尹雪宇,陳遠(yuǎn)騰,莊爾俊,趙俊杰,董 玲,李海龍,2

帶絳蟲是一種腸道寄生蠕蟲,人因生食含有囊尾蚴的豬肉或牛肉而感染[1],人體感染帶絳蟲病后通常無(wú)明顯癥狀,少數(shù)患者會(huì)出現(xiàn)腹痛、腹瀉、消化不良和食欲不振等不典型癥狀[2],感染人類的帶絳蟲主要有豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲。在我國(guó)帶絳蟲主要分布于云南、西藏以及四川等少數(shù)民族地區(qū)。云南大理是白族聚集地區(qū), 當(dāng)?shù)鼐用裣彩成?以生豬肉或豬肝為主),是導(dǎo)致帶絳蟲病流行的主要原因,近年有研究證實(shí)云南大理流行的帶絳蟲以亞洲帶絳蟲為主[3]。報(bào)告顯示帶絳蟲在大理州各地感染程度不同,大理市感染率最高為87.29%,洱源縣其次占6.08%,其余周邊地區(qū)帶絳蟲感染率相對(duì)較低[4]。近年有學(xué)者對(duì)彌渡縣帶絳蟲流行分布情況進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果顯示彌渡縣人群帶絳蟲感染率為15.7%,蟲種均為亞洲帶絳蟲[5]。

12S rRNA是一種存在于線粒體核糖體中的小亞基RNA,進(jìn)化速率較高[6],常用于各種脊椎動(dòng)物的親緣關(guān)系比較中[7-8],研究表明12S rRNA基因也可以用于豬帶絳蟲、牛帶絳蟲和亞洲帶絳蟲的分類鑒定[9]。因此,本研究基于線粒體12S rRNA基因序列對(duì)大理州5個(gè)地區(qū)的帶絳蟲群體進(jìn)行遺傳多樣性分析,旨在為大理州帶絳蟲病的防控和研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 以大理州血吸蟲防治所2019年5月至2021年8月收治的帶絳蟲患者為研究對(duì)象,采用檳榔—南瓜子—甘露醇法對(duì)患者進(jìn)行驅(qū)蟲[10],收集到131份亞洲帶絳蟲樣本,對(duì)采集到的亞洲帶絳蟲樣本進(jìn)行分類,其中大理市(DL)58份、巍山縣(WS)14份、彌渡縣(MD)18份、漾濞縣(YB)24份、洱源縣(EY)17份。各樣本來(lái)源地的地理分布情況如圖1所示。

[審圖號(hào):GS(2022)1873號(hào)]圖1 大理州5個(gè)亞洲帶絳蟲群體地理分布Fig.1 Geographical distribution of 5 populations of Taenia asiatica in Dali Prefecture

1.2 試劑與儀器 組織DNA提取試劑盒(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)、2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化有限公司)、DL2000 DNA Maker(TaKaRa大連寶生生物工程有限公司)、雙蒸水、 DNA凝膠電泳成像系統(tǒng)(美國(guó)UVA公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取和引物設(shè)計(jì) 取下絳蟲孕節(jié)并將其剪碎,用研磨器研磨后,按照組織DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA,存放于4 ℃冰箱內(nèi)。參考文獻(xiàn)報(bào)道[11]對(duì)線粒體12S rRNA基因進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì),上游引物:5′-AGGGGATAGGACACAGTGCCAGC-3′;下游引物:5′-CGGTGTGTACATGAGCTAAAC-3′。

1.3.2 PCR擴(kuò)增體系和程序 PCR擴(kuò)增總反應(yīng)體系為30 μL,其中2×Taq PCR MasterMix 15 μL,上游引物和下游引物各1 μL,模板DNA 2 μL,雙蒸水11 μL。反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,57 ℃退火45 s,72 ℃延伸35 s,共35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。

1.3.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)和測(cè)序 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè),于凝膠電泳成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果,將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行單向測(cè)序,測(cè)序引物與擴(kuò)增引物相同。

1.3.4 序列分析 通過(guò)MEGA7.0軟件對(duì)測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì)對(duì)齊,在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì);將經(jīng)同源性比對(duì)為亞洲帶絳蟲的序列按地區(qū)進(jìn)行分組整合;通過(guò)DNASP5.10.01軟件對(duì)序列進(jìn)行遺傳多樣性分析、中性檢驗(yàn)分析以及遺傳分化系數(shù)FST和基因流Nm分析(公式為Nm=(1/FST-1)/4)[12];通過(guò)MEGA7.0計(jì)算各組之間的堿基組成、變異位點(diǎn)數(shù)以及遺傳距離。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 131條帶絳蟲12S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示(部分結(jié)果),長(zhǎng)度為493 bp。測(cè)序產(chǎn)物經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST同源性比對(duì),131條帶絳蟲樣本均確定為亞洲帶絳蟲,與NCBI中亞洲帶絳蟲12S rRNA基因序列(編號(hào):MT448955)比對(duì),同源性為:97.67%～100%。

注:M:DNAMaker 2000;1～8:部分陽(yáng)性樣品,目的片段493 bp。圖2 部分亞洲帶絳蟲樣本12S rRNA基因PCR電泳圖Fig.2 PCR amplification of 12S rRNA from part of Taenia asiatica samples

2.2 堿基組成 通過(guò)MEGA7.0分析得到的亞洲帶絳蟲線粒體12S rRNA基因片段堿基組成如表1所示,A、T、G、C的平均含量分別為28.3%、43.2%、19.4%和9.1%,A+T含量(71.5%)明顯高于G+C含量(28.5%),呈現(xiàn)A/T偏倚性。

表1 亞洲帶絳蟲各群體12S rRNA基因片段堿基組成Tab.1 Base composition of 12S rRNA gene fragment in different populations of Taenia asiatica

2.3 遺傳多樣性及變異 5個(gè)群體12S rRNA基因序列共檢測(cè)到138個(gè)變異位點(diǎn),共定義76個(gè)單倍體型。其中單倍型多樣性為0.983 0,核酸多樣性為0.033 2,呈現(xiàn)出高Hd高Pi的分布模式(Hd>0.5, Pi>0.005)。各群體中大理市的單倍型數(shù)最多為45,彌渡縣的單倍型數(shù)最少為13。巍山群體的變異位點(diǎn)數(shù)最多為93,漾濞群體的變異位點(diǎn)數(shù)最少為25。巍山群體的單倍型多樣性和核酸多樣性最高,分別為1和0.054 9;彌渡群體的單倍型多樣性最低,為0.966 7,漾濞群體的核苷酸多樣性最低,為0.026 9;對(duì)各群體12S rRNA基因進(jìn)行中性檢驗(yàn),其中大理市和巍山縣的Fu’s Fs和Tajima’s D分別為顯著負(fù)值,推測(cè)這兩個(gè)群體可能曾發(fā)生過(guò)群體擴(kuò)張(表2)。

表2 基于12S rRNA基因的亞洲帶絳蟲群體遺傳多樣性Tab.2 Genetic diversity of Taenia asiatica populations based on 12S rRNA gene

2.4 遺傳分化系數(shù)(FST)與基因流(Nm) 運(yùn)用DNASP軟件計(jì)算亞洲帶絳蟲群體間的遺傳分化系數(shù)。基于12S rRNA基因分析結(jié)果顯示(表3),各群體之間的遺傳分化指數(shù)范圍為-0.019 13～0.040 80,除了巍山群體與各群體間有極小的遺傳分化(01),其中以漾濞群體與巍山群體之間的基因交流最為頻繁,Nm為22.497 95。

表3 基于12S rRNA基因的亞洲帶絳蟲群體遺傳分化系數(shù)與基因流Tab.3 FST and Nm of Taenia asiatica population based on 12S rRNA gene

2.5 遺傳距離 各群體12S rRNA基因經(jīng)MEGA7.0計(jì)算得到的遺傳距離結(jié)果見表4, 大理市與巍山縣群體之間的遺傳距離最大為0.022 9,漾濞縣與洱源縣群體之間的遺傳距離最小為0.002 3;其中巍山群體與各群體間均具有較高的遺傳距離(0.020 0～0.022 9),該群體與各群體間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。推測(cè)與各地區(qū)亞洲帶絳蟲群體進(jìn)化速度不同有關(guān)。

表4 基于12S rRNA基因的亞洲帶絳蟲群體遺傳距離Tab.4 Genetic distance of Taenia asiatica based on 12S rRNA gene

3 討 論

本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得5個(gè)亞洲帶絳蟲群體的12S rRNA基因,結(jié)果顯示12S rRNA基因序列的堿基組成呈A/T偏倚性,與蠕蟲線粒體基因組成特點(diǎn)相吻合[13];單倍型多樣性和核酸多樣性是衡量一個(gè)物種或群體遺傳多樣性的重要指標(biāo),單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別以0.5和0.005為界,數(shù)值越大說(shuō)明遺傳多樣性越高[14]。在本研究中,12S rRNA的單倍型多樣性和核酸多樣性分別為0.983 0(Hd>0.5)和0.033 2(Pi>0.005),說(shuō)明這5個(gè)群體均經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)時(shí)間的演化[15],遺傳多樣性較高。

FST和Nm[17]是反應(yīng)群體進(jìn)化的兩個(gè)重要參數(shù)。FST值的范圍在0～1之間有意義,若00.25,表示兩群體間有極大的遺傳分化;若FST值為負(fù),表示兩群體間不存在遺傳分化[18];Nm以1為臨界值,數(shù)值越大則群體間基因流動(dòng)交流越頻繁且發(fā)生遺傳漂流的概率越小[19]。本研究中,大理州5個(gè)群體的遺傳分化指數(shù)為-0.019 13～0.040 80,其中巍山群體與其他群體之間的FST范圍為0.010 99～0.040 80,說(shuō)明巍山群體與各群體之間存在極小的遺傳分化,其余4個(gè)群體之間的FST均為負(fù)值,說(shuō)明這4個(gè)亞洲帶絳蟲群體間沒(méi)有遺傳分化;基因流范圍5.877 45～22.497 95,說(shuō)明各群體間基因交流水平較高。

群體間的遺傳距離是衡量群體間的親緣關(guān)系的指標(biāo),遺傳距離越大,親緣關(guān)系越遠(yuǎn)[20]。本研究中大理與巍山群體之間的遺傳距離最大,漾濞與洱源群體之間的遺傳距離最小,說(shuō)明漾濞縣和洱源縣亞洲帶絳蟲群體之間存在較近的親緣關(guān)系,巍山群體與各群體間的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn);Fu’s Fs[21]或Tajima’s D[22]值是中性檢驗(yàn)的兩個(gè)重要參數(shù),可以推算種群的歷史動(dòng)態(tài),當(dāng)Fu’s Fs或Tajima’s D結(jié)果為顯著負(fù)值,則表明群體出現(xiàn)過(guò)種群擴(kuò)張效應(yīng);當(dāng)Fu’s Fs或Tajima’s D結(jié)果不顯著或接近于0時(shí),說(shuō)明該群體大小穩(wěn)定,符合中性檢驗(yàn)。這5個(gè)群體中大理群體和巍山群體的Fu’s Fs和Tajima’s D分別為顯著負(fù)值,說(shuō)明大理市和巍山縣的亞洲帶絳蟲群體可能發(fā)生過(guò)群體擴(kuò)張,這兩個(gè)群體在某個(gè)時(shí)期的感染率可能升高。

本研究中亞洲帶絳蟲群體遺傳分化程度較低,但均經(jīng)過(guò)了長(zhǎng)久的歷史演化,遺傳多樣性較高。本研究對(duì)大理州亞洲帶絳蟲群體12S rRNA基因序列進(jìn)行了測(cè)定和分析,評(píng)估亞洲帶絳蟲群體的遺傳多樣性,為亞洲帶絳蟲的遺傳多樣性研究提供了相關(guān)數(shù)據(jù)。

利益沖突:無(wú)

引用本文格式:基于線粒體12S rRNA基因?qū)Υ罄碇輥喼迬Ы{蟲遺傳多樣性的分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2023,39(8):784-788. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.086