大孔孔隙[8]。以硅藻土為填料所制備涂層為大孔徑多孔涂層，對提高涂層吸附作用有利，有助于涂層對表面病毒的多重吸附。

2.2 噬菌體儲備液種類對多孔涂層抗病毒活性的影響

有機物影響病毒存活時間[9]，多孔硅藻土涂層負載病毒懸液后于低濕度（相對濕度為30%）下孵育，是為了表征在較為苛刻的條件下儲備液種類對噬菌體活性的影響。此外，非包膜病毒在低濕度條件下存活時間更短[10-11]，低濕度有助于2 種噬菌體的滅活，這樣才能更好地體現(xiàn)儲備液種類對涂層表面病毒存活時間的影響。按照表2 將懸浮于SM 緩沖液和肉湯中的噬菌體用1/500 肉湯稀釋后用于涂層抗病毒活性測試，不同噬菌體儲備液種類對多孔涂層抗病毒活性的影響如圖4所示。

圖4 不同噬菌體儲備液種類對多孔涂層抗病毒活性的影響

由圖4 可以看出，相同病毒不同儲備液類型測得的多孔涂層的抗病毒活性存在明顯差異，此外，多孔硅藻土涂層對2種病毒滅活性也存在差異，多孔硅藻土涂層對噬菌體φA039的滅活量更高。以SM 緩沖液作為儲備液測得的多孔涂層表面病毒的滅活量低，說明在SM 緩沖液存在情況下病毒存活時間更久。噬菌體的長期保存方法除了制成干粉外，還經(jīng)常將噬菌體懸于SM 緩沖液中進行保存[12]。雖然用1/500 肉湯對噬菌體的SM 緩沖液儲備液進行了稀釋，但是稀釋液中依然有緩沖液殘留，這有助于病毒的存活。SM 緩沖液中明膠的存在，可能有助于病毒在懸液中的聚集，從而延長病毒存活時間[13-16]。噬菌體肉湯儲備液組成與稀釋用1/500 肉湯組成相同，可以避免其他物質(zhì)對噬菌體存活時間的影響，從而使負載在多孔涂層表面的噬菌體的存活時間主要受建筑涂層自身性質(zhì)影響。綜上所述，使用噬菌體肉湯存儲液可以有效避免噬菌體懸液成分不同對測試結(jié)果的影響，提高多孔建筑涂層抗病毒測試結(jié)果的準確性。另外，如果因測試條件要求選用其他類型病毒儲備液進行抗病毒活性測試時，要保證對比實驗中所用儲備液種類相同，以確保測試結(jié)果的可靠性。

2.3 病毒懸液滴加量對多孔涂層抗病毒活性的影響（見圖5）

圖5 病毒懸液滴加量對多孔涂層抗病毒活性的影響

由圖5 可以看出，對于噬菌體MS2，多孔硅藻土涂層表面滴加50 μL 病毒懸液時涂層表面病毒滅活量最高，滴加100、150 μL 時涂層表面病毒滅活量大致相同；對于噬菌體φA039，病毒在多孔硅藻土表面的滅活量隨著病毒懸液滴加量的增加而降低。多孔建筑涂層對表面滴加的病毒懸液具有 吸附作用，懸液滴加至涂層表面后會有部分病毒隨懸液一起進入涂層孔隙內(nèi)部。吸附于涂層孔隙內(nèi)部并且無法脫附的病毒最終會因為無宿主可以感染而失活，從而使多孔涂層具備抗病毒特性。對于樣品涂層而言，對負載懸液的吸附量有限，當病毒懸液滴加量過多時，涂層表面會附著大量水，可能影響多孔涂層對病毒的吸附，無法有效表征多孔涂層對病毒的吸附量，從而影響測試結(jié)果的準確性。另外，當多孔建筑涂層表面噬菌體懸液滴加量過多時（150 μL），懸液極易從覆膜與涂層之間溢出，導(dǎo)致覆膜周邊懸液量多于覆膜與涂層之間的懸液量（見圖6），這也容易造成大的實驗誤差。

圖6 涂層表面病毒懸液不同滴加量并覆膜后照片（羅丹明B 溶液替代病毒懸液）

綜上所述，對于特定大小的多孔建筑涂層測試樣品，在抗病毒測試過程中要控制病毒懸液的滴加量，滴加過多會影響多孔涂層對病毒吸附且懸液容易從表面和覆膜之間大量溢出，滴加過少懸液可能會被完全吸附，造成病毒完全滅活的假象。因此，測試中樣品表面病毒懸液的滴加量應(yīng)根據(jù)測試樣品大小確定，當測試樣品大小為25 mm×25 mm 時，樣品表面病毒懸液最佳滴加量為50 μL。當測試樣品大小改變時，要在正式測試前先確定樣品表面病毒懸液的最佳滴加量，以提高測試結(jié)果的準確性。

2.4 病毒懸液濃度對多孔涂層抗病毒活性的影響（見圖7）

圖7 病毒懸液濃度對多孔涂層抗病毒活性的影響

由圖7 可以看出，隨著病毒在涂層表面孵育時間的延長，2 種病毒回收濃度均降低，但是滴加的病毒懸液初始濃度不同時，涂層的抗病毒測試結(jié)果存在明顯差異。對于噬菌體MS2，當病毒懸液濃度由1×106PFU/mL 增大至1×109PFU/mL時，涂層表面負載病毒的滅活量呈先升高后降低再升高的趨勢，規(guī)律性較差，但是滴加不同濃度病毒懸液之間的抗病毒結(jié)果差異性明顯；對于噬菌體φA039，隨著病毒懸液濃度增大，病毒在涂層表面孵育12 h 后病毒滅活量逐漸降低。在細菌滅活實驗中已經(jīng)有研究證實菌液濃度與細菌滅活有關(guān)[17-18]，實驗結(jié)果表明，與細菌實驗類似，病毒（噬菌體）濃度與病毒滅活之間也存在一定的關(guān)系。因此，在多孔涂層抗病毒測試的多次對比重復(fù)實驗中，要保證每次實驗的病毒懸液初始濃度一致，這樣才能保證每次測試結(jié)果之間的抗病毒結(jié)果具有可對比性。另外，為了減少實驗操作誤差和工作量，提高實驗效率，同時保證測試結(jié)果能夠有效表征涂層抗病毒活性，所用病毒懸液初始濃度應(yīng)該控制在一定范圍內(nèi)。懸液濃度過高，測試中從樣品表面回收病毒的稀釋次數(shù)增加，容易造成實驗誤差，且增加測試工作量；濃度過低，可能不能夠充分表征涂層對病毒的滅活量。雖然多孔涂層表面病毒滅活率未達到99.99%，但是涂層中加入抗病毒材料或環(huán)境條件變化會使病毒滅活增大，為了確保測試結(jié)果能夠有效表征涂層抗病毒活性，所用病毒懸液濃度至少應(yīng)保證最終病毒滅活率達到99.99%[5]。測試結(jié)果表明，在多孔建筑涂層抗病毒測試中滴加病毒懸液的最佳濃度為1×107PFU/mL。

3 結(jié) 語

（1）病毒儲備液種類不同時涂層抗病毒測試結(jié)果存在差異，測試中應(yīng)盡量選用與儲備液稀釋液成分相同的病毒儲備液，以提高多次對比實驗測試結(jié)果的準確性。

（2）涂層抗病毒測試中，涂層表面滴加稀釋后的病毒懸液體積應(yīng)視測試樣品大小而定，以能充分填充涂層與覆膜之間間隙為宜。當樣品大小為25 mm×25 mm 時，樣品表面病毒懸液最佳滴加量為50 μL，測試樣品大小改變時，應(yīng)重新確定樣品表面病毒懸液滴加量。

（3）測試中對于病毒儲備液的稀釋濃度應(yīng)控制在一定范圍內(nèi)，并確保對比測試中涂層表面滴加病毒懸液的濃度一致，以減少實驗量，為提高對比測試結(jié)果的可靠性，儲備液最佳稀釋濃度為1×107PFU/mL。由此可見，在多孔建筑涂層抗病毒測試中，應(yīng)盡量避免各種因素變化對測試結(jié)果的影響，并且在多次重復(fù)和對比測試中應(yīng)保證各影響因素的一致性，從而提高測試結(jié)果的可靠性。