于 雪 王超萍 任艷華 王 博 付廣青 房經(jīng)貴，*

（1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095； 2山東省葡萄研究院，山東 濟南 250199；3江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 南京 210014）

葡萄是產(chǎn)業(yè)鏈最長、全球最重要的果樹之一。由于葡萄果實品質(zhì)是葡萄酒的主要影響因素，葡萄酒的感官屬性與其地理來源相關(guān)。雖然葡萄的環(huán)境適應(yīng)性較強，但生長條件的差異會對釀酒葡萄的果實性狀產(chǎn)生重大影響［1］。

紅葡萄酒葡萄（Vitis viniferaL.）品種美樂是早熟品種，能夠適應(yīng)不同的氣候條件［2］，是世界上栽培最多的葡萄品種之一。全球美樂葡萄園面積約為260 000 hm2，在意大利，約有25 000 hm2土地專門用于種植美樂［3］。在我國，山東省是美樂葡萄主栽地區(qū)，集中分布于膠東半島，在魯中、魯北等地區(qū)有零星分布［4］。美樂葡萄酒作為市場上最受歡迎的紅酒品種之一，既可用于制作單一品種葡萄酒，也可用于制作混合葡萄酒。

前人研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)色期到成熟期是葡萄漿果變化最大以及內(nèi)在品質(zhì)形成的關(guān)鍵時期［5］。此階段與果實成熟過程有關(guān)，包括顏色、風(fēng)味和香氣的變化等［6-9］。進入轉(zhuǎn)色期之后葡萄樹體的生理代謝增強，其中與品質(zhì)形成相關(guān)的K+的日積累速率增加2～4 倍，韌皮部流動水分的速度增加了10倍［5］。

為了探究美樂葡萄在山東的品質(zhì)表現(xiàn)，本研究對膠東半島乳山種植的美樂的糖、酸、花青素和酚類等品質(zhì)性狀及其在果實轉(zhuǎn)色期的變化特點進行分析，并與德州地區(qū)種植的美樂品質(zhì)性狀等進行比較分析。進一步利用RNA-seq 分析從分子水平上解析兩地美樂葡萄果實品質(zhì)異同的機理，旨在對膠東半島美樂葡萄的品質(zhì)特征及其與德州美樂葡萄的品質(zhì)差異進行分析，為在膠東半島進一步發(fā)展美樂葡萄以及美樂葡萄的引種推廣提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以山東德州奧德曼酒莊（DZ）與乳山臺依湖酒莊（RS）的美樂葡萄果實為試驗材料。葡萄采用籬架樹形，樹齡為5～10年。德州酒莊美樂產(chǎn)量為9 t·hm-2，乳山產(chǎn)量為3.6 t·hm-2。葡萄園均采用常規(guī)管理措施。乳山臺依湖酒莊（36.89°N，121.52°E），地處山東半島東南端、膠東低山丘陵區(qū)，暖溫帶東亞季風(fēng)型大陸性氣候，年平均日照時數(shù)2 095.5 h，年平均氣溫12.4 ℃，年降水量428.3～458.8 mm；德州奧德曼酒莊（37.45°N，116.29°E），地處山東西北部、黃河下游沖積平原，溫帶季風(fēng)氣候，年平均日照時數(shù)2 592 h，年平均氣溫12.9 ℃，平均無霜期長達208 d，年平均降水量為547.5 mm。

樣品分別在轉(zhuǎn)色階段（50%的漿果開始變色，M）和成熟期（T）收集。樣品收集后立即在液氮中單獨冷凍。將所有樣品儲存在-80 °C條件下，以備后續(xù)分析。

1.2 生理生化指標(biāo)測定

采用游標(biāo)卡尺測定果實縱向直徑和橫向直徑，采用電子天平測定粒重；總可溶性固形物（total soluble solid）由PAL-1 手持測糖儀（Atago，日本）測定；總花色苷的測定參照糾松濤［10］的方法，采用pH 值示差法；參照Guan 等［11］的方法，使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）測定花色苷成分?？偡拥臏y定采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［12］；使用氫氧化鈉溶液滴定法測定可滴定酸含量［13］；可溶性糖含量的測定參考文獻［14］。

1.2.1 果實糖組分和有機酸組分的提取與測定 糖酸的測定采用高效液相色譜法，參照先前報道的方法并加以改良［15-16］。取0.2 g 果肉粉末于2 mL 離心管中，加入1.5 mL 超純水；80 ℃加熱30 min；加熱后12 000 r·min-1條件下離心10 min，吸取上清液到干燥的容器中（10 mL 管）；重復(fù)上述步驟2 次。合并2 次的上清液，吸取上清液過濾到進樣瓶，待測。

糖組分的測定色譜條件：采用HPLC-MLSD 色譜儀（安捷倫，上海），Prevail Carbohydrate ES 5μ柱（100 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：V（乙腈）∶V（水）=80∶20；柱溫：50 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。有機酸組分的測定色譜條件：色譜柱為Discovery C18 柱（25 cm×4.6 mm，5 m）；流動相為50 mmol·L-1的K2HPO4溶液，用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至2.4；柱溫30 ℃；流速0.5 mL·min-1；進樣量2 μL；檢測波長為210 nm。

1.2.2 果實香氣含量的分析 葡萄果實香氣的提取采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid phase microextraction，HS-SPME）技術(shù)。提取方法參照文獻［17］并進行了改良：稱取3 g 研碎的葡萄果實裝到20 mL 的頂空瓶中，向其中加入3 mL 飽和NaCl 溶液，再加入2 μL 色譜級3-辛醇（使用乙醇梯度稀釋至萬分之一濃度）作為內(nèi)標(biāo)，加蓋并與柱面混合器混合10 min，插入50/30 μm PDMS/DVB/CAR SPME 萃取頭（Supelco，美國）。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatograohy-mass spectrometry，GC-MS）測定：使用J＆W 122-4732 DB-17ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱在GC-MS/MS Quantum TSQ 9000/TRACE 1310（Thermo Fisher Scientific，美國）上進行分析。MS條件：質(zhì)譜儀采用EI模式，電壓為70 eV；離子源溫度為230 ℃；掃描速率為2.88 scan·s-1；質(zhì)譜檢測范圍為29～540 m/z，載氣為氦氣，流速為1.0 mL·min-1。

1.3 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

使用十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）方法提取總RNA。文庫制備和轉(zhuǎn)錄組測序由北京新近紀(jì)科技股份有限公司完成。使用DESeq2 進行差異表達基因（differential gene expression）分析。采用clusterProfile（4.2.1）軟件對GO富集和KEGG通路進行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019 軟件處理數(shù)據(jù)，使用TBtools v1、Prism 8.0.2 制圖，并使用SPSS 17.0 和Blast2GO分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 美樂葡萄在兩地成熟期的品質(zhì)特征

分析表明，兩個地區(qū)美樂葡萄成熟期果實特征相似（圖1）。乳山臺依湖酒莊（以下稱乳山）與德州奧德曼酒莊（以下稱德州）收集的葡萄果實的粒重、橫徑、縱徑、TSS、可溶性糖以及總有機酸分別相差0.41 g、0.247 mm、0.98 mm、2.1 個百分點、0.505 個百分點、0.188 個百分點。花色苷、酚含量差異較大，乳山葡萄含量分別為0.385、8.553 mg·g-1，德州為3.576、12.278 mg·g-1，相差3.196、3.735 mg·g-1。乳山葡萄果實中可溶性糖和總有機酸含量高于德州，總花色苷、總酚、粒重、橫徑、縱徑以及TSS含量低于德州。

圖1 美樂葡萄在乳山和德州的轉(zhuǎn)色期和成熟期生理指標(biāo)的測定Fig.1 Determination of physiological indicators of Véraison stage and maturity stage of Merlot berries in Rushan and Dezhou

葡萄果實中酸成分主要包括檸檬酸、蘋果酸、酒石酸，糖成分主要包括葡萄糖和果糖。本研究結(jié)果如圖1 所示，乳山和德州葡萄果實主要酸成分都為酒石酸且差異極顯著，分別為3.271、2.666 mg·g-1。乳山果實中蘋果酸和檸檬酸含量與酒石酸分別相差1.925、3.15 mg·g-1，德州分別相差0.883、2.34 mg·g-1。乳山葡萄果實中的葡萄糖和果糖含量都高于德州，分別相差5.288、1.111 mg·g-1。

進一步分析兩地差異較大的花色苷、酚的種類及主要成分含量發(fā)現(xiàn)（圖2），雖然乳山葡萄果實花色苷種類為25 種，德州為14 種，但德州花色苷主要成分含量高于乳山。德州葡萄果實中總酚含量是乳山的1.4倍。兩種果實的主要多酚成分含量差異顯著或極顯著。表沒食子兒茶素為乳山漿果中檢測到的主要多酚成分，是表兒茶素沒食子酸酯含量的60 倍。表兒茶素沒食子酸酯為德州漿果中檢測到的主要多酚成分，是原花青素B1含量的76倍。

圖2 美樂葡萄在乳山和德州成熟期花色苷及多酚分析Fig.2 Analysis of anthocyanins and polyphenols in the ripening stages of Merlot grapes in Rushan and Dezhou

2.2 兩地果實從轉(zhuǎn)色期到成熟期品質(zhì)特征的變化

在轉(zhuǎn)色時期，美樂葡萄在兩個酒莊的品質(zhì)性狀存在一定差異（圖1）。乳山葡萄果實中總有機酸含量、橫徑、縱徑、粒重高于德州，可溶性糖、TSS、總花色苷、總酚含量低于德州。可溶性糖、總酚、花色苷、TSS 含量在不同的環(huán)境條件下差異極顯著?？扇苄蕴恰⒖偡右约癟SS相差3.797個百分點、3.133 mg·g-1、2.133個百分點。德州葡萄果實中總花色苷含量是乳山的9倍。

從轉(zhuǎn)色期到成熟階段，美樂的品質(zhì)在各方面均發(fā)生變化（圖1）。葡萄果實有機酸含量降低，可溶性糖、TSS、總花色苷、總酚、橫徑、縱徑、粒重均升高。其中，兩個地區(qū)總有機酸、TSS、總酚、粒重變化量相近，乳山果實變化量分別為0.579個百分點、2.033個百分點、4.17 mg·g-1、0.367 g，德州分別為0.562 個百分點、2.133 個百分點、4.776 mg·g-1、0.82 g。乳山果實中可溶性糖含量在轉(zhuǎn)色到成熟階段變化較大，為6.709 個百分點，德州為2.41 個百分點。德州葡萄果實中總花色苷含量變化較大，為3 mg·g-1，乳山變化量為0.321 mg·g-1。

2.3 兩個地區(qū)收集的成熟階段美樂葡萄的轉(zhuǎn)錄組分析

為了了解美樂葡萄在不同產(chǎn)區(qū)基因的表達情況，對德州奧德曼和乳山臺依湖酒莊的美樂葡萄的轉(zhuǎn)色和成熟階段進行轉(zhuǎn)錄組分析，并將獲得原始數(shù)據(jù)進行整理。測序質(zhì)量良好，測序數(shù)據(jù)可用于進一步分析。

分析結(jié)果表明，兩地均是轉(zhuǎn)色期的基因數(shù)量多于成熟期（表1）。轉(zhuǎn)色期到成熟期，乳山和德州基因數(shù)量分別減少295、37 個。兩個時期數(shù)量相近，乳山的基因數(shù)量較多，分別為22 157、21 862 個。進一步以Padj≤0.05 和|log2FoldChange|≥1 作為篩選差異表達基因（DEGs）的閾值，發(fā)現(xiàn)乳山的DEGs 表達數(shù)量較多，為5 695，約占所有表達基因的26%；德州的表達基因數(shù)量為4 488個，占所有表達基因的22%。

表1 不同地區(qū)不同時期表達基因數(shù)和DEG數(shù)Table 1 The number of expressed genes and the number of DEGs in each winery in different periods

進一步總結(jié)分析DEGs的上調(diào)和下調(diào)基因，發(fā)現(xiàn)兩個地區(qū)的上調(diào)基因數(shù)量均少于下調(diào)基因數(shù)量。乳山的上下調(diào)基因數(shù)量分別為2 340、3 355 個，德州的分別為2 092個、2 396個（圖3-B）。比較兩個酒莊美樂葡萄的DEGs，發(fā)現(xiàn)有1 610個相同的基因（圖3-A）。根據(jù)Padj≤0.05 和|log 2(FoldChange) |≥1 的閾值篩選出DEGs（圖3-C），分析轉(zhuǎn)色時期與成熟時期兩個地區(qū)不同染色體上的差異基因表達水平。結(jié)果表明，同一產(chǎn)區(qū)高表達基因在轉(zhuǎn)色期和成熟期的變化趨勢相似。

圖3 兩個地區(qū)美樂葡萄的 DEG 分析Fig.3 DEG analysis of Merlot grapes in two regions

2.4 差異表達基因GO 功能分析和KEGG 代謝通路分析

使用Blast2GO中的GOseq方法進行分析，認(rèn)為Padj≤0.05的GO條目明顯更豐富。富集到836組生物功能，包括生物過程431組、細(xì)胞組分113組和分子功能292組。其中，碳水化合物分解代謝過程、羧酸生物合成過程、丙酮酸代謝過程、糖酵解過程、有機酸代謝過程，磷酸核糖生物合成過程，谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程顯著富集，表明這些代謝途徑的基因可能是導(dǎo)致果實品質(zhì)形成差異的主要因素（表2）。

表2 兩個地區(qū)的差異表達基因GO功能分析Table 2 Analysis of GO function of differentially expressed genes in two regions

將每個產(chǎn)區(qū)的DEG 映射到KEGG 數(shù)據(jù)庫，乳山和德州均注釋了114條KEGG途徑。為了進一步總結(jié)與漿果品質(zhì)形成相關(guān)的生物學(xué)途徑，本研究選擇了10 個重要途徑進行分析（表3）。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乳山在檸檬酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝途徑中富集的DEGs數(shù)量分別為32、36個，德州的數(shù)量分別為18、24個。兩個地區(qū)主要酸成分都為酒石酸，其中乳山的酸成分含量高于德州。酒石酸的生物合成始于L-抗壞血酸。兩個地區(qū)在抗壞血酸和醛糖代謝途徑中富集的DEGs 數(shù)量均為22個，但德州的下調(diào)數(shù)量較多，為16個。對于糖成分含量，乳山在果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝途徑中富集的DEGs數(shù)量分別為34、60個，德州為22、44個。

表3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中與性狀相關(guān)的代謝途徑及DEG 數(shù)Table 3 Trait-related metabolic pathways and number of DEGs in transcriptome data

3 討論

葡萄是世界上種植較為廣泛的多年生水果作物之一。葡萄在不同環(huán)境中生長的果實品質(zhì)存在差異。同時這種變異性也使現(xiàn)有品種適應(yīng)特定的種植區(qū)域，并產(chǎn)生不同風(fēng)格的葡萄酒。

葡萄果實的花色苷含量和組成受溫度、光照和濕度等環(huán)境因素的影響［18］。研究發(fā)現(xiàn)，在適度的光照條件下，大多數(shù)葡萄品種的花色苷含量會隨著光照強度的增加而增加［19-20］，適宜的溫度也可以促進花青素的合成［21-23］。本研究中，德州美樂葡萄的總花色苷含量高于乳山（圖1），可能由于德州有更適宜美樂栽培的溫度、光照和濕度。Qin 等［24］研究表明，烏魯木齊的光照強度、溫度和濕度較低，更有利于酚類物質(zhì)的積累。本研究中，德州葡萄果實的多酚含量高于乳山，可能與德州較低的光照強度、溫度和濕度相關(guān)。此外，在主要檢測出的6 種多酚組分中，由于生態(tài)環(huán)境的差異，成分含量產(chǎn)生了較大差異。其中，乳山葡萄果實中檢測到的主要多酚成分為表沒食子兒茶素，德州的主要多酚成分為表兒茶素沒食子酸酯。糖和酸的含量也受葡萄自身以及外界生長環(huán)境的影響。前人研究發(fā)現(xiàn)，對糖分積累影響較大的氣象因子有日平均氣溫、日照時數(shù)、最高氣溫、降水量等，其中降水量的增加不但會降低葡萄園的光照，阻礙光合作用，影響果實成熟，而且葡萄成熟期過多的降水還會導(dǎo)致葡萄果實中風(fēng)味物質(zhì)濃度降低［25-27］。另外，毛如志等［28］研究發(fā)現(xiàn)，高海拔產(chǎn)區(qū)的美樂葡萄比低海拔產(chǎn)區(qū)果實積累更多的有機酸和糖類等物質(zhì)。本試驗中，乳山葡萄果實的可溶性糖、總有機酸含量均高于德州，推測與其低降水量和較高海拔有關(guān)。

葡萄中的主要花色苷包括矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（cyanidin-3-O-glucoside）、牽?；ㄋ?3-O-葡萄糖苷（petunidin-3-O-glucoside）、飛燕草素-3-O-葡萄糖苷（dephinidin-3-O-glucoside）、錦葵素-3-O-葡萄糖苷（peonidin-3-O-glucoside）和牡丹素-3-O-葡萄糖苷（malvidin-3-O-glucoside）［29］。這些單體花色苷進一步經(jīng)歷?；蚓酆?，形成花色苷衍生物［30］。本研究中，山東兩個地區(qū)美樂葡萄中花色苷的主要成分為錦葵素-3-O-葡萄糖苷及其?；苌铮▓D2），與前人研究結(jié)果一致［29，31］。德州美樂葡萄中花色苷含量高于乳山，與德州花色苷主要成分的含量較高相關(guān)。

為了進一步總結(jié)與葡萄果實品質(zhì)形成相關(guān)的機制，對差異表達基因進行了GO功能分析和KEGG代謝通路分析。分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)或下調(diào)基因的數(shù)量可能與果實表現(xiàn)出的農(nóng)藝性狀有關(guān)。葡萄果實中的可滴定酸含量較低，但可滴定酸對果實品質(zhì)有重要影響。兩個地區(qū)葡萄果實的主要酸成分都為酒石酸。酒石酸由L-抗壞血酸合成。在壞血酸和醛糖代謝途徑中，乳山上調(diào)基因較多，可能導(dǎo)致其較高的酸含量。另外，乳山在檸檬酸循環(huán)、乙醛酸和二羧酸代謝途徑中富集的DEGs 數(shù)量以及上調(diào)基因數(shù)量均高于德州。葡萄屬于己糖積累型果樹，成熟果實中可溶性糖主要為葡萄糖和果糖［32-33］。糖分來源于光合產(chǎn)物的運輸與積累，蔗糖是主要的光合產(chǎn)物，在果實中經(jīng)轉(zhuǎn)化酶分解為葡萄糖和果糖。本研究中乳山淀粉和蔗糖代謝途徑差異基因以及上調(diào)基因均多于德州，可能導(dǎo)致乳山較高的糖含量［34］。另外，果實中糖含量取決于糖代謝關(guān)鍵酶的活性與含量［35］。乳山轉(zhuǎn)錄組中，與果糖-葡萄糖生物合成和代謝相關(guān)的α-淀粉酶、蔗糖合酶和己糖激酶的上調(diào)基因數(shù)量均多于德州。

4 結(jié)論

本研究通過比較分析乳山和德州兩地美樂葡萄果實的生理指標(biāo)粒重、橫徑、縱徑和TSS、可溶性糖、總有機酸、酚、花色苷含量，發(fā)現(xiàn)兩地區(qū)美樂葡萄品質(zhì)各具區(qū)域特色，其中德州地區(qū)葡萄果實中花色苷、酚類含量較高，乳山地區(qū)的可溶性糖和總有機酸含量較高。此外，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)構(gòu)建的兩地區(qū)美樂葡萄在轉(zhuǎn)色期和成熟期的差異表達，進一步解釋了兩地葡萄果實中糖酸含量差異的原因。