王 娟，王帥勇，虞凌雪，張毅峰，嚴(yán)杰聰，王曼茱，周艷君，單同領(lǐng)，童 武，鄭 浩，童光志，于 海,2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

蓋塔病毒（Getah virus,GETV）是一種蟲(chóng)媒病毒，屬于披膜病毒科甲病毒屬。GETV是一種單股正鏈RNA病毒，基因組長(zhǎng)約11.5 kb，含有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame,ORF）[1]，病毒基因組5'端前2/3部分編碼病毒非結(jié)構(gòu)蛋白（包括nsp1、nsp2、nsp3和nsp4），負(fù)責(zé)病毒RNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，多聚蛋白質(zhì)的切割和RNA帶帽過(guò)程（Capping）[2]。病毒基因組后1/3部分為病毒結(jié)構(gòu)基因，編碼病毒多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，包括C（Capsid，衣殼蛋白）、E3、E2、6K和E1[2]。進(jìn)入宿主的病毒顆粒被分解后，釋放病毒正鏈RNA并將非結(jié)構(gòu)蛋白翻譯為多蛋白。在切割nsp4后，復(fù)制復(fù)合體合成來(lái)自基因組RNA的負(fù)鏈。非結(jié)構(gòu)蛋白多蛋白進(jìn)一步被切割成單個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)而合成基因組和亞基因組正鏈RNA。亞基因組RNA翻譯結(jié)構(gòu)蛋白形成核衣殼包裝病毒基因組RNA，繼而形成新的病毒[3]。當(dāng)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí)，E2糖蛋白在受體相互作用中起著重要作用。有證據(jù)表明，E2糖蛋白的氨基酸序列發(fā)生微小的甚至是單一的變化都會(huì)改變病毒所利用的細(xì)胞受體；因此，在甲病毒屬中，E2蛋白通常是病毒特異性的，而且基因序列相對(duì)保守[3]。

GETV廣泛分布于亞洲和大洋洲，宿主范圍廣泛，包括蚊子、馬、豬、牛和藍(lán)狐[4-8]。馬匹感染GETV后出現(xiàn)發(fā)熱性疾病，厭食癥，后肢水腫，步態(tài)僵硬，蕁麻疹和下頜下淋巴結(jié)腫大，馬被認(rèn)為是GETV擴(kuò)增和傳播的重要宿主[9]。GETV感染母豬會(huì)使其流產(chǎn)，感染仔豬則出現(xiàn)震顫和抑郁、腹瀉、后肢癱瘓和高死亡率[10-11]。血清學(xué)調(diào)查顯示，在云南省，包括豬、牛和家禽在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物都發(fā)生了感染。有文獻(xiàn)報(bào)道GETV可以感染人并致使人發(fā)燒。在馬來(lái)西亞、澳大利亞北部和中國(guó)海南省的一些人的血清中檢測(cè)到了GETV的中和抗體，這說(shuō)明研究GETV是具有潛在的公共衛(wèi)生學(xué)意義的，雖然還沒(méi)有關(guān)于GETV引起人類疾病的報(bào)告[1]。

GETV于1955年首次在馬來(lái)西亞捕獲的庫(kù)蚊標(biāo)本被分離到，后來(lái)在多種蚊子和動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。多年來(lái)，GETV逐漸從馬來(lái)西亞擴(kuò)散到中國(guó)、俄羅斯、大洋洲等，已經(jīng)成為歐亞大陸地區(qū)的“新發(fā)蚊傳蟲(chóng)媒病毒”[1,5]。日本于1978年、1979年、1983年、2014年和2015年暴發(fā)了馬匹GETV感染疫情[5,12]。1990年，印度馬群中也出現(xiàn)了流行性GETV感染。1964年在海南省分離出中國(guó)第1株蚊蟲(chóng)GETV毒株，命名為M1。此后，在海南省、云南省、四川省、貴州省、甘肅省、吉林省、河北省、山西省等多個(gè)省份的蚊蟲(chóng)中都檢測(cè)到了GETV[5]。豬源性GETV感染病例于2002年在臺(tái)灣首次被發(fā)現(xiàn)，隨后在河南?。?005年）、湖南?。?017年）、安徽?。?017年）和四川?。?018年）發(fā)現(xiàn)[10-11]。2017年，山東藍(lán)狐發(fā)生GETV感染，可能與食用感染GETV的豬肉產(chǎn)品有關(guān)[8]。2018年吉林省患有發(fā)熱性疾病的牛體內(nèi)發(fā)現(xiàn)GETV，牛血清組陽(yáng)性率為83.3%（40/48）。2018年8月，在廣東省的發(fā)熱的馬匹中發(fā)生了中國(guó)首例馬源GETV感染[13]。以上流行病學(xué)資料表明，GETV在我國(guó)廣泛流行，對(duì)我國(guó)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物特別是豬有嚴(yán)重的影響。而且豬是自然界中GETV的主要擴(kuò)增宿主，可以產(chǎn)生足夠高的病毒血癥滴度來(lái)感染叮咬的蚊子并維持GETV的傳播周期[5,14-15]，所以定期對(duì)豬群進(jìn)行GETV監(jiān)測(cè)對(duì)于預(yù)防潛在的GETV暴發(fā)具有重要意義。因此，有一個(gè)正確的工具來(lái)快速、具體地檢測(cè)豬群中GETV感染是非常有必要的，而目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有建立針對(duì)豬源GETV相關(guān)的熒光定量PCR檢測(cè)方法。本研究旨在建立一種快速檢測(cè)和定量豬源GETV的熒光定量PCR方法，為GETV監(jiān)測(cè)提供簡(jiǎn)便、快速、可靠的技術(shù)工具。

1 材料與方法

1.1 毒株、核酸樣品與試劑 豬源蓋塔病毒（GETV）由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、豬2型圓環(huán)病毒（Porcine circovirus type 2,PCV2）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、豬流感（Swine influenza virus,SIV）均由本實(shí)驗(yàn)室提供。病毒核酸抽提試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、熒光定量PCR混合酶、rTaqDNA聚合酶、DNA Marker等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司；大腸桿菌DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物和探針的設(shè)計(jì)與合成 參考WHO推薦檢測(cè)方法，用MegAlign軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離株及GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的GETV編碼E2蛋白的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析，選擇高度保守區(qū)域，用Oligo7軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物和TaqMan熒光探針。上游引物序列為：5'-AGCGACAAGACTATCAATTCGT-3'，下游引物序列為：5'-TGCACTTTACCTTTGCGAGAC-3'，TaqMan探針序列為：5'FAM-TTGTCCCTAGAGCCG ACCAGT-BHQ3'；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為128 bp。此外，利用E2基因高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)常規(guī)PCR引物用于制備陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品。上游引物序列為5'-CGCAGCAGTCAGGTAATGTAA-3'，下游引物序列為：5'-TAGACTCCGGTACGTCA-3'；擴(kuò)增目的片段的大小為353 bp。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，TaqMan探針由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.3 病毒RNA的提取和cDNA合成 按照RNeasy Plus Mini RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒總RNA。以16 μL總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體系為20 μL，包含16 μL總RNA、4 μL混合反轉(zhuǎn)錄酶，混勻后于37℃水浴作用15 min，然后85℃滅活5 s，得到cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

1.4.1 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備 用標(biāo)準(zhǔn)品引物擴(kuò)增GETV的E2基因，PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：Pfu DNA聚合酶1 μL、10× Buffer 5 μL、dNTP mix（10 mmol/L）1 μL、上、下游引物（E2-F/R，10 μm/mL）均1 μL、cDNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)至終體積50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min；95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化目的片段，克隆到PLB載體上，轉(zhuǎn)化至DH5α大腸埃希氏菌中，提取質(zhì)粒測(cè)定序列。選取符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期的質(zhì)粒即陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品并用超微量紫外可見(jiàn)分光光度測(cè)定其濃度，根據(jù)公式計(jì)算出質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)并進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物的特異性檢測(cè) 采用普通PCR方法，用設(shè)計(jì)好的引物，以陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行引物特異性鑒定。反應(yīng)體系：rTaq酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，質(zhì)粒1 μL，用ddH2O補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s；72℃再延伸10 min，4℃保存10 min。電泳后紫外燈下觀察并拍照。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取已稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品不同稀釋度分別作為標(biāo)準(zhǔn)模板，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，優(yōu)化引物和探針的反應(yīng)濃度、Tm值及反應(yīng)時(shí)間，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，熒光定量PCR儀自動(dòng)生成擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線，即本方法的標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程。

1.4.4 特異性試驗(yàn) 用建立的方法對(duì)PRRSV、PCV2、PRV、PEDV、SIV進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證本方法的特異性。

1.4.5 敏感性試驗(yàn) 對(duì)毒價(jià)為3.16×107TCID50/mL的GETV進(jìn)行10倍系列稀釋后對(duì)各個(gè)稀釋度的病毒進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，評(píng)估本方法的敏感性。同時(shí)用普通PCR方法檢測(cè)系列稀釋的病毒，檢測(cè)普通PCR方法的敏感性，與本方法進(jìn)行比較。

1.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)4份不同滴度的GETV感染樣品提取RNA進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)試驗(yàn)。同一次每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別在不同的3個(gè)時(shí)間段進(jìn)行熒光定量PCR試驗(yàn)。根據(jù)檢測(cè)所得Ct值計(jì)算組內(nèi)及組間標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)（CV），評(píng)估該方法的重復(fù)性。

1.4.7 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的豬血清樣品按照試劑盒說(shuō)明提取RNA，分別用本研究建立的熒光定量PCR方法和普通PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的制備 通過(guò)普通PCR擴(kuò)增獲得部分保守E2基因片段，克隆到PLB載體中，對(duì)其進(jìn)行PCR鑒定，得到約353 bp的單一條帶，符合預(yù)期（圖1），后續(xù)測(cè)序結(jié)果與參考序列一致。重組陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的濃度為260 ng/μL，大小為3327 bp，代入公式：拷貝數(shù)（copies）=（質(zhì)量/分子量）×6.02×1023進(jìn)行計(jì)算，得出陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的DNA拷貝數(shù)為7.13×1010copies/μL。先用DEPC水將陽(yáng)性質(zhì)粒稀釋至1×1010copies/μL，再10倍梯度稀釋，置于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 GETV PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of GETV fragments

2.2 引物的特異性檢測(cè) 通過(guò)普通PCR方法，用熒光定量引物，以陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，鑒定引物特異性。PCR擴(kuò)增出的條帶單一，大小符合預(yù)期（圖2），表明引物的特異性良好。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR amplification of positive plasmid

2.3 擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線 選取1×102～1×109copies/μL共8個(gè)濃度的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為包括Probe qPCR Mix（2×）10 μL，探針（10 μmol/L）0.4 μL，上、下游引物（10 μmoL/L）各0.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O補(bǔ)齊20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min，以95℃變性5 s，55℃退火30 s，設(shè)置40個(gè)循環(huán)，在55℃進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。結(jié)果顯示線性關(guān)系良好，陰性對(duì)照成立，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-4.8457×lgx+57.36，相關(guān)系數(shù)R2=0.99；擴(kuò)增效率E=1.61，見(jiàn)圖3。

圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)GETV的擴(kuò)增曲線（A）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig.3 Amplification curve (A) and standard curve (B) of qPCR for GETV detection

2.4 特異性試驗(yàn)結(jié)果 除GETV以外，PRRSV、PCV2、PRV、PEDV、SIV的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陰性（熒光信號(hào)未到達(dá)閾值）（圖4），這表明本方法具有良好的特異性。

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的特異性Fig.4 The specificity of real-time quantitative PCR

2.5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果 用普通PCR方法和本方法分別對(duì)10倍系列稀釋的毒價(jià)為3.16×107TCID50/mL的GETV病毒液進(jìn)行檢測(cè)。樣品在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 40個(gè)循環(huán)內(nèi)的Ct值＞0，則將結(jié)果判定為陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)顯示，熒光定量PCR方法最低可檢測(cè)出3.16 TCID50/mL的病毒（圖5A），普通PCR方法最低可檢測(cè)出3.16×103TCID50/mL的病毒（圖5B）。以上結(jié)果表明熒光定量PCR方法比普通PCR方法更敏感。

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（A）與普通PCR（B）的敏感性試驗(yàn)比較Fig.5 Comparison of sensitivity between qPCR (A) and ordinary PCR (B)

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)4份不同滴度的GETV樣品分別做3個(gè)批內(nèi)重復(fù)和3個(gè)批間重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1，批內(nèi)變異系數(shù)為0.38%～0.64%；批間變異系數(shù)為0.97%～1.44%。以上結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of intra-batch and inter-batch reproducibility of the qPCR detection method

2.7 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果 對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的豬血清樣品按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品RNA，用本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法和普通PCR方法分別進(jìn)行檢測(cè)。由表2可知，在50份豬血清樣品中，熒光定量PCR方法檢測(cè)出陽(yáng)性樣品9份，陰性樣品41份；普通PCR方法檢測(cè)出陽(yáng)性樣品7份，陰性樣品43份。

表2 50份臨床樣品GETV實(shí)時(shí)熒光定量PCR及普通PCR檢測(cè)結(jié)果Table2 The results of 50 clinical samples texted by GETV qPCR and ordinary PCR

3 討論

目前，我國(guó)對(duì)GETV檢測(cè)方法的研究?jī)H限于人類血清學(xué)調(diào)查以及檢測(cè)蚊蟲(chóng)體內(nèi)的帶毒情況。在過(guò)去的二十多年里，GETV在豬群多次暴發(fā)，已經(jīng)成為與公共衛(wèi)生和農(nóng)業(yè)損失息息相關(guān)的重要病原體。建立快速有效的檢測(cè)豬源GETV的方法來(lái)監(jiān)測(cè)豬源GETV對(duì)弄清豬在GETV傳播過(guò)程中起著何種作用具有十分重要的意義，這對(duì)于GETV的防控也具有十分重要的研究?jī)r(jià)值。傳統(tǒng)的病毒分離檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，只能檢測(cè)活病毒；普通PCR方法易出現(xiàn)交叉污染，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件和反應(yīng)副產(chǎn)物等會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響；而熒光定量PCR方法減少了交叉污染，高效快捷，結(jié)果直觀，對(duì)檢測(cè)樣品的要求相對(duì)較低[16]。相對(duì)于普通PCR方法，熒光定量PCR方法具有更強(qiáng)的特異性和更高的敏感性[16]。而且與傳統(tǒng)TaqMan探針相比，本研究TaqMan BHQ探針的淬滅基團(tuán)采用非熒光淬滅基團(tuán)，本身不產(chǎn)生熒光，而且淬滅效率更高，可以大大降低本底信號(hào)強(qiáng)度，增強(qiáng)信噪比，提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性[14]。

本研究對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的GETV編碼E2蛋白的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析。選擇高度保守區(qū)域，建立了一種靶向E2基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法靈敏度高，最低可檢測(cè)到3.16 TCID50/mL的病毒遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于普通PCR的檢測(cè)限3.16×103TCID50/mL。此外，該方法特異性強(qiáng)，對(duì)PRRSV、PCV2、PRV、PEDV、SIV等豬常見(jiàn)傳染病檢測(cè)結(jié)果均為陰性。該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，組內(nèi)、組間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2%。通過(guò)對(duì)臨床樣品的檢測(cè)可見(jiàn)，本研究建立的TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量方法可有效地檢測(cè)出陽(yáng)性核酸樣品且靈敏度高于普通PCR方法。綜上所述，本研究建立了一種能夠快速有效檢測(cè)和定量豬源GETV的熒光定量PCR檢測(cè)方法，在豬群中GETV的監(jiān)測(cè)方面具有很大的實(shí)用價(jià)值。