張苗苗 方玉琴 唐俊湘 王朝紅 孫玉秀 朱健生

安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院（合肥 230000）

隨著檢測(cè)技術(shù)的提高，染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis，CMA）逐漸擴(kuò)展到產(chǎn)前診斷領(lǐng)域，成為先天性異常和神經(jīng)發(fā)育障礙的一線檢測(cè)［1］。因此，發(fā)現(xiàn)了越來(lái)越多的拷貝數(shù)變異（copy number variations，CNVs）。16 號(hào)染色體含有很多的低拷貝重復(fù)序列，其p 臂10%的區(qū)域是由高度同源的片段組成，這些重復(fù)片段介導(dǎo)的非等位基因同源重組易形成CNVs。16 號(hào)染色體p 臂的復(fù)雜結(jié)構(gòu)表明它是新的微重復(fù)綜合征的候選區(qū)域［2-3］。

16p13.11 屬于神經(jīng)易感區(qū)域，包含14 個(gè)已知的編碼蛋白質(zhì)的基因，其中NDE1 是與神經(jīng)系統(tǒng)表型相關(guān)的最強(qiáng)候選基因［4］。因此，16p13.11 微重復(fù)常見(jiàn)的表型為語(yǔ)言遲緩、智力低下、顱面畸形和行為異常，骨骼系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、泌尿和消化系統(tǒng)的異常較少見(jiàn)［5-10］。然而，在表型正常的個(gè)體中也發(fā)現(xiàn)了該重復(fù)的攜帶者。有證據(jù)表明，16p13.11 微缺失是致病的，而其復(fù)制是良性變異［11］，也有學(xué)者認(rèn)為，該重復(fù)在表型上存在性別差異，男性攜帶者的病變率高于女性［4］。雖然這個(gè)區(qū)域的缺失是明確與精神障礙性疾病相關(guān)，但重復(fù)的病例卻很少見(jiàn)導(dǎo)致它的臨床表現(xiàn)達(dá)成共識(shí)是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)，并且報(bào)道多見(jiàn)于產(chǎn)后病例，而針對(duì)產(chǎn)前的較少。因此，本研究旨在探討16p13.11 微重復(fù)的基因型-表型的相關(guān)性，綜合分析臨床和細(xì)胞遺傳學(xué)，并評(píng)估其在產(chǎn)前診斷中的致病性質(zhì)，以期為遺傳咨詢提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究共納入2017年1月至2022年8 月在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院遺傳中心接受CMA 檢測(cè)的6 722 例樣本（6 312 份羊水和410 份外周血）。排除517 例具有明確致病表型的變異病例，在排除的病例中未檢測(cè)到16p13.11 微重復(fù)。剩余6 205 例根據(jù)不同的產(chǎn)前診斷指征分為3 組：（1）神經(jīng)認(rèn)知障礙患者組，包括61 例精神障礙患者（發(fā)育遲緩、智力低下等），但無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常；（2）神經(jīng)系統(tǒng)異常產(chǎn)前組，包括356 例B 超顯示胎兒神經(jīng)系統(tǒng)異常（小頭畸形、側(cè)腦室增寬等）的孕婦；（3）神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常產(chǎn)前組，包括5 788 例因其他原因（無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢查高風(fēng)險(xiǎn)、產(chǎn)婦高齡等）行CMA 檢測(cè)的孕婦。所有家庭在檢測(cè)前都接受了遺傳咨詢，并簽署了知情同意書(shū)。本研究得到安徽省婦幼保健院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：2207560）。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 CMA 檢測(cè) 在孕婦進(jìn)行羊膜腔穿刺術(shù)時(shí)抽取羊水，同時(shí)從疑似異常的患者中抽取外周血進(jìn)行CMA 檢測(cè)。根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)［12］，使用Affymetrix CytoScan 750K（Affymetrix，USA）進(jìn)行SNP 檢測(cè)，并使用Affymetrix CytoScan 750K 微陣列分析平臺(tái)進(jìn)行分析。查閱DGV、Decipher、OMIM、UCSC、ISCA和PubMed 等公共數(shù)據(jù)庫(kù)，評(píng)估檢測(cè)結(jié)果的臨床意義，參考已發(fā)表的病例報(bào)告和病例對(duì)照研究進(jìn)行全面分析。

1.2.2 隨訪 對(duì)攜帶16p13.11 微重復(fù)的胎兒及父母進(jìn)行了電話隨訪，并查閱電子醫(yī)療記錄。隨訪標(biāo)準(zhǔn)參照Gesell 量表、Wechsler 成人智力量表和0 ～6 歲兒童神經(jīng)心理發(fā)育量表［13］，身高和體重以《兒科學(xué)》第八版兒童生長(zhǎng)曲線為依據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0 版（IBM，USA）進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)確定重復(fù)病例的概率。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CMA 檢測(cè)結(jié)果 神經(jīng)認(rèn)知障礙患者組和神經(jīng)系統(tǒng)異常產(chǎn)前組均無(wú)16p13.11 微重復(fù)病例。神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常產(chǎn)前組中共檢出13 例（case1-13）攜帶16p13.11 微重復(fù)的胎兒，所有病例都有相似的該重復(fù)，涉及全部的NDE1 基因（chr16：14，892，975-18，172，468）。13 例孕婦的產(chǎn)前診斷指征主要為：唐氏和愛(ài)德華氏綜合征高風(fēng)險(xiǎn)（7/13），其中3 例父母進(jìn)行了CMA 驗(yàn)證，結(jié)果顯示1 例（病例5）變異是新發(fā)突變，另外兩例（病例3 和11）是遺傳自表型正常的母親（表1 和圖1 和圖2）。

圖1 染色體16P13.11 微重復(fù)區(qū)域的表示Fig.1 Scale representation of the microduplication region of chromosome 16P13.11

圖2 染色體16P13.11 微重復(fù)胎兒（病例3、5、11 和13）的家族譜系Fig.2 Family pedigree of fetuses（case 3，5，11 and 13）with microduplications of chromosome 16P13.11

表1 在神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常產(chǎn)前組中13 例攜帶16p13.11 微重復(fù)的病例信息Tab.1 Information of the 13 cases with 16p13.11 microduplication in the prenatal group without abnormal nervous system

2.2 隨訪結(jié)果 隨訪13 例攜帶16p13.11 微重復(fù)胎兒的妊娠結(jié)局。病例13 的父母因?yàn)樘盒呐K異常而選擇終止妊娠，病例11 和病例12 的父母繼續(xù)妊娠中，且在后期的產(chǎn)檢中未觀察到其他結(jié)構(gòu)異常。其余10 例胎兒（病例1-10）足月出生。我們對(duì)胎兒的產(chǎn)后健康進(jìn)行追蹤，主要關(guān)注神經(jīng)心理發(fā)育、顱面畸形、先天性缺陷和骨骼異常等。在這些胎兒中未觀察到明顯的異常，并且他們的生長(zhǎng)和發(fā)育符合同齡標(biāo)準(zhǔn)，但仍需長(zhǎng)期的隨訪調(diào)查（表1）。

2.3 16p13.11 微重復(fù)檢出率的比較 在神經(jīng)認(rèn)知障礙患者組和神經(jīng)系統(tǒng)異常產(chǎn)前組中未檢測(cè)到16p13.11 微重復(fù)。神經(jīng)認(rèn)知障礙患者組（0.00%）與神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常產(chǎn)前組（0.22%）的檢出率進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.711）。由于患者組的樣本量較小，我們將神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常產(chǎn)前組的檢出率與文獻(xiàn)［4，14］中的患者組進(jìn)行比較（P=0.489），兩組間的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

3 討論

CMA 具有高分辨率，準(zhǔn)確性高，不需要進(jìn)行組織培養(yǎng)從而縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間的特點(diǎn)，因此特別適合產(chǎn)前檢測(cè)［15］。但CMA 的臨床應(yīng)用存在一定局限性，由于基因型和表型不完全對(duì)應(yīng)，特定CNV 的潛在功能意義可能是未知的，被稱為臨床意義不明（variants of uncertain significance，VOUS）的變異體，最初將3 個(gè)區(qū)域（16p13.11、15q13bp1-5 和近端1q21）的重復(fù)序列歸類為VOUS［16］。由于復(fù)雜的臨床異質(zhì)性以及在“看似”正常的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)相似或相同的微重復(fù)，導(dǎo)致在家系研究后，16P13.11 微重復(fù)的臨床表型尚存在爭(zhēng)議。因此，本研究通過(guò)對(duì)病例隊(duì)列和對(duì)照人群的大數(shù)據(jù)分析比較，將特定基因組區(qū)域與疾病聯(lián)系起來(lái)，這將極大地提高我們對(duì)整個(gè)基因組和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能重要性的認(rèn)識(shí)，并且據(jù)我們所知，這是第一篇關(guān)于16p13.11 微重復(fù)在產(chǎn)前檢測(cè)中的臨床致病性報(bào)道。

從分子角度來(lái)看，NDE1 是16p13.11 片段上與神經(jīng)系統(tǒng)表型相關(guān)的最強(qiáng)候選基因，它是由10 個(gè)外顯子組成，編碼中心體蛋白，該蛋白質(zhì)參與大腦發(fā)育過(guò)程中的有絲分裂、神經(jīng)元遷移，在人腦的皮質(zhì)生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。該蛋白質(zhì)含有自結(jié)合結(jié)構(gòu)域、LIS1 相互作用結(jié)構(gòu)域和C 端保守結(jié)構(gòu)域［17］。NDE1/LIS1/NDEL1 復(fù)合物介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)，是精神分裂癥通路的一部分［18］。NDE1 基因突變會(huì)導(dǎo)致無(wú)腦畸形，這是一種以大腦皮層缺乏褶皺、嚴(yán)重腦萎縮、小頭畸形和嚴(yán)重認(rèn)知障礙為特征的疾病。然而FUJITANI 等［19］通過(guò)NDE1 和FOPNL 的過(guò)表達(dá)，進(jìn)行功能獲得性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)它們的過(guò)表達(dá)未改變皮質(zhì)腦室下區(qū)，徑向膠質(zhì)細(xì)胞或基底祖細(xì)胞的數(shù)量。雖然這些基因的拷貝數(shù)缺失已經(jīng)導(dǎo)致了動(dòng)物模型的神經(jīng)學(xué)表現(xiàn)，但拷貝數(shù)增加的表型后果仍然不清楚。因此，這些基因的重復(fù)在行為和認(rèn)知障礙中的作用只是推測(cè)，進(jìn)一步描述這些基因的潛在影響將增強(qiáng)我們對(duì)相關(guān)臨床表型的理解。

從臨床表型來(lái)看，16p13.11 微重復(fù)患者具有廣泛的臨床表型并且嚴(yán)重程度不同［20-24］。一項(xiàng)研究總結(jié)了10 例攜帶16p13.11 微重復(fù)患者的臨床表型顯示，5 例患有運(yùn)動(dòng)和語(yǔ)言發(fā)育遲緩，6 例患有行為異常，2 例患有社交障礙［5］。然而，關(guān)于16p13.11 微重復(fù)與臨床的相關(guān)性不確定，因?yàn)閿y帶者可能異常，也可能完全正常。HANNES 等［11］發(fā)現(xiàn)該變異與正常表型相容，并認(rèn)為該重復(fù)可能是真正的良性變異。我們的發(fā)現(xiàn)與其一致，因?yàn)樵谖覀兊难芯恐?，神?jīng)認(rèn)知障礙患者組或神經(jīng)系統(tǒng)異常產(chǎn)前組中未檢測(cè)到16p13.11 微重復(fù)。相反，13 例16p13.11 微重復(fù)的攜帶者屬于神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常產(chǎn)前組。此外，患者組和對(duì)照組之間的檢出率沒(méi)有顯著差異。由于本研究中患者組的樣本量較小，我們將神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)異常產(chǎn)前組的檢出率與文獻(xiàn)中患者組的檢出率進(jìn)行比較，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。特別是1 ～10 例胎兒在出生后未觀察到特異的臨床表型，這支持了我們的假設(shè)，即產(chǎn)前檢測(cè)到的16p13.11 微重復(fù)可能是良性的。這可能與環(huán)境因素、不完全外顯率或可變表達(dá)有關(guān)。但是，我們?cè)诋a(chǎn)前就發(fā)現(xiàn)了這些微重復(fù)，需要長(zhǎng)期的隨訪來(lái)確認(rèn)該重復(fù)是否會(huì)有其他臨床癥狀。

我們的病例中有1 例因?yàn)樘盒呐K異常而引產(chǎn)。SHIMOJIMA 等［25］描述了1 例并發(fā)19p13.3 微缺失的嬰兒，在3 個(gè)月大時(shí)患有室間隔和主動(dòng)脈瓣缺損，但在16p13.11 片段上尚未發(fā)現(xiàn)與這些疾病相關(guān)的基因。16p13.11 微重復(fù)臨床表型的多樣性可能與“二次打擊”學(xué)說(shuō)相關(guān)，或調(diào)節(jié)元件microRNA（hsa-miR1972 和hsa-miR484）與其他基因修飾物相互作用導(dǎo)致的［5］。由此可見(jiàn)，16p13.11微重復(fù)的致病性復(fù)雜，但具體機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們將6 722 例樣本匯聚在一起，以確定16p13.11 微重復(fù)攜帶者會(huì)有哪些臨床表型。具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）這是第一篇關(guān)于16P13.11 微重復(fù)在產(chǎn)前診斷的研究，在孕婦進(jìn)行遺傳咨詢時(shí)，我們的研究有一定的參考價(jià)值。（2）我們不僅探討了16p13.11 微重復(fù)的臨床表型，并且將臨床表型與分子機(jī)制聯(lián)系起來(lái)，以期幫助對(duì)此片段進(jìn)行更深層次的遺傳學(xué)研究。本研究的局限性：（1）缺乏對(duì)因心臟異常而引產(chǎn)胎兒的病理學(xué)研究，探討其潛在的分子機(jī)制。（2）由于父母的焦慮情緒，我們無(wú)法獲得更多的樣本進(jìn)行父母驗(yàn)證。在后續(xù)的研究中，我們將會(huì)更加注重樣本的留取和保存，以期在分子機(jī)制上有更進(jìn)一步的研究和發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，我們?cè)诋a(chǎn)前檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)了13 例攜帶16p13.11 微重復(fù)包含NDE1 基因的胎兒，除1 例引產(chǎn)外，其余12 例均健康。鑒于16p13.11 微重復(fù)的低外顯率特征，我們認(rèn)為16p13.11 微重復(fù)很可能是良性的。然而，16p13.11 微重復(fù)的可變表達(dá)是復(fù)雜的，需要進(jìn)一步研究。此外，盡管所有分娩的嬰兒在撰寫(xiě)本文時(shí)仍保持健康，但這些個(gè)體需要持續(xù)隨訪。

【Author contributions】ZHANG Miaomiao performed the experiments and wrote the article.FANG Yuqin performed the experiments.TANG Junxiang and WANG Chaohong revised the article.SUN Yuxiu and ZHU Jiansheng designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.