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UPLC-MS/MS法測定特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中6 種季銨鹽類消毒劑殘留

2023-09-11 03:17:42張明星翟洪穩(wěn)馬俊美張春林任曉偉曹梅榮
關(guān)鍵詞:銨鹽用途消毒劑

孫 磊,張明星,翟洪穩(wěn),馬俊美,張春林,任曉偉,曹梅榮*

(河北省食品安全重點實驗室,國家市場監(jiān)管重點實驗室(特殊食品監(jiān)管技術(shù)),特殊食品安全與健康河北省工程研究中心,河北省食品檢驗研究院,河北 石家莊 050227)

季銨鹽是一類陽離子表面活性劑,該類化合物具有良好的乳化、潤濕、洗滌、殺菌等性能,在化工等工業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用,同時在抗菌和消毒等領(lǐng)域也越來越受到重視[1]。在乳制品生產(chǎn)過程中,為使衛(wèi)生要求達(dá)標(biāo),生產(chǎn)企業(yè)會使用臭氧、含氯消毒劑、季銨鹽類消毒劑、乙醇、過氧化氫、過氧乙酸等消毒劑對擠奶設(shè)備、裝奶容器以及生產(chǎn)設(shè)備等進(jìn)行消毒,其中季銨鹽類消毒劑副作用小、毒性低且價格低廉,在乳制品生產(chǎn)工藝中得到廣泛應(yīng)用[2-4]。但隨著各種研究的逐步深入,季銨鹽類消毒劑被發(fā)現(xiàn)對水生生物有較強(qiáng)的毒性[5],同時還可能引起人的哮喘、皮膚過敏性反應(yīng)以及視力減退等病癥[6-7]。特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品是以醫(yī)學(xué)或營養(yǎng)學(xué)的研究結(jié)果為依據(jù),為滿足特殊人群如進(jìn)食受限、消化吸收障礙、代謝紊亂以及其他特定疾病等人群對營養(yǎng)、膳食的需要,加工而成的配方食品[8]。使用該類產(chǎn)品的人群通常存在一定程度的身體機(jī)能障礙,自身免疫力較弱[9],更容易受到殘留消毒劑的不良影響,因此研究建立含乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中殘留消毒劑的檢測方法,并對特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中消毒劑殘留水平進(jìn)行檢測和風(fēng)險評估具有十分重要的意義。

季銨鹽類消毒劑常用的檢測方法主要包括容量分析法[10]、分光光度法[11-12]、氣相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-14]、離子色譜法[15-16]、高效液相色譜法[17-19]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[20-21]等。其中液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法常見的研究對象主要有環(huán)境水樣[22-24]、嬰幼兒配方乳粉[25-27]、冷凍食品[28]、血清和尿液[29]以及復(fù)方消毒產(chǎn)品[30]等,但是針對特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中消毒劑殘留的研究基本空缺,特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品基質(zhì)較為復(fù)雜,容易對檢測造成干擾,且其中消毒劑殘留量較低,因此對檢測方法的精度要求較高。相比其他檢測方法,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有較高的靈敏度、選擇性以及出色的定性、定量能力,更適用于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中低水平殘留消毒劑的檢測。故研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(ultra-high performance liquid chromatographytandem triple quadrupole mass spectrometry,UPLC-MS/MS)技術(shù),建立含有乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中C12-苯扎氯銨、C14-苯扎氯銨、C16-苯扎氯銨、十二烷基三甲基溴化銨、二癸基二甲基氯化銨和四丁基硫酸氫銨6 種季銨鹽類消毒劑殘留量的檢測方法,為掌握含有乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中消毒劑的殘留水平以及對其風(fēng)險評估提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

所用樣品為含有乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品,均購自藥店和孕嬰店,共5 個品種、44 批次,其中嬰兒氨基酸配方食品7 批次、嬰兒乳蛋白部分水解配方食品11 批次、嬰兒乳蛋白深度水解配方食品9 批次、全營養(yǎng)配方食品6 批次、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方食品11 批次。

C12-苯扎氯銨(純度99.9%)、C14-苯扎氯銨(純度98.8%)、C16-苯扎氯銨(純度98.8%)、十二烷基三甲基溴化銨(純度99.9%)、二癸基二甲基氯化銨(純度99.9%)、四丁基硫酸氫銨(純度99.8%) 北京曼哈格生物科技有限公司;乙腈、甲醇 美國Fisher公司;甲酸(色譜純)、乙酸銨 美國Sigma公司;超純水由Milli-Q純水機(jī)制得,電阻率≥18.2 MΩ·cm。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-QTrap?5500 UPLC-MS/MS儀 美國Sciex公司;CR22N高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司;Elmasonic P300H超聲波清洗器 德國Elma公司;Vortex Genius 3旋渦混合器 德國IKA公司;0.22 μm PTFE微孔濾膜 美國Pall公司;Milli-Q純水機(jī) 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取適量的C12-苯扎氯銨、C14-苯扎氯銨、C16-苯扎氯銨、十二烷基三甲基溴化銨、二癸基二甲基氯化銨和四丁基硫酸氫銨6 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL棕色容量瓶中,用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,得到質(zhì)量濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于0~4 ℃冷藏保存,可保存3 個月。

吸取適量的6 種消毒劑標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,用50%甲醇水溶液稀釋成質(zhì)量濃度為1.0、0.1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于0~4 ℃冷藏保存,可保存1 個月。

1.3.2 樣品前處理

1.3.2.1 固體試樣

準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.001 g)試樣置于15 mL離心管中,加入2 mL加熱至50 ℃左右的超純水,渦旋振蕩10 s,再加入8 mL乙腈,渦旋混勻1 min,超聲提取10 min后,放入-18 ℃冰箱中放置1 h,在0~4 ℃下10 000 r/min離心10 min,上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后,待測定。

1.3.2.2 液體試樣

準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.001 g)試樣置于15 mL離心管中,加入9 mL 80%乙腈水溶液,渦旋混勻1 min,超聲提取10 min后,放入-18 ℃冰箱中放置1 h,在0~4 ℃下10 000 r/min離心10 min,上清液過0.22 μm有機(jī)濾膜后,待測定。

1.3.3 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

稱取多份空白試樣,每份1 g(精確至0.001 g),置于15 mL具塞離心管中,加入適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,按照1.3.2節(jié)的步驟進(jìn)行相同操作,分別配制質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 ng/mL的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線所需溶液。

1.3.4 色譜條件

色譜柱:安捷倫RRHD Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流動相:20 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%甲酸)、甲醇體積比15∶85;流速0.3 mL/min;進(jìn)樣量2 μL;柱溫25 ℃。

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子源參數(shù):電噴霧離子源正離子模式;噴霧電壓4 000 V;離子源溫度450 ℃;氣簾氣壓力30 psi;霧化氣壓力55 psi;輔助氣壓力55 psi。

在優(yōu)化好的儀器條件下,6 種季銨鹽類消毒劑的多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)參數(shù)見表1。

表1 6 種季銨鹽類消毒劑的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters for six quaternary ammonium disinfectants

1.4 數(shù)據(jù)處理

儀器操作、分析控制與數(shù)據(jù)收集通過Analyst?軟件(Version 1.6.3,美國AB Sciex公司)完成;儀器數(shù)據(jù)處理及消毒劑殘留物的含量計算通過MultiQuantTM軟件(Version 3.0.8664.0,美國AB Sciex公司)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理條件的優(yōu)化

特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中通常含有較高的蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等物質(zhì),而季銨鹽在水和有機(jī)溶劑中都有良好的溶解度,用水提取樣品中的季銨鹽時,提取液會形成懸濁液,無法開展后續(xù)的分析測定工作,因此常用乙腈和甲醇作為提取溶劑來提取特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中的季銨鹽類消毒劑。采用乙腈作為提取溶劑時,由于乙腈對脂肪的溶解度比甲醇低,且比甲醇有更強(qiáng)的沉淀蛋白能力,因此提取溶液相比使用甲醇時更為清澈,回收率較高并且可以很大程度降低提取液中基質(zhì)的干擾。

本研究考察體積分?jǐn)?shù)60%、70%、80%乙腈溶液和純乙腈作為提取溶劑時的提取效果。對于脂肪、蛋白含量較高的樣品,采用60%乙腈溶液進(jìn)行提取時,提取液經(jīng)常會出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象。隨著提取液中乙腈的比例不斷提高,對蛋白的沉淀效果也不斷提升,提取溶液的渾濁度逐漸下降。但使用純乙腈進(jìn)行提取時,迅速沉淀的蛋白等雜質(zhì)會與待測樣品凝結(jié)成團(tuán)狀,不能很好地分散,導(dǎo)致提取效率下降。綜合分析后,最終提取溶劑采用80%乙腈溶液。同時優(yōu)化固體試樣的提取方式,先用2 mL水充分溶解,再加入8 mL乙腈進(jìn)行提取。同時采用冷凍提取液的方式,進(jìn)一步促進(jìn)脂類和蛋白的沉淀。此外,樣品定量測定時采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行校正,能夠有效降低樣品基質(zhì)的干擾,保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

本研究比較3 種流動相對峰型和響應(yīng)值的影響,分別為水-甲醇、20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇及20 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%甲酸)-甲醇。使用水-甲醇體系時,得到的峰型較差,且出現(xiàn)了拖尾。使用20 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇體系時,能夠有效改善峰型較寬和拖尾的問題。流動相加入甲酸后,促進(jìn)待測物在離子源中的電離,6 種消毒劑的響應(yīng)值均有一定程度的提高,因此最終選擇20 mmol/L乙酸銨溶液(含0.2%甲酸)-甲醇體系作為流動相。

2.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

在質(zhì)譜上使用基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液對6 種季銨鹽類消毒劑的碰撞能量和去簇電壓進(jìn)行優(yōu)化,同時確定適合的駐留時間,優(yōu)化后的參數(shù)詳見表1。6 種季銨鹽類消毒劑均具有良好的峰型和響應(yīng)值,具體的MRM離子色譜圖見圖1。

圖1 6 種季銨鹽類消毒劑(1 ng/mL)的MRM離子色譜圖Fig.1 MRM ion chromatograms of six disinfectants (1 ng/mL)

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系、方法檢出限和定量限

通過向空白基質(zhì)中加標(biāo)的方式,獲得方法的檢出限和定量限。選取信噪比(RS/N)=3時待測物的質(zhì)量濃度為方法的檢出限,選取RS/N=10時待測物的質(zhì)量濃度為方法的定量限。文獻(xiàn)中的類似相關(guān)方法線性相關(guān)系數(shù)通常大于0.995,檢出限為0.2~1.0 μg/kg,定量限為0.5~5.5 μg/kg。由表2可知,本研究中6 種季銨鹽類消毒劑殘留量的質(zhì)量濃度為0.1~5.0 ng/mL時,線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)(R2)≥0.996 0,檢出限為0.5 μg/kg,定量限為1 μg/kg,方法的靈敏度優(yōu)于大部分其他文獻(xiàn)中的方法。

表2 6 種季銨鹽類消毒劑的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, LODs and LOQs of six disinfectants

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

向空白基質(zhì)中添加6 種季銨鹽類消毒劑的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收率的測定,分別添加低、中、高3 個梯度,每個梯度進(jìn)行6 次重復(fù)測定。文獻(xiàn)中的類似方法加標(biāo)回收率范圍通常為65%~115%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為0.64%~16.80%。由表3可知,6 種季銨鹽類消毒劑在固體試樣基質(zhì)中加標(biāo)回收率為72.8%~102.3%,RSD為0.25%~3.88%,在液體試樣基質(zhì)中加標(biāo)回收率為71.8%~100.8%,RSD為0.19%~2.51%,與文獻(xiàn)中的其他方法相比,該方法加標(biāo)回收率穩(wěn)定,且精密度更佳。

表3 6 種季銨鹽類消毒劑的加標(biāo)回收率和RSD(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of six disinfectants from spiked samples (n = 6)

2.6 實際樣品的測定

為進(jìn)一步驗證本方法的適用性,分別選擇在售的5 個品種44 批次含乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品進(jìn)行實際樣品檢測,其中嬰兒氨基酸配方食品7 批次、嬰兒乳蛋白部分水解配方食品11 批次、嬰兒乳蛋白深度水解配方食品9 批次、全營養(yǎng)配方食品6 批次、早產(chǎn)/低出生體質(zhì)量嬰兒配方食品11 批次。測定過程中方法穩(wěn)定性良好,結(jié)果顯示,該44 個批次產(chǎn)品中均未檢出6 種季銨鹽類消毒劑殘留,表明含乳特醫(yī)食品中消毒劑殘留水平控制的較好。

3 結(jié) 論

該研究基于UPLC-MS/MS技術(shù)建立了含乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中6 種季銨鹽類消毒劑殘留的檢測方法。該方法前處理簡單快速、準(zhǔn)確度高、精密度好,適用于含乳成分的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中6 種季銨鹽類消毒劑殘留量的檢測。目前對于特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中季銨鹽消毒劑殘留量的檢測研究還較少,該研究可以同時為其他種類的特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中季銨鹽類消毒劑的檢測提供技術(shù)參考,并為特殊醫(yī)學(xué)用途配方食品中消毒劑殘留水平的檢測以及對其風(fēng)險評估提供方法支持。

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