楊宗維 龐偉興 羅麗萍 楊亞娟 秦國海

（桂林力源糧油食品集團(tuán)有限公司技術(shù)中心，廣西桂林 541000）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的一種偶蹄動物的急性、熱性、高度接觸性傳染病?？梢鹭i牛羊等多種偶蹄家畜和野生動物發(fā)生嚴(yán)重疾病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為必須報告的傳染病之一，被我國列為一類動物疫病[1]?？谔阋卟《靖鶕?jù)血清學(xué)試驗可以分為7 種血清型，分別為O 型、A 型、C 型、亞洲1型（Asia1）、南非1 型（SAT1）、南非2 型（SAT2）和南非3 型（SAT3）[2]。根據(jù)7 個血清型的同源性又將其分為2 個群即O、A、C 型和亞洲1 型為一群，SAT1、SAT2、SAT3 為一群，2 個群之間的血清型同源性僅為25%～40%，群內(nèi)同源性可達(dá)60%～70%，但血清型之間無交叉和交叉免疫現(xiàn)象[3]。亞洲流行O 型口蹄疫，偶有點發(fā)A 型口蹄疫[4]。為了全面保護(hù)生豬養(yǎng)殖，多價口蹄疫苗產(chǎn)品成為了市場主流[5]。依據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第2 635 號，我國亞洲1 型口蹄疫已達(dá)到全國免疫無疫標(biāo)準(zhǔn)。按口蹄疫流行的血清型分析，以O(shè) 型和A 型2 個血清型為主，其中O 型以Mya-98 和PanAsia 為主，A 型以Sea-97 株為主[6]。疫苗接種依然是特異性預(yù)防口蹄疫的有效手段，而口蹄疫滅活疫苗由完整病毒經(jīng)過滅活后制成，在預(yù)防和控制口蹄疫的過程中發(fā)揮著重要作用[7]。根據(jù)口蹄疫的特點，選擇優(yōu)質(zhì)高效口蹄疫疫苗，也是構(gòu)建規(guī)?；i場生物安全體系的重要內(nèi)容[8]。綜上所述，本試驗旨在為養(yǎng)殖企業(yè)快速長效地提高豬群抗口蹄疫免疫力，篩選出高純度、高效價的豬用口蹄疫OA二價疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

在桂林力源糧油食品集團(tuán)某養(yǎng)殖基地，選取52 日齡同批次仔豬1 341 頭，豬群健康狀況良好。

1.2 試驗疫苗

試驗疫苗采購自市場常見6 個國內(nèi)品牌，均為豬用OA 二價滅活疫苗，廠家標(biāo)記為A、B、C、D、E、F。

1.3 試驗試劑

2 種O 型、A 型抗體檢測試劑盒，S1 購自北京金諾百特科技有限公司，S2 購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所。

1.4 試驗方法

1.4.1 疫苗146S 含量測定

試驗疫苗進(jìn)行盲標(biāo)后，送中國科學(xué)院過程工程研究所、中牧實業(yè)股份有限公司蘭州生物藥廠、中農(nóng)威特生物科技股份有限公司、申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海） 有限公司進(jìn)行各疫苗146S含量檢測，146S 測定方法為蔗糖密度梯度離心法。

1.4.2 動物試驗

⑴疫苗免疫及分組：將1 341 頭52 日齡仔豬隨機(jī)分為1 至6 組，各組仔豬實際頭數(shù)分別為219 頭、251 頭、203 頭、216 頭、236 頭、216 頭。依次于52 日齡、85 日齡免疫A、B、C、D、E、F 等6 種口蹄疫疫苗，每次免疫1 頭份。除口蹄疫苗外的其他疫苗免疫程序、飼養(yǎng)方式、保健方案等均保持一致。

⑵監(jiān)測時間：分別于一免后26 d（78 日齡）、二免后30 d（115 日齡）、出欄前（170 日齡）3 次從每組隨機(jī)挑選25 頭豬進(jìn)行頸靜脈采血，檢測免疫后抗體。

⑶抗體結(jié)果判定與計算：S1 試劑盒O 型抗體、A型抗體判定標(biāo)準(zhǔn)：S/N≤0.5 為陽性，S/N＞0.5 為陰性。S2 試劑盒抗體合格率計算模型：O 型抗體、A 型抗體效價≥1∶128 為合格，效價＜1∶128 為不合格，分別計算每種疫苗免疫后的O 型抗體合格率和A 型抗體合格率，并以O(shè) 型抗體合格率與A 型抗體合格率的平均值計算為疫苗的抗體合格率。S2 試劑盒平均抗體效價計算模型：計算每種疫苗免疫后的O 型抗體平均效價與A 型抗體平均效價，因為目前國內(nèi)主要流行的是O 型口蹄疫，因此O 型和A 型按7∶3 的權(quán)重計算每種疫苗免疫后的加權(quán)平均抗體效價。

2 結(jié)果與分析

2.1 146S 含量

4 家檢測單位測定146S 含量見表1、圖1，6 個疫苗的146S 含量差異明顯。雖然同一廠家同一批次的疫苗在不同檢測機(jī)構(gòu)的檢測結(jié)果各不相同，但通過圖1 折線圖可以看出，各檢測機(jī)構(gòu)檢測的結(jié)果在趨勢上相同。為降低實驗室之間的檢測誤差，最終以4 家機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果的平均值進(jìn)行對比。結(jié)果顯示，所有廠家疫苗的146S抗原含量均超過10 μg/頭份，其中疫苗A、E 的抗原含量超過30 μg/ 頭份，疫苗D、F 的抗原含量在20～30 μg/頭份之間，疫苗B、C 的抗原含低于20 μg/頭份。

圖1 每毫升疫苗146S 含量

表1 疫苗中的146S 含量（μg/mL）

2.2 抗體水平

2.2.1 一免后抗體水平

通過表2 結(jié)果可看出，豬群第1 次免疫后，A、C、D 和E 等4 種疫苗的O 型和A 型抗體陽性率均達(dá)到100%，疫苗B 和F 的抗體陽性率略低，最低為88%。所有疫苗免疫1 次后的O 型和A 型抗體陽性率均超過70%，符合國家動物疫病強(qiáng)制免疫指導(dǎo)意見。

表2 一免后S1 試劑盒檢測結(jié)果

S2 試劑盒既可判斷抗體合格率又可測定抗體效價，本試驗對所有血清進(jìn)行了效價測定，并計算了所有疫苗首免后抗體平均效價和抗體合格率，抗體結(jié)果列于表3。從表3 可以看出，疫苗B、C 和E 廠家的O 型抗體合格率超過70%，其余3 個疫苗均低于70%。所有疫苗的A型抗體合格率普遍高于對應(yīng)的O 型抗體合格率，只有疫苗F 的抗體合格率低于70%。根據(jù)首免抗體的合格率來看，不是所有疫苗均能達(dá)到國家對口蹄疫抗體合格率不低于70%的要求。比較O 型和A 型的平均抗體合格率，疫苗在一免后的排名順序為：C＞E＞B＞A＞D＞F。

2.2.2 二免后抗體水平

二免血清用S1 試劑盒檢測的抗體結(jié)果列于表4，通過表4 可看出，豬群第2 次免疫6 種疫苗后，除免疫疫苗F 的O 型抗體陽性率為92%，免疫其他5 種疫苗O 型抗體陽性率都能達(dá)到100%。且免疫疫苗C 和E 的A 型抗體陽性率也達(dá)到100%，疫苗A、B、D 的A 型抗體陽性率在90%以上，疫苗F 的A 型抗體陽性率最低，為88%。

表4 二免后S1 試劑盒檢測結(jié)果

二免血清用S2 試劑盒的抗體檢測結(jié)果以及平均抗體效價和抗體合格率同列于表5，從表5 看出，6 種疫苗加強(qiáng)免疫后，O 型的抗體合格率均超過70%，其中疫苗B、C、E 高達(dá)100%，疫苗F 最低，僅為72%。對于高度烈性傳染病來說，加強(qiáng)免疫后1 個月的抗體合格率僅為72%，顯然太低，在疫苗篩選時應(yīng)該直接剔除。在A 型抗體方面，6 個疫苗誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)和平均抗體效價均較好，遠(yuǎn)超70%的最低要求。綜合S2 試劑盒檢測的平均抗體合格率和平均抗體效價，疫苗在二免后的排名順序為：E＞C＞A≈B＞D＞F。

2.2.3 出欄前抗體水平

通過表6 可看出，豬群出欄前抗體水平，除免疫F疫苗的抗體陽性率為96%外，免疫其他5 種疫苗O 型抗體陽性率都能達(dá)到100%。且免疫疫苗B、C、D 和E的A 型抗體陽性率也達(dá)到100%，免疫疫苗A 和F 的A型抗體陽性率在90%以上。

由表7 可看出，所有疫苗的O 型和A 型的抗體合格率均高于70%，其中疫苗C 和疫苗E 的O 型和A 型的抗體合格率均高達(dá)100%，且平均抗體效價也最高，均超過400。疫苗A 和疫苗B 的抗體合格率和平均抗體效價都相近，無顯著差異。疫苗F 的出欄前平均抗體效價也較高，但樣本間的抗體效價差異很大，尤其是O 型抗體，有24%的＜128、44%為128～256、12%為256～512、12%為512～1024、有8%的≥1 024，如此懸殊的差異說明免疫抗體的產(chǎn)生可能與豬只個體存在很大的關(guān)系。綜合O 型和A 型抗體合格率和平均抗體效價，疫苗在出欄前抗體的排名順序為：E≈C＞B≈A＞D＞F。

表7 出欄前S2 試劑盒檢測結(jié)果

3 討論

口蹄疫疫苗的質(zhì)量與抗原含量存在直接的關(guān)系，具體抗原含量達(dá)到多高才算合格，國際上沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本試驗僅檢測了各疫苗的146S 抗原含量，排名順序為：E＞A＞F＞D＞B＞C。其中疫苗E 和A 的每頭份抗原含量超過30 μg、疫苗D 和F 的抗原含量在20～30 μg、疫苗B 和C 的抗原含量在20 μg 以下。

根據(jù)S1 試劑盒檢測結(jié)果，首免后抗體陽性率最低的F 疫苗也達(dá)到了88%，說明6 種疫苗免疫后都可以在1 個月內(nèi)產(chǎn)生有效的抗體應(yīng)答。不同抗體檢測方法對豬口蹄疫疫苗臨床免疫評價的陽性率差異不明顯[9]，S1 試劑盒只能進(jìn)行定性檢測，難以評價每種疫苗的免疫質(zhì)量差異。液相阻斷ELISA 與病毒中和試驗高度相關(guān)[10]，為此，本文用S2 試劑盒再次測定了O 型和A 型的抗體效價。結(jié)果顯示，疫苗C 的首免O 型和A 型抗體合格率均達(dá)到100%，平均效價超過256，為所有疫苗中最好，可是疫苗C 的146S 抗原含量在6 個評估疫苗中最低，特別是遠(yuǎn)低于疫苗E 和疫苗A。146S 粒子易受環(huán)境影響分解[11]，說明疫苗抗原含量評價口蹄疫疫苗質(zhì)量有不確定性?？谔阋咭呙缡且环N油佐劑滅活疫苗，其起保護(hù)作用的主要因素是免疫抗體。因此，對于豬場來說更應(yīng)該把免疫抗體作為篩選疫苗和免疫質(zhì)量評價的重要因素。本研究中依據(jù)S2 試劑盒的檢測結(jié)果綜合考慮O 型和A型疫苗的免疫抗體，各疫苗的首免抗體排名為：C＞E＞B＞A＞D＞F。綜合來看，疫苗C 和E 能夠在一免后為豬群防控口蹄疫O 型和A 型感染提供更快速有效的保護(hù)。

加強(qiáng)免疫后，通過S1 試劑盒檢測結(jié)果，疫苗C 和E 的保護(hù)率優(yōu)于其他疫苗。結(jié)合S2 試劑盒的檢測結(jié)果，二免后豬群抗體合格率都有一定程度提升，但A 型平均抗體效價有升有降。綜合來看，疫苗C 和E 在二免后能夠全面產(chǎn)生口蹄疫O 型和A 型抗體，且疫苗E 的抗體效價相對更高。同時疫苗B 和D 在分別針對O 型和A型口蹄疫方面表現(xiàn)出一定優(yōu)勢。

口蹄疫疫苗的免疫持續(xù)期為6 個月，但由于流行毒株和疫苗毒株在抗原性上存在一定的差異，疫苗誘導(dǎo)的針對流行毒株的免疫保護(hù)期可能會縮短，抗原差異越大免疫保護(hù)期就越短[12]。出欄前S1 試劑盒檢測結(jié)果顯示，各組抗體水平有了進(jìn)一步升高，說明6 種疫苗保護(hù)期可滿足出欄（170 日齡）需求。結(jié)合S2 試劑盒檢測結(jié)果，此時各組之間抗體水平差距縮小，且都有強(qiáng)陽性的結(jié)果，出欄前6 種疫苗O 型抗體合格率排序為C≈E＞B≈A＞D＞F。綜合來看，免疫疫苗C 和E 的豬群的抗體效價更高、長效保護(hù)率更好。

對比首免、二免和出欄前的抗體排名情況，首免抗體較好的疫苗C 和疫苗E，在加強(qiáng)免疫后1 個月和出欄前的抗體水平也一直最好，在6 種疫苗中始終保持靠前水平。疫苗D 和疫苗F 的首免抗體較差，在二免后和出欄前的抗體水平也最差。因此，本文認(rèn)為僅用首免后1個月的抗體結(jié)果完全可以作為篩選疫苗和進(jìn)行疫苗免疫質(zhì)量評價的依據(jù)。由于不同品牌的試劑盒，檢測結(jié)果有差異[13]，建議結(jié)合目的篩選合適的試劑盒作為評價的工具。

在本研究中，疫苗A、D 和F 首免1 個月的O 型抗體合格率均低于國家動物疫病強(qiáng)制免疫指導(dǎo)意見對口蹄疫疫苗免疫抗體不低于70%的要求，在3 次抗體檢測排名中，這3 種疫苗均排名靠后，因此，建議對于首免1個月的S2 試劑盒O 型抗體合格率低于70%的疫苗可以直接淘汰。

有文獻(xiàn)報道，口蹄疫疫苗免疫效果與抗原含量呈正相關(guān)[14]。本試驗根據(jù)146S 的檢測結(jié)果，在6 種疫苗中，疫苗A 和E 的抗原含量最高，均超過30 μg，但二者的3 次抗體檢測結(jié)果均存在巨大差異，說明相同抗原含量的疫苗不一定能誘導(dǎo)產(chǎn)生同樣的免疫抗體反應(yīng)。同樣，疫苗C 的抗原含量僅為13.4 μg，約為疫苗E 的1/3，但二者免疫后的抗體結(jié)果非常接近，均達(dá)到較高水平，在3 次抗體檢測結(jié)果中均排名前2 位，說明抗原含量并不是越高越好，疫苗的免疫效果除了與抗原含量有關(guān)外，還與疫苗種毒的免疫原性、佐劑等也有關(guān)系。有文獻(xiàn)指出，如果疫苗中存在高濃度的非抗原蛋白會抑制口蹄疫146S 抗原的免疫效果[15]。

4 結(jié)論

146S 抗原含量是影響口蹄疫疫苗質(zhì)量的重要因素之一，本次試驗認(rèn)為單純的通過146S 含量無法評估一款口蹄疫疫苗的保護(hù)效果，還需要結(jié)合更多的產(chǎn)品數(shù)據(jù)及動物試驗。本試驗建立了口蹄疫OA 疫苗S2 試劑盒的平均抗體合格率和加權(quán)平均抗體效價的計算模型，并評價了6 個廠家疫苗的質(zhì)量差異，為后續(xù)開展口蹄疫疫苗質(zhì)量評估提供了依據(jù)。