劉小花,蔣 萍,連 穎,余 楊,王桂香,何 幸,蔣華英,陳 濤

成都市新都區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科,四川成都 610500

乙型病毒性肝炎是一種由乙型肝炎病毒(HBV)引起的肝炎病毒感染,主要以肝臟病變?yōu)橹?可經(jīng)血液傳播、性傳播和母嬰垂直傳播,病毒主要感染肝細(xì)胞,是一種容易變異的DNA病毒[1]。乙型肝炎(簡稱乙肝)常分為急性和慢性兩種,急性乙肝患者一般經(jīng)過1～3個(gè)月就能徹底清除體內(nèi)病毒,同時(shí)其肝功能也隨之恢復(fù)正常。慢性乙肝患者體內(nèi)病毒難以清除,同時(shí)伴有肝功能異常反復(fù),病毒核酸呈陽性,病程長,反復(fù)發(fā)作,難以痊愈,慢性感染可以持續(xù)多年或終身,而且常常沒有明顯癥狀。HBV感染呈世界性流行,它可以導(dǎo)致肝炎、肝硬化、肝癌等嚴(yán)重健康問題[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國人群中乙肝患者達(dá)8千萬人,全世界乙肝患者超過20億人,全球約有2億人感染HBV并有60萬人死于HBV相關(guān)的肝炎或肝癌,HBV感染已經(jīng)成為全世界人共同關(guān)注的問題[3-4],現(xiàn)有的抗病毒治療藥物難以在短期內(nèi)達(dá)到治療乙肝的效果。

研究發(fā)現(xiàn),共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子(cccDNA)是HBV的復(fù)制中間體,與HBV復(fù)制密切相關(guān),HBV顆粒進(jìn)入機(jī)體后,脫去衣殼,在相關(guān)酶的催化下,形成環(huán)狀雙鏈DNA,進(jìn)而轉(zhuǎn)錄形成病毒前基因組(pgRNA),HBV pgRNA是cccDNA的直接轉(zhuǎn)錄體,其值可以準(zhǔn)確反映體內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA分子的水平[5-6]。血清中的HBV RNA多來自于未逆轉(zhuǎn)錄的pgRNA,故肝臟中HBV RNA直接來源于cccDNA轉(zhuǎn)錄,其水平可以反映cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性及轉(zhuǎn)錄水平[7]。研究表明,HBV pgRNA是乙肝E抗原(HBeAg)的翻譯模板,故二者表達(dá)水平具有一定相關(guān)性,在HBeAg陽性的乙肝患者中,HBV RNA水平與肝臟中HBV cccDNA水平呈正相關(guān)[8]。血清中HBV RNA水平能夠反映乙肝患者抗病毒治療后的治療效果、預(yù)測NAs治療停藥后的復(fù)發(fā)情況。

近年來,臨床上多采用血清學(xué)、病毒學(xué)方法檢測患者HBV復(fù)制情況,血清學(xué)檢測多采用乙肝兩對半[9],其中HBeAg是HBV在體內(nèi)復(fù)制過程中產(chǎn)生的抗原,HBeAg檢測是評估HBV感染活動(dòng)性和繁殖能力的一種手段。對于急性乙肝,大多數(shù)患者可以通過充分的支持治療恢復(fù);如若HBeAg持續(xù)陽性3個(gè)月以上可能發(fā)展為慢性乙肝,慢性乙肝患者當(dāng)前主要治療方法包括抗病毒治療和免疫修復(fù)治療[10]。轉(zhuǎn)氨酶主要存在于患者肝細(xì)胞內(nèi),是常規(guī)的肝功能指標(biāo),主要包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST),ALT和AST是評估乙肝早期肝細(xì)胞損傷的更加敏感的指標(biāo),其水平增高往往是乙肝早期最早的提示。HBV DNA水平是直接檢測HBV在體內(nèi)復(fù)制情況的指標(biāo),也是反映病毒繁殖活躍度的關(guān)鍵指標(biāo),常常采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行檢測。HBV RNA可以反映病毒感染的活躍度、繁殖程度及患者的治療效果等,在乙肝表面抗原(HBsAg)、HBeAg和HBV DNA病毒載量等指標(biāo)受到干擾的情況下,HBV RNA可以提供更敏感和準(zhǔn)確的HBV感染活躍度評估[11]。為此,HBV RNA成為了近幾年臨床上治療乙肝的試驗(yàn)熱點(diǎn)。本次研究通過分析HBeAg陽性及陰性的乙肝患者體內(nèi)HBV RNA水平、HBV DNA水平、轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)水平,探討HBV RNA與HBV DNA和轉(zhuǎn)氨酶水平之間的變化關(guān)系,研究其對于乙肝患者臨床診斷臨床價(jià)值,為臨床診斷和治療乙肝患者提供新的檢測方向,進(jìn)一步治療和預(yù)防HBV感染。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2022年11月至2023年4月在本院門診及住院部就診的乙肝患者共108例,其中HBeAg陽性患者25例,男17例,女8例,平均年齡(48.17±9.02)歲;HBeAg陰性患者83例,男53例,女30例,平均年齡(48.15±9.11)歲。兩組患者性別和年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)診斷滿足臨床乙肝患者診斷標(biāo)準(zhǔn),其中HBeAg陽性乙肝指患者血清HBsAg陽性、HBeAg陽性,伴有ALT持續(xù)或反復(fù)異常或肝組織學(xué)檢查有明顯炎癥壞死;HBeAg陰性乙肝指患者血清HBsAg陽性、HBeAg持續(xù)陰性,多同時(shí)伴有乙肝E抗體陽性,伴有ALT持續(xù)或反復(fù)異常或肝組織學(xué)檢查有明顯炎癥壞死[12];(2)準(zhǔn)備接受或正在接受乙肝NAs治療的患者。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)肝功能損傷;(2)肝細(xì)胞癌;(3)自身免疫性肝病或肝細(xì)胞代謝異常;(4)其他不適于納入以上各組情況。本研究符合倫理標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),并簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑 HBV RNA檢測采用全自動(dòng)核酸檢測分析系統(tǒng)(AutoSAT),試劑盒由上海仁度生物科技股份有限公司提供;HBV DNA檢測采用SLAN-96P全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng),試劑盒由湖南圣湘生物科技有限公司提供;AST、ALT檢測測定采用貝克曼庫爾特AU生化分析系統(tǒng),試劑盒由美國貝克曼生物科技有限公司提供;HBeAg檢測采用i3000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀,試劑盒由四川邁克生物科技股份有限公司提供,嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作。

1.3方法

1.3.1HBV RNA檢測 首先取250 μL待測血清樣本與病毒核酸提取液進(jìn)行混合;置于60 ℃下孵育10 min;待其室溫冷卻之后進(jìn)行雜交捕獲;吸附于磁珠上后棄除多余廢液;使用洗滌液清洗磁珠;將含有純凈RNA靶標(biāo)的磁珠顆粒放入有擴(kuò)增檢測液1、2及酶液組成的擴(kuò)增體系中,42 ℃反應(yīng)40 min;采用實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測。HBV RNA檢測下限為100 copies/mL,HBV RNA陰性為HBV RNA<100 copies/mL。

1.3.2HBV DNA檢測 根據(jù)待測樣本、陰性、陽性對照以及參考品,按比例配制混勻成PCR混合液,瞬時(shí)離心以備用;樣本釋放劑提取樣本核酸;每管各加入40 μL PCR混合液,離心30 s;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測。HBV DNA檢測下限為500 IU/mL,HBV DNA陰性為HBV DNA<500 IU/mL。

1.3.3HBeAg和AST、ALT檢測 HBeAg檢測方法為化學(xué)發(fā)光法,AST、ALT檢測方法為雙試劑速率法,計(jì)算各樣本中AST、ALT水平,檢測均在儀器維護(hù)、校準(zhǔn)、質(zhì)量控制完成后進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1兩組乙肝患者HBV RNA、HBV DNA與ALT、AST表達(dá)水平比較 HBeAg陽性組乙肝患者HBV RNA、HBV DNA以及ALT、AST水平表達(dá)明顯高于HBeAg陰性組乙肝患者(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者HBV RNA、HBV DNA與ALT、AST表達(dá)水平比較

2.2兩組乙肝患者HBV RNA與HBV DNA和ALT、AST的相關(guān)性分析 HBeAg陽性乙肝患者中,HBV DNA表達(dá)與HBV RNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.424,P<0.05);ALT、AST水平與HBV RNA表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。

HBeAg陰性乙肝患者中,HBV DNA表達(dá)與HBV RNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.461,P<0.05);ALT、AST水平與HBV RNA表達(dá)無相關(guān)性(P>0.05)。

2.3兩組乙肝患者HBV RNA、HBV DNA表達(dá)情況比較 HBeAg陽性組HBV RNA陽性率和HBV DNA陽性率與HBeAg陰性組比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表2。

表2 兩組患者HBV RNA和HBV DNA表達(dá)情況比較[n(%)]

3 討 論

慢性HBV感染是一個(gè)主要的公共衛(wèi)生問題,全球約有2.4億慢性HBV感染者[13-14],由于HBV cccDNA的持續(xù)存在,即HBV RNA的真正轉(zhuǎn)錄模板,會(huì)導(dǎo)致病毒抗原如HBeAg和HBsAg及子代病毒的產(chǎn)生。對于HBV感染者的抗病毒治療只能達(dá)到對病毒的抑制作用,而不能徹底清除病毒[15]。目前,臨床上還不能將肝內(nèi)HBV cccDNA檢測作為常規(guī)診斷方法,因此有必要開發(fā)非侵入性的替代標(biāo)志物來監(jiān)測HBV cccDNA的數(shù)量或活性。在過去,一些血清學(xué)標(biāo)志物,包括HBV DNA、HBsAg和乙肝核心相關(guān)抗原等幾種血清學(xué)標(biāo)志物已被證明與乙肝的關(guān)聯(lián)性[16-17]。最近,血清HBV RNA已被認(rèn)為是評估HBV cccDNA的一個(gè)新的生物標(biāo)志物,乙肝患者血清中HBV RNA轉(zhuǎn)陰可能意味著患者肝細(xì)胞內(nèi)HBV cccDNA的清除或轉(zhuǎn)錄活性的沉默,也可能提示乙肝患者可以在實(shí)現(xiàn)臨床治愈之前,安全地停用NAs抗病毒治療[18]。

本研究通過分析HBeAg陽性和陰性乙肝患者血清HBV RNA與HBV DNA和轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)水平的變化發(fā)現(xiàn),HBeAg陽性組HBV RNA、HBV DNA和ALT、AST表達(dá)水平明顯高于HBeAg陰性組(P<0.05),與其他學(xué)者的研究結(jié)果一致[6,19];同時(shí)兩組乙肝患者HBV RNA表達(dá)水平與HBV DNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。張榮芳等[20]發(fā)現(xiàn),乙肝患者HBV RNA與HBV DNA在治療前和治療初期有明顯相關(guān)性[20]。羅小露等[21]發(fā)現(xiàn),在乙肝患者HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)變期,HBV RNA表達(dá)水平與HBV DNA表達(dá)水平在反映病毒復(fù)制活躍性方面具有一致性,在病毒活躍性高的時(shí)期,HBV RNA和HBV DNA的相關(guān)性更高;當(dāng)對乙肝患者采用NAs抗病毒治療后,二者的相關(guān)性可能會(huì)發(fā)生變化。在臨床實(shí)踐中,HBV RNA有助于更準(zhǔn)確地評估病毒復(fù)制水平和預(yù)測治療效果,與本研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn),HBeAg陽性組HBV RNA、HBV DNA陽性率與HBeAg陰性組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。乙肝感染分為兩期,復(fù)制期和非復(fù)制期,當(dāng)HBeAg出現(xiàn)血清學(xué)轉(zhuǎn)變,由陽性轉(zhuǎn)變?yōu)殛幮灾?HBV會(huì)隨之停止復(fù)制[22]。并且由于蛋白質(zhì)的半衰期比DNA長,故當(dāng)HBV DNA被抑制或減弱消失時(shí),HBeAg仍可存在一定的時(shí)間,故有些乙肝患者HBeAg表達(dá)陽性,但是其HBV DNA表達(dá)陰性。當(dāng)HBeAg表達(dá)由陽性轉(zhuǎn)為陰性時(shí),HBV cccDNA仍然可以逆轉(zhuǎn)錄形成HBV RNA,提示HBV RNA比HBV DNA更能準(zhǔn)確反映HBeAg轉(zhuǎn)陰的情況[23];有文獻(xiàn)報(bào)道,在接受治療的乙肝患者中,HBV DNA均低于檢測下限的患者中發(fā)現(xiàn)有35例HBV RNA呈陽性,提示HBV RNA比HBV DNA更能準(zhǔn)確反應(yīng)病毒的存在狀態(tài)。[24]。HBV DNA陽性可以判別乙肝患者或者攜帶者傳染性情況,通過定期HBV DNA定量檢測,可判斷HBV的增長、臨床病情是否穩(wěn)定,還可直接監(jiān)測抗病毒治療的療效[25]。研究表明,HBV RNA可以反映乙肝患者體內(nèi)HBV cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性,也是反映HBV感染活躍度的另一重要指標(biāo),此外,HBV RNA對于乙肝患者在抗病毒治療后的療效監(jiān)測、預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸等方面具有重要意義[26-27],ALT、AST是能夠及時(shí)反映肝臟發(fā)生不同程度實(shí)質(zhì)性病變的關(guān)鍵指標(biāo)[28]。

綜上所述,HBeAg陽性乙肝患者與HBeAg陰性乙肝患者的HBV RNA、HBV DNA和轉(zhuǎn)氨酶表達(dá)水平存在明顯差異,部分HBV DNA陰性乙肝患者,HBV RNA檢測為陽性,因此,可以常規(guī)開展HBV RNA檢測,為早期診斷、病變程度及臨床治療指導(dǎo)等提供診斷依據(jù)。