李景芳 溫舒越 趙利君 陳庭木 周振玲 孫志廣 劉艷 陳海元 張?jiān)戚x 遲銘 邢運(yùn)高 徐波 徐大勇 王寶祥,*

基于CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制耐鹽香稻

李景芳1溫舒越2趙利君2陳庭木1周振玲1孫志廣1劉艷1陳海元3張?jiān)戚x3遲銘1邢運(yùn)高1徐波1徐大勇1王寶祥1,*

(1連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 江蘇 連云港 222000；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 南京 210095；3江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所, 南京 210014；*通信聯(lián)系人，email：wbxrice@163.com)

【目的】為了促進(jìn)耐鹽香稻育種，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)粳稻品種連粳11的和基因進(jìn)行編輯，以期快速獲得一批不含有轉(zhuǎn)基因成分且具有耐鹽性和香味的純合水稻材料?！痉椒ā扛鶕?jù)和基因序列中編輯位點(diǎn)的敲除效率設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)，構(gòu)建pH-Ubi-Cas9--敲除載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入受體品種連粳11中。對(duì)轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行潮霉素和Cas9標(biāo)記PCR檢測(cè)以及靶基因測(cè)序，獲得無(wú)外源基因插入的-純合株系，并對(duì)后代種子性狀和苗期耐鹽性進(jìn)行分析?！窘Y(jié)果】T2代成熟種子中2-AP含量較背景材料連粳11顯著增加，千粒重、粒長(zhǎng)、粒寬無(wú)明顯變化；128 mmol/L氯化鈉處理14 d后株系21-30較連粳11苗高增加15.2%，苗鮮質(zhì)量增加45.2%，苗干質(zhì)量增加13.2%?！窘Y(jié)論】利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)和基因編輯獲得能穩(wěn)定遺傳且無(wú)外源基因插入的耐鹽香稻材料，加快了水稻多性狀聚合的選育進(jìn)程。

水稻; CRISPR/Cas9; 耐鹽; 香味;;

土壤鹽堿化是制約水稻生產(chǎn)的主要非生物脅迫因素之一。我國(guó)鹽堿地面積廣，綜合利用潛力巨大。培育能夠利用沿海灘涂資源的耐鹽水稻品種是增加土地利用率、提高水稻種植面積和產(chǎn)量的重要途徑。

近年來(lái)，水稻中大量耐鹽相關(guān)基因被報(bào)道，如[1][2][3][4]、[5]、[6]等水稻耐鹽正調(diào)控基因以及[7]、[8]、[9]、[10]等水稻耐鹽負(fù)調(diào)控基因。其中，編碼一個(gè)包含696個(gè)氨基酸的B型反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程，它的功能缺失顯著提高了耐鹽性。Zhang等[11]通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)靶向編輯基因顯著提高了水稻耐鹽性。研究者也通過(guò)RNAi[8, 12]、T-DNA插入[13]、基因編輯[14]等手段獲得一系列耐鹽水稻材料。

優(yōu)質(zhì)米已經(jīng)成為我國(guó)水稻生產(chǎn)的發(fā)展方向，米飯的香味是影響食味品質(zhì)的重要因素之一。控制水稻香味的揮發(fā)性物質(zhì)種類有很多，而絕大多數(shù)香米與普通大米2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的含量存在顯著差異，2-AP的含量也常被用來(lái)評(píng)價(jià)稻米是否具有香味的重要參考指標(biāo)[15]。水稻香味調(diào)控基因編碼甜菜堿醛脫氫酶，其突變使得BADH2蛋白功能喪失，導(dǎo)致γ-氨基丁醛積累，導(dǎo)致2-AP含量增加，使稻米具有香味[16-17]。目前已有很多報(bào)道通過(guò)TALEN[18]、CRISPR/Cas9[19]等技術(shù)對(duì)水稻基因進(jìn)行定向修飾，使BADH2蛋白功能缺失，成功創(chuàng)制具有香味的水稻。

對(duì)現(xiàn)有水稻品種性狀進(jìn)行改良或者研發(fā)出具有優(yōu)異性狀的品種是許多研究者一直努力的方向，目前選育優(yōu)質(zhì)抗逆品種主要是通過(guò)雜交和回交改良等常規(guī)育種手段，品種選育周期長(zhǎng)，CRISPR/Cas9技術(shù)作為應(yīng)用最為廣泛的基因編輯技術(shù)，可以對(duì)內(nèi)源基因組進(jìn)行敲除、插入、堿基替換、點(diǎn)突變等修飾，快速改良品種關(guān)鍵性狀，克服基因連鎖效應(yīng)帶來(lái)的障礙，獲得具有優(yōu)良性狀的新品種，未來(lái)可能在水稻遺傳育種改良中發(fā)揮重要作用。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)連粳11水稻品種的耐鹽和香味基因同時(shí)進(jìn)行編輯，對(duì)轉(zhuǎn)基因分離后代進(jìn)行鑒定，篩選既耐鹽又具有香味且不含有外源基因插入的純合株系，以期為商業(yè)化育種技術(shù)的創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以連粳11為遺傳轉(zhuǎn)化受體，開展遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

1.2 載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因研究

通過(guò)NCBI網(wǎng)站獲得（Os08g0424500）和（Os06g0183100）基因組序列，登錄CRISPR-GE網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/）設(shè)計(jì)、基因靶位點(diǎn)，前引物為靶點(diǎn)序列5’端加上GGCA堿基，后引物為靶序列反向互補(bǔ)后5’端加上AAAC堿基（表1），通過(guò)酶切、連接分別構(gòu)建兩個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA入門載體，進(jìn)一步酶切、連接，將和基因靶標(biāo)sgRNA連接形成一個(gè)入門載體并與pH-Ubi-Cas9載體連接構(gòu)建水稻最終表達(dá)載體[20]。所用引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，基因測(cè)序由南京擎科生物有限公司完成。測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105菌株中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法侵染連粳11愈傷組織，并通過(guò)愈傷組織的篩選和分化等步驟獲取轉(zhuǎn)基因植株。

1.3 PCR鑒定及分析

1.3.1 T0代植株轉(zhuǎn)基因鑒定

分蘗前期取連粳11和轉(zhuǎn)基因植株葉片，采用CTAB法提取基因組DNA，用潮霉素標(biāo)記進(jìn)行PCR鑒定，挑選T0代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系種植。

1.3.2 T1代植株轉(zhuǎn)基因鑒定

分蘗前期取葉片，提取DNA，用潮霉素引物和Cas9標(biāo)記引物進(jìn)行擴(kuò)增，剔除含有外源片段的植株，將不含有載體片段的植株用含有靶位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DSDecodeM網(wǎng)站（http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/）和BioXM軟件分析，選取、編輯成功且純合的株系后代用于香味和耐鹽性鑒定。

1.4 耐鹽性鑒定

連粳11和基因編輯T1代純合種子用75%酒精消毒，室溫下浸種2ｄ，催芽1 d至種子露白，將露白種子播到底部剪開的96孔PCR板中進(jìn)行水培，2～3 d換一次水。待幼苗長(zhǎng)至1葉１心時(shí)，換成IRRI營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)[21]，每2～3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。當(dāng)幼苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，用含128 mmol/L NaCl的IRRI營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)[11, 22]，以標(biāo)準(zhǔn)IRRI營(yíng)養(yǎng)液作為對(duì)照，每2～3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液，處理2周后，拍照，測(cè)定苗高、苗鮮質(zhì)量、苗干質(zhì)量，并進(jìn)行耐鹽性評(píng)價(jià)。所有測(cè)定均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。耐鹽相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)水平測(cè)定，以作為內(nèi)參基因，數(shù)據(jù)采用2?法進(jìn)行分析[23]。

1.5 基因編輯后代表型分析

將成熟的連粳11和基因編輯T2代種子置于烘箱中60℃下烘至恒重，考查千粒重，并對(duì)粒長(zhǎng)、粒寬進(jìn)行測(cè)定。稻米香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的含量采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀測(cè)定[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因編輯載體的構(gòu)建

基因包含15個(gè)外顯子，基因包含6個(gè)外顯子，利用CRISPR-GE在線設(shè)計(jì)和基因靶位點(diǎn)，選取兩個(gè)分別位于第6外顯子和第3外顯子上的靶位點(diǎn)，對(duì)和基因進(jìn)行編輯（圖1-A）。

A―Badh2和OsRR22基因結(jié)構(gòu)及靶位點(diǎn)位置信息，綠色堿基代表PAM序列；B―Badh2和OsRR22基因靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體構(gòu)建；C―表達(dá)載體中靶位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果。

Fig. 1.andtarget sites and CRISPR/Cas9vector construction.

水稻pH-Ubi-Cas9終轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建完成后（圖1-B），進(jìn)行靶位點(diǎn)測(cè)序，載體測(cè)序結(jié)果表明設(shè)計(jì)靶點(diǎn)序列能夠完全比對(duì)（圖1-C），將測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中并開展后續(xù)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。

表1 本研究中使用的引物

2.2 Badh2-OsRR22的編輯及無(wú)標(biāo)記后代的鑒定

將和基因編輯載體轉(zhuǎn)化到連粳11的愈傷組織中，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得T0代轉(zhuǎn)基因苗，利用潮霉素標(biāo)記篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行下一代繁殖。

分別提取T1代轉(zhuǎn)基因單株DNA，通過(guò)Cas9載體引物篩選無(wú)外源標(biāo)記的株系（圖2），并對(duì)篩選到的無(wú)外源標(biāo)記的株系進(jìn)行靶位點(diǎn)突變信息檢測(cè)，共檢測(cè)到6種不同的純合雙突變植株，其中，基因有4種突變類型，分別為插入A、缺失TA、缺失AGTCCTATA和缺失TAT。插入A導(dǎo)致蛋白翻譯過(guò)程中第267I→N、268V→S、269V→G、270F→V位氨基酸的替換，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止；缺失TA導(dǎo)致第267I→S、268V→G位氨基酸的替換，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止；缺失AGTCCTATA，導(dǎo)致第265S、266P、267I位這3個(gè)氨基酸的缺失；缺失TAT導(dǎo)致第267I位氨基酸缺失?；蛴胁迦隩、插入G和34 bp缺失等3種突變類型，分別導(dǎo)致出現(xiàn)一段氨基酸的替換后終止翻譯（圖3）。

M―DNA標(biāo)記；“+”―陽(yáng)性對(duì)照；“?”―陰性對(duì)照；1～9為T1代部分植株。Cas9標(biāo)記目標(biāo)片段大小為906 bp。

Fig. 2. Identification of Cas9 markers in some T1plants.

紅色箭頭表示突變位置。“+”代表插入；“-”代表缺失。黑色箭頭表示氨基酸位置。

Fig. 3. Mutation types at theandloci of the homozygous lines in T1

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*和**分別表示在5%和1%水平上差異顯著(t檢驗(yàn))。

Fig. 4. Salt tolerance identification of T2homozygous lines 21-30, 21-31 at the seedling stage.

2.3 基因編輯水稻耐鹽性鑒定

為了對(duì)基因編輯后代進(jìn)行耐鹽性鑒定，我們挑選了T2代兩個(gè)純合株系21-30、21-31進(jìn)行溫室苗期耐鹽性鑒定。分別使用水稻營(yíng)養(yǎng)液和含有128 mmol/L氯化鈉的營(yíng)養(yǎng)液處理，數(shù)據(jù)分析表明鹽處理?xiàng)l件下21-30和21-31株系苗高、苗鮮質(zhì)量和苗干質(zhì)量均顯著高于連粳11。21-30苗高較連粳11增加15.2%，苗鮮質(zhì)量增加45.2%，苗干質(zhì)量增加13.2%（圖4）。因此，與連粳11相比，基因編輯后代的耐鹽性增強(qiáng)。

對(duì)水稻耐鹽相關(guān)基因、、、、的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析，定量結(jié)果顯示與連粳11相比，5個(gè)耐鹽調(diào)控基因均上調(diào)表達(dá)，其中、和在基因編輯后代中表達(dá)量顯著升高（圖5），表明基因編輯引起了耐鹽相關(guān)基因表達(dá)的改變。

數(shù)值用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*表示在5%水平上差異顯著(t檢驗(yàn))。

Fig. 5. Relative expression levels of salt resistance related genes in the wild-type and its T2line 21-30.

2.4 T2代植株農(nóng)藝性狀和2-AP含量測(cè)定

將野生型連粳11與T2代21-30、21-31株系成熟種子進(jìn)行比較，與野生型相比，21-30、21-31后代千粒重、粒長(zhǎng)、粒寬均無(wú)明顯差異。利用GC-MS對(duì)連粳11、21-30和21-31株系種子中2-AP物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)21-30和21-31種子中2-AP含量分別為0.277 mg/kg、0.294 mg/kg，而在連粳11種子中未檢測(cè)到2-AP（圖6）。

數(shù)值用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。**表示在1%水平上差異顯著 (t檢驗(yàn))。

Fig. 6. Performance of rice yield and fragrance related traits in the wild-type and its positive transgenic lines.

3 討論

連云港屬于沿海城市，大面積沿海灘涂地不適合種植水稻等農(nóng)作物，目前選育的適宜該地區(qū)種植的耐鹽水稻品種相對(duì)匱乏，選育高耐鹽水稻品種可以增加土地利用率，提高水稻種植面積和產(chǎn)量。香味是一種特色的水稻品質(zhì)，也是稻米重要的品質(zhì)指標(biāo)。選育耐逆的優(yōu)質(zhì)稻米品種是近年來(lái)育種的主要目標(biāo)，雜交育種技術(shù)是水稻傳統(tǒng)育種的主要方法。與傳統(tǒng)育種方法相比，基因編輯技術(shù)具有編輯效率高、不攜帶外源基因等優(yōu)點(diǎn)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)使基因定向修飾更為簡(jiǎn)便，是水稻種質(zhì)改良技術(shù)中的重大突破，加快了水稻育種進(jìn)程。本研究針對(duì)連云港地區(qū)水稻品種種植需求，利用基因編輯技術(shù)以耐鹽負(fù)調(diào)控基因和香味調(diào)控基因?yàn)榘袠?biāo)基因，構(gòu)建雙基因串聯(lián)的CRISPR/Cas9基因敲除載體，轉(zhuǎn)入到連粳11愈傷組織中，對(duì)兩個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯，通過(guò)轉(zhuǎn)基因后代鑒定，獲得無(wú)外源標(biāo)記且穩(wěn)定遺傳的耐鹽香味水稻株系。

利用基因編輯技術(shù)改良水稻的報(bào)道已有很多，如抽穗期、抗稻瘟病、香味、直鏈淀粉含量、粒型等性狀的改良，但同時(shí)對(duì)耐鹽和香味基因進(jìn)行編輯的報(bào)道較少。Xu等[24]利用堿基精準(zhǔn)編輯技術(shù)對(duì)基因進(jìn)行三個(gè)靶位點(diǎn)的編輯，獲得了直鏈淀粉含量為1.4%～11.9%的一系列水稻突變體，一方面為水稻品質(zhì)改良育種創(chuàng)制了新資源，另一方面也為水稻品質(zhì)精準(zhǔn)育種和快速改良提供了新思路。Liu等[25]利用基因編輯技術(shù)對(duì)的上游開放閱讀框(uORF)進(jìn)行編輯，可以使水稻實(shí)現(xiàn)不同程度延遲開花（4.6～11.2 d）的目的，對(duì)未來(lái)微效改變水稻開花性狀的研究提供重要依據(jù)。徐善斌等[26]以、和為靶基因，構(gòu)建CRISPR/Cas9敲除載體，轉(zhuǎn)入到龍粳11中，獲得無(wú)T-DNA元件的純合長(zhǎng)粒香型水稻。

和分別為水稻耐鹽性和香味的負(fù)調(diào)控基因。本研究構(gòu)建了和的雙基因敲除載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)到連粳11中，對(duì)這2個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯，獲得了耐鹽香型水稻材料。通過(guò)對(duì)后代轉(zhuǎn)基因株系的篩選，獲得6個(gè)不含有外源基因的純合基因編輯株系，對(duì)其中21-30和21-31株系種子中2-AP含量測(cè)定結(jié)果表明香味物質(zhì)含量增加至0.277和0.2294 mg/kg，苗期耐鹽性較連粳11顯著增強(qiáng)，且轉(zhuǎn)基因株系千粒重、粒長(zhǎng)、粒寬等性狀無(wú)明顯差異，以上純合株系的獲得為耐鹽香型水稻的培育提供技術(shù)支撐和育種材料。

謝辭：北京大學(xué)瞿禮嘉教授課題組提供了本研究所用的CRISPR載體，在此深表謝意。

[1] El Mahi H, Perez-Hormaeche J, de Luca A, Villalta I, Espartero J, Gamez-Arjona F, Fernandez J L, Bundo M, Mendoza I, Mieulet D. A critical role of sodium flux via the plasma membrane Na+/H+exchanger SOS1 in the salt tolerance of rice[J]., 2019, 180(2): 1046-1065.

[2] Yang A, Dai X Y, Zhang W H. A R2R3-type MYB gene,, is involved in salt, cold, and dehydration tolerance in rice[J]., 2012, 63(7): 2541-2556.

[3] Wang R, Jing W, Xiao L G, Jin Y K, Shen L K, Zhang W H. The rice high-affinity potassium pransporter1;1 is involved in salt tolerance and regulated by an MYB-type transcription factor[J]., 2015, 168(3): 1076-1090.

[4] Liu S P, Zheng L Q, Xue Y H, Zhang Q, Wang L, Shuo H X. Overexpression ofandincreases tolerance to drought and salinity in rice[J]., 2010, 53: 444-452.

[5] 張霞, 唐維, 劉嘉, 劉永勝. 過(guò)量表達(dá)水稻和基因提高煙草脯氨酸的生物合成及其非生物脅迫抗性[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2014, 20(4): 717-722.

Zhang X, Tang W, Liu J, Liu Y S. Co-expression of riceandgenes in transgenic tobacco resulted in elevated proline biosynthesis and enhanced abiotic stress tolerance[J]., 2014, 20(4): 717-722. (in Chinese with English abstract)

[6] Li H W, Wang X P. Overexpression of the trehalose- 6-phosphate synthase geneenhances abiotic stress tolerance in rice[J]., 2011, 234(5): 1007-1018.

[7] Lan T, Zheng Y L, Su Z L, Yu S B, Song H B, Zheng X Y, Lin G G, Wu W R., a SBP-box gene, plays a dual role in salt tolerance and trichome formation in rice (L.) [J]., 2019, 9(12): 4107-4114.

[8] Yang C, Ma B, He S J, Xiong Q, Duan K X, Yin C C, Chen H, Lu X, Chen S Y, Zhang J S.andregulate ethylene response of roots and coleoptiles and negatively affect salt tolerance in rice[J]., 2015, 169(1): 148-165.

[9] Koh S, Lee S C, Kim M K, Koh J H, Lee S, An G, Choe S, Kim S R. T-DNA tagged knockout mutation of rice, an orthologue of, with enhanced tolerance to various abiotic stresses[J]., 2007, 65(4): 453-466.

[10] Takagi H, Tamiru M, Abe A, Yoshida K, Uemura A, Yaegashi H, Obara T, Oikawa K, Utsushi H, Kanzaki E, Mitsuoka C, Natsume S, Kosugi S, Kanzaki H, Matsumura H, Urasaki N, Kamoun S, Terauchi R. MutMap accelerates breeding of a salt-tolerant rice cultivar[J]., 2015, 33(5): 445-449.

[11] Zhang A N, Liu Y, Wang F M, Li T F, Chen Z H, Kong D Y, Bi J G, Zhang F Y, Luo X X, Wang J H, Tang J J, Yu X Q, Liu G L, Luo L J. Enhanced rice salinity tolerance via CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of thegene[J]., 2019, 39: 47.

[12] 李晶嵐, 陳鑫欣, 石翠翠, 劉方惠, 孫靜, 葛榮朝.基因過(guò)表達(dá)和RNA干涉對(duì)水稻苗期耐鹽性的影響[J]. 作物學(xué)報(bào), 2020, 46(8): 1217-1224.

Li J L, Chen X X, Shi C C, Liu F H, Sun J, Ge R C. Effects ofgene overexpression and RNAi on the salt-tolerance at seedling stage in rice[J]., 2020, 46(8): 1217-1224. (in Chinese with English abstract)

[13] 魏曉東, 張亞?wèn)|, 趙凌, 路凱, 宋雪梅, 王才林. 稻米香味物質(zhì)2-乙酰-1-吡咯啉的形成及其影響因素[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2022, 36 (2): 131-138. Wei X D, Zhang Y D, Zhao L, Lu K, Song X M, Wang C L. Research progress in biosynthesis and influencing factors of 2-acetyl-1-pyrroline in fragrant rice[J]., 2022, 36(2): 131-138.(in Chinese with English abstract)

[14] Jiang M, Liu Y H, Li R Q, Li S, Tan Y Y, Huang J Z, Shu Q Y. An inositol 1, 3, 4, 5, 6-pentakisphosphate 2-kinase 1 mutant with a 33-nt deletion showed enhanced tolerance to salt and drought stress in rice[J]., 2021, 10(1): 23.

[15] Bradbury L M, Fitzgerald T L, Henry R J, Jin Q S, Waters D L. The gene for fragrance in rice[J]., 2005, 3(3): 363-370.

[16] Chen S H, Yang Y, Shi W W, Ji Q, He F, Zhang Z D, Heng Z K, Liu X N, Xu M L., encoding betaine ldehyde dehydrogenase, inhibits the biosynthesis of -acetyl-1-pyrroline, a major component in rice fragrance[J]., 2008, 20(7): 1850-1861.

[17] Bradbury L M, Gillies S A, Brushett D J, Waters D L, Henry R J. Inactivation of an amino aldehyde dehydrogenase is responsible for fragrance in rice[J]., 2008, 68(4-5): 439-449.

[18] Shan Q W, Zhang Y, Chen K L, Zhang K, Gao C X. Creation of fragrant rice by targeted knockout of thegene using TALEN technology[J]., 2015, 13(6): 791-800.

[19] Hui S Z, Li H J, Mawia A M, Zhou L, Cai J Y, Ahmad S, Lai C K, Wang J X, Jiao G A, Xie L H, Shao G N, Sheng Z H, Tang S Q, Wang J L, Wei X J, Hu S K, Hu P S. Production of aromatic three-line hybrid rice using novel alleles of[J]., 2022, 20(1): 59-74.

[20] Miao J, Guo D, Zhang J, Huang Q, Qin G, Zhang X, Wan J, Gu H, Qu L. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system[J]., 2013, 23(10): 1233-1236.

[21] Yoshida S, Forno D A, Cook J H, Gomez K A. Laboratory Manual for Physiological Studies of Rice[M]. International Rice Research Institute, Philippines, 1976: 61-66.

[22] Liu Y, Wang B X, Li J, Song Z Q, Lu B G, Chi M, Yang B, Liu J B, Lam Y W, Li J X, Xu D Y. Salt-response analysis in two rice cultivars at seedling stage[J]., 2017, 39: 215.

[23] Wang B X, Xu B, Liu Y, Li J F, Sun Z G, Chi M, Xing Y G, Yang B, Li J, Liu J B, Lu B G, Xu D Y, Bello B K. A novel mechanism of the signaling cascade associated with the SAPK10-bZIP20-NHX1 synergistic interaction to enhance tolerance of plant to abiotic stress in rice [J]., 2022, 323: 111393.

[24] Xu Y, Lin Q P, Li X F, Wang F J, Chen Z H, Wang J, Li W Q, Fan F J, Tao Y J, Jiang Y J, Wei X D, Zhang R, Yang J, Gao C X. Fine-tuning the amylose content of rice by precise base editing of thegene[J]., 2021, 19(1): 11-13.

[25] Liu X X, Liu H L, Zhang Y Y, He M L Li R T, Meng W, Wang Z Y, Li X F, Bu Q Y. Fine-tuning flowering time via genome editing of upstream open reading frames of heading date 2 in rice[J]., 2021, 14(1): 59.

[26] 徐善斌, 鄭洪亮, 劉利鋒, 卜慶云, 李秀峰, 鄒德堂. 利用CRISPR/Cas9 技術(shù)高效創(chuàng)制長(zhǎng)粒香型水稻[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2020, 34(5): 406-412. Xu S B, Zheng H L, Liu L F, Bu Q Y, Li X F, Zou D T. Improvement of grain shape and fragrance by using CRISPR/Cas9 system[J].2020, 34(5): 406-412. (in Chinese with English abstract)

Development of Aromatic Salt-tolerant Rice Based on CRISPR/Cas9 Technology

LI Jingfang1, WEN Shuyue2, ZHAO Lijun2, CHEN Tingmu1, ZHOU Zhenling1, SUN Zhiguang1, LIU Yan1, CHEN Haiyuan3, ZHANG Yunhui3, CHI Ming1, XING Yungao1, XU Bo1, XU Dayong1, WANG Baoxiang1,*

(1Lianyungang Academy of Agricultural Science, Lianyungang 222000, China;2Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;3Institute of Germplasm Resources and Biotechnology, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China;*Corresponding author, email: wbxrice@163.com)

【Objective】It is of importance to promotesalt-tolerant and fragrant rice breeding. We obtainedtransgene free homozygous rice materials with salt-tolerance and fragrance by CRISPR/Cas9-mediated editing ofandinvariety Lianjing 11. 【Method】Targetsites were designed according to knockout efficiency of editing sites inandgene sequence. The pH-Ubi--knockout vector was constructed and transferred into the recipient variety Lianjing 11 by the-mediated technology. PCR detection for hygromycin, Cas9 marker and target gene sequencing were performed in thetransgenic progenies to obtain-homozygous lines without exogenous gene insertion. The seed traits and salt tolerance at seedling stage were analyzed. 【Result】Compared with the background material Lianjing 11, the 2-AP content ofT2significantly increased. After treated with 128 mmol/L NaCl solution for 14 days, the seedling height, the fresh and the dry weight of T2line 21-30 increased by 15.2%,45.2% and 13.2%, respectively. 【Conclusion】The successfulediting ofandby CRISPR/Cas9 technology developed aromatic salt-tolerant homozygous lines without exogenous gene insertion, speeding up the breeding process of pyramiding multiple traitsin rice.

rice; CRISPR/Cas9; salt-tolerant; fragrance;;

10.16819/j.1001-7216.2023.220907

2022-09-28;

2022-12-19。

連云港市財(cái)政專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（QNJJ2102; QNJJ2211; QNJJ1803）；江蘇省農(nóng)業(yè)重大品種創(chuàng)制計(jì)劃資助項(xiàng)目（PZCZ201704）；江蘇省政策引導(dǎo)類計(jì)劃（蘇北科技專項(xiàng)）資助項(xiàng)目（LYG-SZ202040）。