胡世超，于小杰，王 凈

（1.河北北方學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 075000；河北省肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟 075000）

隨著養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的興起，我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)更加趨向集約化，與傳統(tǒng)養(yǎng)殖業(yè)相比，規(guī)模化養(yǎng)殖有了顯著的提升[1]。羊人工授精技術(shù)在現(xiàn)代養(yǎng)羊業(yè)中應(yīng)用日益廣泛。人工授精是在合理的時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)家畜進(jìn)行快速遺傳改良最實(shí)用的技術(shù)，該技術(shù)具有提高優(yōu)良公畜繁殖效率而減少公畜所需的頭數(shù)，阻礙生殖道疾病傳播，解決因公母畜體型差異大造成交配困難的難題，打破時(shí)間、地域限制實(shí)現(xiàn)配種等優(yōu)點(diǎn)，羊人工授精的推廣應(yīng)用加速了遺傳改良的進(jìn)程[2]。

目前種公羊精液基本上是現(xiàn)采現(xiàn)用，保存期最長(zhǎng)3 d 左右，不能滿(mǎn)足生產(chǎn)需要，因此精液保存是人工授精最重要的一環(huán)，精液的保存方式有冷凍保存和低溫、常溫保存。冷凍保存適用于長(zhǎng)時(shí)間保存精液，但冷凍保存成本高且綿羊精子耐凍性差易導(dǎo)致其活力和受精能力降低，保存在液氮中的凍精在轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)，由于道路顛簸，無(wú)法保證凍精的質(zhì)量[3]。常溫保存溫度范圍為15℃～25℃，操作簡(jiǎn)單、成本最低但保存時(shí)間短，不能實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)距離運(yùn)輸[4]。低溫保存一般在0℃～5℃，與常溫保存相比，精液的保存時(shí)間更長(zhǎng)，能滿(mǎn)足一定程度時(shí)間和距離的繁育要求；較冷凍保存而言，生產(chǎn)成本降低，又能有效提高精子的成活率[5,6]。目前影響綿羊精液保存的因素基本上是保存溫度、精液稀釋液成分、稀釋倍數(shù)、滲透壓等，以期延長(zhǎng)精子保存時(shí)間和質(zhì)量，提高母羊受胎率。

1 綿羊精液常溫保存中的應(yīng)用

常溫下保存的精液，如果3h 內(nèi)使用完成，則不需要特殊的降溫處理，只需將精液密封放置在常溫下即可，但是一般不能滿(mǎn)足生產(chǎn)需要，需要進(jìn)行處理使其保存時(shí)間更長(zhǎng)。影響綿羊精液常溫保存主要面臨的問(wèn)題有稀釋液的滲透壓和pH 值、微生物和活性氧（ROS）造成的損傷。精液稀釋液一般包括能源物質(zhì)、緩沖物質(zhì)、抗菌物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)等。

1.1 能源物質(zhì)

能源物質(zhì)主要為糖類(lèi)，精液稀釋液中常用的糖類(lèi)包括葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、海藻糖等。有研究發(fā)現(xiàn)，糖類(lèi)物質(zhì)混合添加比單用某一種糖效果更好[7]。穆秀明等[8]研究發(fā)現(xiàn)，綿羊精液常溫保存稀釋液葡萄糖-蔗糖-檸檬酸鈉比葡萄糖-乳糖-檸檬酸鈉的效果要好，說(shuō)明使用蔗糖的效果比乳糖好；徐振軍等人在絨山羊精液常溫保存的試驗(yàn)中得出稀釋液含蔗糖效果更好[9]。張良斌等[10]對(duì)肉羊鮮精常溫保存技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)種公羊精液與稀釋液1∶3 比例混合，海藻糖含量為2 g 時(shí)，精子活率在4 d 連續(xù)測(cè)試的活率高于其他含量濃度的活率，并且精子活率的降幅相對(duì)穩(wěn)定，在第4 d 高于50%以上，也符合實(shí)際生產(chǎn)需要。

對(duì)能源物質(zhì)進(jìn)行改良和革新，是羊精液保存技術(shù)中的研究熱點(diǎn)之一。卵黃也可作為能源物質(zhì)，為精子的代謝提供能量，維持精子活性、保證精子膜以及保護(hù)頂體的完整性，張小剛等[11]提到稀釋液中添加10%卵黃可為精子提供營(yíng)養(yǎng)。卵黃為大分子非滲透性物質(zhì)可以調(diào)節(jié)稀釋液滲透壓，使精子所處環(huán)境更加適宜。卵磷脂、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白(HDL)是卵黃中的主要物質(zhì)，而卵磷脂和LDL 具有保護(hù)精子的作用。張柳明等[12]研究發(fā)現(xiàn)隨精液保存時(shí)期變化，添加卵黃的濃度也應(yīng)相應(yīng)改變，可能是精液保存初期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較為充足，而高濃度卵黃會(huì)改變精液濃度使?jié)B透壓發(fā)生改變，降低精子質(zhì)量；精液保存后期營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡，需要高濃度卵黃為其提供充足營(yíng)養(yǎng)。但在添加卵黃的同時(shí)還應(yīng)承擔(dān)相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)槁腰S是動(dòng)物源性物質(zhì)，可能存在未知的生物學(xué)感染，可能會(huì)有某種毒素等，也會(huì)因?yàn)轱曫B(yǎng)條件的不同、品種的不同，造成卵黃的性能不穩(wěn)定[13]。

1.2 緩沖物質(zhì)

緩沖液作用是調(diào)節(jié)并保持稀釋液在精子所適宜的pH 范圍內(nèi)，綿羊精液pH 值約在6.7～6.8，當(dāng)精子處于弱酸環(huán)境時(shí)代謝受到抑制能量消耗減少，所以稀釋液pH 值等于或略小于精液pH 值會(huì)延長(zhǎng)精子存活時(shí)間，但精子糖酵解過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，pH 值驟降，精子受損，所以通常添加一些緩沖物如碳酸氫鈉、檸檬酸鈉、三羥基甲氨基甲烷（Tris）、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）等[14]。檸檬酸鈉是目前廣泛應(yīng)用的緩沖劑，稀釋液中加入3%的檸檬酸鈉，可以保持羊精液pH 值的相對(duì)穩(wěn)定。Tris 是生化實(shí)驗(yàn)中常用的緩沖劑，具有良好的緩沖能力和滲透性，毒性較低，一定程度上使精液pH 趨于堿性，維持精子活動(dòng)，利于提高精子存活率。EDTA 可以用作螯合劑，與稀釋液中Ca2+等有害重金屬離子發(fā)生螯合反應(yīng)，避免其與頂體結(jié)合，提高精子成活率[15,16]。

1.3 抗菌物質(zhì)

由于采精器械未滅菌，未達(dá)到無(wú)菌操作標(biāo)準(zhǔn)，在精液采集和保存過(guò)程中，公畜精液可能會(huì)受到外源致病菌的污染[17]。所以加入適量的抗菌物質(zhì)可抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，降低有害細(xì)菌的存活率。傳統(tǒng)使用的抗生素有青霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、硫酸慶大霉素、林可霉素等，在公羊精液稀釋液中，加入青霉素和鏈霉素或慶大霉素可滅活布魯氏菌和放線(xiàn)桿菌，使抗生素配伍使用效果更好。但隨著細(xì)菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，傳統(tǒng)抗生素作用減弱，一些新型抗菌劑相繼出現(xiàn)，主要是具有抗菌能力的肽類(lèi)或蛋白質(zhì)[18]。比如抗菌肽，綠原酸等物質(zhì)逐步在稀釋液中應(yīng)用。還有HEL-75 蛋白，能夠通過(guò)劑量依賴(lài)方式在精液保存中殺死大腸桿菌，而不影響精子的活力和受精能力。

1.4 抗氧化物質(zhì)

綿羊精液具有抗氧化能力，精液保存時(shí)精子代謝可以產(chǎn)生活性氧，低濃度的活性氧可以提高精子透明帶的結(jié)合能力，提高精子的活力。但當(dāng)活性氧濃度高于精子抗氧化能力的最大值時(shí)，就會(huì)破壞核內(nèi)DNA，破壞線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)，縮短精子保存時(shí)間，使精子受精能力下降。精液中的死精子分泌芳香族氨基酸氧化酶，此酶可催化活性氧的生成，死精子越多，此酶濃度越大從而導(dǎo)致存活的精子受到損害，形成惡性循環(huán)?；钚匝趸镏械暮衔锓Q(chēng)為活性氮（RNS），也會(huì)對(duì)精子遺傳物質(zhì)和結(jié)構(gòu)造成破壞，所以通常在精液稀釋液中添加外源抗氧化物來(lái)阻礙氧化反應(yīng)的發(fā)生、提高精子活性[19]?？寡趸瘎┯忻割?lèi)抗氧化劑谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）、超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和還原型谷胱甘肽（GSH）等 ；非酶類(lèi)抗氧化劑包括維生素類(lèi)（維生素C、維生素E、維生素B12等）、激素類(lèi)（多巴胺、褪黑素等）、氨基酸多肽類(lèi)（?；撬?、丙氨酸、半胱氨酸等）和多糖中的海帶多糖以及多酚類(lèi)中的茶多酚等[20]。

1.5 調(diào)節(jié)滲透壓

滲透壓是精子細(xì)胞膜內(nèi)外存在壓力差而產(chǎn)生的，在低滲或者高滲情況下都會(huì)使精子形態(tài)發(fā)生改變，如在高滲的情況下，精子大量脫水而皺縮死亡；在低滲條件下，精子尾巴膨脹，開(kāi)始卷曲，出現(xiàn)質(zhì)膜、頂體破裂等現(xiàn)象。有研究發(fā)現(xiàn)，常溫保存的綿羊精液在滲透壓較高的稀釋液中，其精子活率和質(zhì)膜完整率均優(yōu)于低滲溶液[21]。稀釋倍數(shù)也會(huì)對(duì)滲透壓產(chǎn)生影響，要把精子密度稀釋到最適合保存精子的狀態(tài)，加入稀釋液精子密度降低，增加精子游動(dòng)空間，才能更好的吸收稀釋液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。在實(shí)踐中常用到的稀釋液是經(jīng)過(guò)消毒的0.9%氯化鈉溶液，但稀釋倍數(shù)通常在2 倍以下[22]。有研究用葡萄糖-檸檬酸鈉溶液將精液稀釋3 倍，常溫保存12 h 后，精子活力可達(dá)30%，仍具受精能力[23]。

2 綿羊精液低溫保存中的應(yīng)用

低溫保存是在0℃～5℃環(huán)境中暫時(shí)抑制了精子的運(yùn)動(dòng)，使其代謝緩慢，且有效抑制了有害菌的生長(zhǎng)繁殖。有實(shí)驗(yàn)表明，同一只杜泊羊，相同的稀釋液和稀釋倍數(shù)，在20℃～25℃下，8 h 后精子活率為0，而在低溫保存下，72 h 后精子活率仍在80%以上，活力衰減5%以?xún)?nèi)[24]。費(fèi)俊陽(yáng)等[25]研究發(fā)現(xiàn)，選用薩?？撕投挪垂蚓翰捎脤?zhuān)用稀釋液處理并在0℃冰水混合物狀態(tài)下保存，12 d 內(nèi)精子活率在70%以上，頂體完整率保持在33%以上，滿(mǎn)足生產(chǎn)需要。

2.1 低溫保護(hù)劑

低溫保存稀釋液成分要比常溫保存多一種低溫保護(hù)劑，是因?yàn)楣蚓拥拿舾行院芨?，精子質(zhì)膜磷脂中不飽和脂肪酸含量較多，通常我們認(rèn)為只有在冷凍條件下才會(huì)使精子發(fā)生冷休克，實(shí)際上精子在10℃以下很容易受到低溫影響而出現(xiàn)冷休克現(xiàn)象，因此，稀釋液中要添加低溫保護(hù)劑。通常實(shí)踐中使用的保護(hù)劑是丙三醇（甘油），曹訪等[26]在實(shí)驗(yàn)中得出，保護(hù)劑中乙二醇和丙三醇保護(hù)效果較好，其中以5%的丙三醇效果最佳，與孫時(shí)軍等[27]在低溫保護(hù)劑對(duì)4℃保存豬精液活率影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果有些不同，孫時(shí)軍等結(jié)果顯示，乙二醇的保護(hù)效果優(yōu)于丙三醇，可能是由于保護(hù)劑的添加量不同造成的偏差，也不排除動(dòng)物個(gè)體間差異。保護(hù)劑用量不當(dāng)會(huì)對(duì)精子活力和受精力存在毒害作用，丙三醇黏稠度高，容易影響精子活動(dòng)，導(dǎo)致精子頂體出現(xiàn)異常，而乙二醇則會(huì)導(dǎo)致精子出現(xiàn)尾部畸形，保護(hù)劑添加量過(guò)多或過(guò)少都會(huì)對(duì)精子造成毒害。

動(dòng)物源性物質(zhì)如卵黃、奶類(lèi)、蜂蜜也可作為精子低溫保護(hù)劑。研究發(fā)現(xiàn)，卵黃是這些保護(hù)劑中效果較好的，因?yàn)槁腰S中含有磷脂的脂蛋白對(duì)精子抵抗低溫刺激效果顯著，而且卵黃還可以提供能量[28]。有研究表明，添加卵黃稀釋液在精子低溫保存至第8 d 時(shí)，精子活率仍可達(dá)到輸精標(biāo)準(zhǔn)且對(duì)精子DNA 傷害不大[29]。添加卵黃濃度很重要，當(dāng)卵黃濃度過(guò)高超出一定范圍時(shí)就會(huì)阻礙精子對(duì)糖類(lèi)的利用，卵黃濃度一般在5%～20%，超出可能會(huì)影響受胎率。此外，卵黃為動(dòng)物源性物質(zhì)，可能會(huì)被細(xì)菌、病毒等污染，卵黃產(chǎn)生的芳香氨基酸會(huì)幫助死精子產(chǎn)生活性氧。目前，大豆卵磷脂為非動(dòng)物源性物質(zhì)可作為卵黃替代物之一。趙建清等[30]用1.25%濃度的大豆卵磷脂代替卵黃在低溫下保存綿羊精液，延長(zhǎng)了精子有效存活時(shí)間，并且比其他四組濃度（2.5%、3.5%、7.5%、10%）保存效果都好。而在添加低劑量大豆卵磷脂稀釋液低溫保存綿羊精液的研究中發(fā)現(xiàn)，添加0.5%濃度的大豆卵磷脂的效果更優(yōu)[31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，添加0.375%的大豆卵磷脂可以代替卵黃在綿羊精液低溫保存中的作用，保存效果較好[32]。胡傳水等[33]采用1.5%的大豆卵磷脂替代卵黃低溫下保存豬精液，可以較好地維持精子活力和延長(zhǎng)精子的有效保存時(shí)間。使大豆磷脂濃度差異的原因可能有：生產(chǎn)廠家的不同、不同批次的大豆磷脂效果不同、物種間的差異等。

2.2 其他物質(zhì)

精子低溫保存時(shí)，除了添加抗生素、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、抗氧化劑等物質(zhì)之外，還應(yīng)該添加一些增強(qiáng)精子保護(hù)功能并且安全的物質(zhì)，例如海藻糖、牛血清蛋白、褪黑激素、肝素等。

海藻糖屬于非還原性雙糖，是天然雙糖中最穩(wěn)定的一類(lèi)，在高滲和低滲透壓以及高溫和低溫等惡劣條件下，可在細(xì)胞表面形成保護(hù)膜，能有效地保護(hù)精子不受損害。鄒宇銀等[34]研究表明，在稀釋液中加入少量海藻糖，不會(huì)直接提高精子活率，但明顯提高精子頂體完整率，頂體完整率可間接反應(yīng)精子功能，頂體中的頂體酶在受精過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。楊文瑾研究發(fā)現(xiàn)[35]，低溫保存牛精液稀釋液中加入一定范圍濃度海藻糖時(shí)，海藻糖的濃度越高，精子活力越強(qiáng)，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)揮的特性就越好。

牛血清白蛋白作為膜的穩(wěn)定劑主要維持精子膜的穩(wěn)定，可以阻止精子質(zhì)膜黏連，也可幫助多數(shù)哺乳動(dòng)物精子獲能。王彥虎等[36]研究表明，在4℃條件下，添加3 g/L 牛血清白蛋白效果最佳，可提高湖羊精子質(zhì)膜完整率、精子活率，但添加6 g/L牛血清白蛋白精液保存24 h 之后，會(huì)對(duì)精子有損傷。

哺乳動(dòng)物精液在低溫保存過(guò)程中易受到低溫打擊而發(fā)生損傷，精子損傷后會(huì)加劇活性氧的生成，活性氧過(guò)量就會(huì)造成質(zhì)膜損傷、線(xiàn)粒體功能異常等。褪黑激素雖在綿羊精液保存中研究較少，但作為一種內(nèi)源抗氧化劑，能夠避免精子受到過(guò)氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，保護(hù)細(xì)胞膜不受外界損傷。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)精子在低溫保存下，加入褪黑素可顯著提高精液保存效果[37]。肝素可用于牛羊等動(dòng)物體外獲能及頂體反應(yīng)，稀釋液中加入肝素，精子內(nèi)鈣離子含量明顯增加，促進(jìn)鈣離子的吸收。

3 結(jié)語(yǔ)

精液保存技術(shù)和人工授精技術(shù)的應(yīng)用有效提高了優(yōu)秀種公畜的利用率，精液的保存研究會(huì)不斷精進(jìn)，精液稀釋液中的抗氧化、抗菌、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、維持滲透壓及酸堿度等物質(zhì)將日益更新。具有受精能力的精子在精液保存中才具有保存的價(jià)值和意義，但這些添加物在不定量情況下混合在一起，是否會(huì)影響精子正常的生理生化特性，是否會(huì)影響精子受精率以及某些表觀遺傳特性等問(wèn)題仍處于探索階段。