郜道玉，崔華威，周源，龔萍，陳潔，萬平民，邵志勇，華娟，李鵬，金爾光*

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢430208；2.長江大學動物科學學院，湖北 荊州434025；3.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢430070）

中國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)國和消費國，每年畜牧業(yè)抗生素使用量占全球用量的一半左右[1]。然而進入畜禽體內的抗生素僅有少部分被吸收利用，絕大部分以原藥或代謝產(chǎn)物形式隨糞尿排出體外[2-3]?？股氐倪x擇壓力會誘導腸道微生物和環(huán)境微生物產(chǎn)生抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）和耐藥菌（Antibiotic resistant bacteria，ARB），導致畜禽糞污中殘存大量的ARGs 和ARB。糞污中的ARGs 和ARB 可隨空氣逸散、地表徑流、土壤滲濾及還田利用等進入生態(tài)環(huán)境，進而進入食物鏈對人類和動物健康構成潛在危害。

異位發(fā)酵床是以微生物好氧發(fā)酵為基礎，結合原位發(fā)酵床和好氧堆肥形成的一種新型糞污處理技術，其以鋸末、秸稈和礱糠等為墊料，通過接種復合微生物菌劑以及連續(xù)添加糞污，實現(xiàn)異地高效同步處理糞污[4-5]。翻堆是異位發(fā)酵床動態(tài)堆肥的保障，通過翻堆補充糞污、增加通氣量，為微生物增殖提供養(yǎng)分和氧氣，調節(jié)溫度的變化及微生物群落結構，促進物料的分解，提高ARGs 等污染物的消減效果。研究表明，堆肥過程中產(chǎn)生的高溫可殺滅不耐熱的ARGs 宿主菌、調整微生物群落結構，顯著降低畜禽糞便中ARGs 和可移動遺傳因子（MGEs）的多樣性和豐度[6-7]。錢勛[8]指出，不充分堆肥、普通高溫堆肥、連續(xù)高溫堆肥均可降低奶牛糞便中大部分ARGs 的豐度，其中連續(xù)高溫堆肥效果最佳。由此可見，堆肥是去除糞污中ARGs的有效途徑之一。

近年來，異位發(fā)酵床堆肥技術的研究主要集中在不同墊料對微生物菌落多樣性和纖維素降解的影響方面[4，9]，關于不同翻堆頻次對異位發(fā)酵床中ARGs 和整合子基因（intI1）的相對豐度的變化與微生物菌落豐度變化關系的報道較少，僅見張錦[10]報道實驗室堆肥2 d 翻堆1 次可顯著降低豬糞中ermB、ermC、tetQ、tetW、qnrS、qnrD的相對豐度。本研究以谷殼、鋸末和礱糠等為墊料，輔以接種復合微生物菌劑，探討翻堆頻次對異位發(fā)酵床堆肥過程中ARGs、intI1和細菌群落變化的影響，分析ARGs 相對豐度變化與微生物菌落和intI1之間的關系，為闡明糞污異位發(fā)酵床堆肥過程中ARGs變化的主要影響因素提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

堆肥材料包括奶牛糞污（糞便、尿液及生產(chǎn)污水，含水量約90%）和異位發(fā)酵床墊料（谷殼、鋸末、礱糠），其均來自湖北某奶牛場。復合微生物菌劑（含芽孢桿菌、糞球菌、乳酸菌和酵母菌等，總菌量≥1×1010CFU·g-1）由武漢旭潤環(huán)保科技有限公司提供。

土壤基因組DNA 提取試劑盒（Fast DNA Spin kit for soil）購自TIANGEN公司；TaqDNA聚合酶購自大連寶生物公司（TAKARA），Agarose 瓊脂糖（每瓶100 g）購自北京索萊寶科技有限公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix購自上海根生生物科技有限公司；抗生素抗性基因引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 試驗設計

根據(jù)奶牛場異位發(fā)酵床生產(chǎn)方式，于2020年7月29 日至9 月27 日采用無蓋塑料盒在奶牛場雨棚內開展試驗。塑料盒總容積0.7 m3（高765 mm、上外徑1 060 mm、下外徑950 mm），底部留有12 個直徑1 cm小孔。墊料總體積0.5 m3，谷殼、鋸末、礱糠按體積比2∶1∶1 添加，根據(jù)各自質量和含水量計算出墊料總質量為60 kg，含水量12%。然后添加60 kg 糞污、150 g菌劑和1 500 g 尿素，調整物料C/N 為30∶1，含水率為60%左右，充分混合均勻后裝入塑料盒。試驗期間，第1 天添加糞污30 kg，第2～47 天根據(jù)含水量變化調整糞污添加量（約4～8 kg·d-1）。

按翻堆頻次分為兩組，T1組：1 d翻堆1次；T2組：2 d翻堆1次。

試驗期間含水量控制在60%左右。采用微波爐加熱法監(jiān)測含水量，并根據(jù)含水量變化調整糞污添加量，糞污添加量（kg）=（60%-發(fā)酵床含水量）×60÷90%。

用實時數(shù)顯溫度儀垂直插入物料中心20～30 cm處監(jiān)測溫度，每天9：00 記錄實時數(shù)顯溫度儀溫度及空氣溫濕度測定器的溫度和濕度。

用四分法取5 g 樣品，加45 mL 無菌水，室溫下振蕩器振蕩30 min，然后靜置30 min，用pH 計測定上清液pH，每份樣品3個重復。

1.3 樣品采集

分別于堆肥第0、5、12、33、47、61天（T1組記為T1-0、T1-5、T1-12、T1-33、T1-47、T1-61，T2組記為T2-0、T2-5、T2-12、T2-33、T2-47、T2-61）收集樣品。采用五點采樣法從每個處理的上、中、下層（距離表面10、20、30 cm）采樣，樣品充分混合均勻，用四分法收集約500 g，然后分成兩等份，密封于自封袋，其中一份儲存在4 ℃冰箱中用于理化性質分析，另一份冷凍干燥后，研磨成1 mm，儲存在-80 ℃冰箱，用于后續(xù)生物分析。

1.4 DNA提取

根據(jù)TIANGEN 土壤基因組DNA 提取試劑盒操作手冊，分別提取上述樣品DNA，使用分光光度計（NANoDROP ONEC，Thermo Fisher Scientific，美國）檢測DNA 純度和濃度，所有提取的DNA 樣品在測序之前，均密封在-80 ℃的冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 定量PCR檢測

根據(jù)課題組的前期研究，選擇包括四環(huán)素類抗性基因（tetG、tetW）、磺胺類抗性基因（sul1、sul2）、b-內酰胺類抗性基因（blaTEM-1）、大環(huán)內酯類抗性基因（ermQ）和整合子基因（intI1）7 種目標基因在ABI ViiA 7 Real Time PCR System 熒光定量PCR 儀上進行熒光定量PCR 檢測。目標基因的引物設計參照文獻[11] ，引物序列、片段大小及退火溫度見表1。反應體系為基因組DNA 1 μL，iTaq Universal SYBR Green Supermix（2x）10μL，10μmol·L-1的上下游引物各0.25μL，雙蒸水8.5 μL，總體積20 μL。反應條件：95 ℃3 min；95 ℃5 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s，共40 個循環(huán)；65 ℃延伸5 s。每個樣品3個重復。運行過程中，通過溶解曲線來檢查非特異擴增，根據(jù)標準曲線的相關系數(shù)≥0.99計算ARGs拷貝數(shù)。

表1 PCR和qPCR引物序列、片段大小及退火溫度Table 1 PCR and qPCR primer sequence，fragment size and annealing temperature

1.6 16S rRNA高通量測序

使用上海派森諾生物科技有限公司Illumina HiSeq平臺進行16S rRNA 基因測序，確定堆肥樣品中的細菌群落。使用PCR 通用引物806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）和338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCAG）擴增V3～V4 區(qū)域。按照DADA2 方法進行去引物、質量過濾、拼接和去嵌合體等步驟。使用Vsearch（v2.13.4_linux_x8_64）對97%相似度水平高質量序列進行聚類，輸出代表序列和OTU 表。采用RDP分類器對OTU的代表性序列進行分類。

1.7 統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS Statistics（25.0 版）對各處理樣品之間的顯著差異進行相關分析。使用Graphpadprism 8.0.2 軟件對目標基因進行分析和繪圖。使用派森諾基因云中的熱圖，繪制Top35 細菌群落的熱圖。采用CANOCO（5.1版）進行冗余分析，探究影響ARGs豐度變化的主要因素?；贏RGs、MGEs 和細胞菌屬之間的Pearson 相關關系（P＜0.05，R＞0.6），使用Gephi 0.9.2進行網(wǎng)絡分析。

2 結果與討論

2.1 糞污降解過程中溫度和pH的變化

堆肥過程中的溫度影響微生物的活動和有機質的降解速率，低分子物質（有機物、蛋白質和糖類等）被微生物利用產(chǎn)生大量的熱量，進而可升高堆肥的溫度。本研究根據(jù)溫度的變化趨勢將堆肥過程分為4個階段，即升溫期、高溫期、降溫期及腐熟期，堆肥過程中兩處理組的溫度整體呈先上升后下降的變化趨勢（圖1A）。從圖1A 可看出，T1、T2 組堆肥前期溫度快速上升，分別在第5 天和第12 天達到最高溫度（59.9 ℃、64.5 ℃），第2 天至第40 天均保持在50 ℃以上，第40 天后逐步降低，堆肥結束時接近環(huán)境溫度?！缎笄菁S便無害化處理技術規(guī)范》（GB/T 36195—2018）要求堆肥溫度≥50 ℃的時間不少于7 d，本研究中50 ℃以上溫度超過7 d，滿足糞污無害化處理要求。Chang 等[12]的研究表明，堆肥過程中添加功能性菌劑、調理劑、翻堆等有利于增強微生物活性，促進微生物繁殖，提高堆肥溫度，延長高溫持續(xù)時間。本研究T1 和T2 組50 ℃以上溫度維持了39 d，可能與發(fā)酵床墊料、添加復合微生物菌劑、動態(tài)補充糞漿等有利于促進微生物活動有關；40 d 后溫度逐步降低，可能與可利用養(yǎng)分減少、微生物活動減弱等有關。高溫期T2 組溫度高于T1 組，可能與2 d 翻堆1 次有利于減少熱量散失等因素有關?？梢姡? d 翻堆1 次更有利于提高堆肥溫度和延長高溫期。

圖1 糞污降解過程中溫度和pH的變化Figure 1 Variation of temperature and pH during degradation of manure and sewage

T1、T2 組pH 值變化趨勢見圖1B。從圖1B 可以看出，第0天時pH值最大（9.16），隨后逐步降低，試驗結束時T1、T2 組pH 值分別降至6.69 和6.48。堆肥過程中pH 值的變化對微生物活動有較大的影響，當pH值為6.7～9.0 時，微生物更加活躍，有利于其生長及最大限度地分解堆肥物料[13]。本研究堆肥初始物料pH值為9.16，與上述報道中pH 值范圍接近，可為微生物的快速增殖和堆肥物料的分解提供良好生境。試驗結束時堆肥產(chǎn)物中pH 值較初始物料明顯降低（6.69和6.48），這可能與堆肥過程中的氨揮發(fā)、微生物代謝產(chǎn)生有機酸及其硝化作用產(chǎn)生無機酸的積累等有關[14-15] 。

2.2 糞污降解過程中ARGs和intI1的相對豐度變化

2.2.1 目標基因總相對豐度變化

采 用qPCR 技 術 檢 測 了6 種ARGs（sul1、sul2、tetG、tetW、blaTEM-1、ermQ）和intI1的相對豐度。T1 和T2 組目標基因總相對豐度整體上呈現(xiàn)先降低后升高再降低的變化趨勢（圖2）。從圖2可看出，T1和T2組總相對豐度在0～33 d逐步降低，33～47 d小幅度增加，47～61 d 逐步降低，其中第33 天較第0 天分別降低了74.05%、78.35%，相對而言T2 組高溫期的效果較好。試驗結束時T1、T2 組目標基因總相對豐度較第0 天分別降低82.33%、80.46%。研究表明，堆肥過程中保持相對較高的溫度可殺滅/去除ARGs 宿主菌、降解ARGs，從而降低目標基因豐度[8]。Wang 等[16]報道，堆肥高溫期可明顯降低ARGs 的豐度；Lin 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，高溫（50～60 ℃）堆肥可有效降低豬糞中ARGs 的總相對豐度。本研究高溫階段目標基因的豐度變化與上述報道一致，說明堆肥過程中持續(xù)保持較高溫度可能有利于降低ARGs 的豐度。Qian 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，牛糞好氧堆肥初期到高溫期物料中部分目標ARGs豐度逐漸降低，而高溫期到腐熟期升高。本研究第47 天也出現(xiàn)類似情況，這可能與物料逐步腐熟，溫度逐漸下降，高溫環(huán)境下被抑制的微生物恢復活性及后續(xù)添加糞漿帶入ARGs等有關[19]。

圖2 糞污降解過程中T1和T2組目標基因總相對豐度變化Figure 2 Changes of the total relative abundance of target genes in group T1 and T2 during degradation of manure and sewage

2.2.2 目標基因相對豐度變化

從圖3 可以看出，T1 和T2 組tetG、tetW、sul1、blaTEM-1、ermQ的豐度整體上逐步降低，堆肥結束時較第0 天 分 別 降 低 了16.70%（P＞0.05）、87.88%（P＜0.01）、54.60%（P＜0.05）、＞99.99%（P＜0.01）、97.80%（P＜0.01）和61.33%（P＜0.01）、99.46%（P＜0.01）、50.91%（P＞0.05）、99.29%（P＜0.01）、82.23%（P＜0.01）；而T1組sul2豐度先降低后逐步升高，T2 組呈降低-升高-降低的波動性變化，堆肥結束時T1 組增加了32.62%（P＞0.05）、T2 組降低了30.90%（P＞0.05）。相對而言，T2 組對6 種目標基因有較好的消除效果。堆肥后兩處理組tetW、blaTEM-1和ermQ的相對豐度顯著降低，與Li 等[11]報道的豬糞鋸末共堆肥可降低tetW、blaTEM、ermQ的相對豐度的結果一致，說明異位發(fā)酵床堆肥可有效去除tetW、blaTEM、ermQ。本研究中，T1 組tetG、sul1和T2 組tetG、sul1、sul2的相對豐度較第0 天有不同程度降低，與武晉萍等[20]和Selvam 等[21]的報道類似，T1 組sul2富集與Chang 等[12]的結果一致。Chen等[22]報道豬糞鋸末共堆肥產(chǎn)物中殘留的主要是tetG、sul1、sul2，本研究結果與其一致，可能與這些抗性基因對高溫有較強耐受性，或攜帶這些基因的宿主菌耐高溫難以被除去[23]，不同條件下相同抗性基因的變化也不一樣[24]等有關。盡管兩處理均可較好地降低tetG、tetW、sul1、sul2、blaTEM-1、ermQ的相對豐度，但并不能有效去除tetG、sul1、sul2，這些ARGs 仍然可能有擴散傳播的風險，因此堆肥過程中高效去除tetG、sul1、sul2的技術還有待于進一步研究。

圖3 糞污降解過程中T1和T2組ARGs相對豐度的變化Figure 3 Changes of the relative abundance of ARGs in group T1 and T2 during degradation of manure and sewage

2.2.3intI1相對豐度變化

堆肥過程中intI1的相對豐度整體上呈下降趨勢（圖4）。從圖4 可知，堆肥結束時T1、T2 組intI1相對豐度較第0 天分別降低了59.33%（P＜0.05）、99.91%（P＜0.01）。intI1是ARGs 水平轉移的一個重要MGEs，ARGs 可通過MGEs 在不同的微生物之間傳播，降低intI1的豐度可抑制ARGs 的擴散和傳播[25]。Duan等[26]報道指出，添加復合微生物菌劑可降低牛糞堆肥產(chǎn)物中intI1的相對豐度，抑制ARGs 的傳播。Fan等[27]發(fā)現(xiàn)堆肥可有效降低奶牛糞便中intI1的豐度。本研究結果與上述報道類似，說明兩處理均可較好去除intI1，其中T2 組的效果優(yōu)于T1 組。堆肥后intI1相對豐度降低可能是由于intI1不耐高溫、或高溫條件下某些不耐熱宿主菌被去除[28]，T1 和T2 組間的差別可能與連續(xù)添加糞污中的intI1含量、翻堆次數(shù)、細菌群落結構等有關。

圖4 糞污降解過程中T1和T2組intI1相對豐度的變化Figure 4 Changes of the relative abundance of intI1 in group T1 and T2 during degradation of manure and sewage

2.3 糞污降解過程中細菌群落的變化

取第0、5、12、33、47、61 天樣品，每個樣品3 個重復，計36 個樣品，經(jīng)組裝、質量控制和過濾后，共獲得2 247 318 條序列，鑒定出3 441 個相似度≥97%的OTUs?；诩訖郬eight-UniFace 距離的主坐標分析（PCoA）顯示，PCoA1 和PCoA2 解釋了細菌群落變化的57.5%（圖5）。同一時間點3 份重復樣品聚集在一起，說明各重復樣品間差異較小，實驗精確度高，取樣方法合理。第0 天樣品與堆肥其他時期樣品明顯分開，按照堆肥不同時期聚集在一起，表明堆肥過程對細菌群落結構變化有重要影響。

圖5 基于發(fā)酵床堆肥過程中的加權快速UniFrace的主坐標分析（PCoA）Figure 5 Principal coordinate analysis（PCoA）based on weighted fast UniFrace during composting in a fermented bed

選取相對豐度Top10 的物種構建柱狀堆疊圖（圖6A）。本研究第0天的樣品中門水平的優(yōu)勢菌群依次是厚壁菌門（Firmicutes，79.57%～84.36%）、變形菌門（Proteobacteria，5.66%～7.94%）、放線菌門（Actinobacteria，5.84%～6.98%）和 擬 桿 菌 門（Bacteroidetes，0.94%～1.21%），這與Zhang 等[29]報道的奶牛糞便中微生物群落優(yōu)勢菌門的結果基本一致。堆肥不同時期，細菌群落結構發(fā)生了明顯變化，F(xiàn)irmicutes 在0～12 d是最主要優(yōu)勢菌門，相對豐度占比為79.58%～87.57%，主要是由于屬于Firmicutes 的大部分菌屬耐高溫[30]。第33 天和第47 天，F(xiàn)irmicutes 的豐度占比下降 到 5.58%～15.16%，而 Bacteroidetes（13.09%～26.18%）、Proteobacteria（23.93%～30.81%）、綠灣菌門（Chloroflexi， 8.70%～21.20%） 和 Actinobacteria（14.25%～20.00%）的豐度逐漸增加，取代Firmicutes成為優(yōu)勢菌門。試驗結束時，與第0 天相比，F(xiàn)irmicutes 和Actinobacteria 的豐度T1 組分別降低了40.13%和2.68%，T2 組分別降低了43.71%和3.02%，Bacteroidetes 和Chloroflexi 的豐度T1 組分別增加了40.15%和1.94%，T2 組分別增加了41.69%和3.05%。Li 等[11]報道指出，豬糞鋸末共堆肥腐熟期Firmicutes的相對豐度降低，而Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria 相對豐度增加，本研究堆肥后Firmicutes相對豐度降低，Bacteroidetes 相對豐度增加與上述報道一致，Actinobacteria 相對豐度降低及Chloroflexi 相對豐度增加與上述報道不一致，這可能與堆肥物料和工藝、添加微生物菌劑、連續(xù)添加糞污、降溫腐熟期某些細菌增殖等有關[12，31]。

圖6 糞污降解過程中細菌群落Top10門和Top35屬水平相對豐度Figure 6 Relative abundance of bacterial community top10 phylum and top35 genus levels during manure degradation

本研究選取相對豐度Top35 的菌屬為細菌群落的代表作熱圖，進行進一步分析。根據(jù)堆肥過程中菌屬水平豐度變化，將其分為兩大類（H、G）。如圖6B所示，Top35 菌屬主要分布在Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria 和Bacteroidetes 門中。G 類除Aquabacterium和Shigella外，其余菌屬均屬于Firmicutes，這些菌屬在堆肥初期和高溫期豐度最大，第12 天后逐漸降低。Clostridium、Mogibacterium、Turicibacter和Bacillaceae_Bacillus等菌屬屬于Firmicutes，堆肥初期和高溫階段豐度較高主要是由于這些菌屬耐高溫，這與Chang 等[12]的研究結果一致。試驗結束時除Succiniclasticum的豐度明顯增加外，Ruminococcus、Coprococcus、Butyrivibrio的豐度變化不明顯，其他菌屬豐度均下降至最低。Shigella和Turicibacter為人類致病菌[32]，堆肥結束時Shigella豐度由0.65%～1.05%下降到0.15%～0.16%，Turicibacter豐度由4.70%～4.90%下降為0.11%～0.17%，可見兩處理均能有效降低其豐度。H 類 分 別 屬 于Proteobacteria、Actinobacteria 和Bacteroidetes，這類菌屬相對豐度隨著堆肥進行逐漸升高，高溫期相對豐度最高，然后逐漸降低，試驗結束時除屬于Proteobacteria 的Steroidobacter和Dyella、Actinobacteria 的Demequina和Acinetobacter、Bacteroidetes 的Ruminofilibacter和Prevotella菌屬相對豐度較第0 天有不同程度增加外，其他菌屬豐度均不同程度降低。Zhou 等[33]指出Corynebacterium是人類致病菌，初始物料中的豐度占比為1.04%～1.39%，堆肥結束時被完全去除?？梢?，堆肥過程可明顯影響細菌群落的結構，尤其是對人類致病菌具有較好的抑制作用。

2.4 ARGs變化的影響因素分析

冗余分析（RDA）用于研究細菌群落、環(huán)境因子和MGEs 與ARGs 之間的關系，本研究對堆肥溫度、pH、細菌群落（基于門的分類）及intI1進行冗余分析。由圖7 可知，RDA 解釋了ARGs 豐度變化的99.27%，其中RDA1 解釋了69.38%、RDA2 解釋了29.89%。選擇變量中，細菌群落可解釋ARGs 變化的70.07%、intI1解釋25.10%、溫度和pH 解釋4.10%，表明堆肥過程中細菌群落、intI1的豐度、溫度及pH 均可影響ARGs 的豐度變化。Wang 等[34]和胡婷[35]研究發(fā)現(xiàn)ARGs 與細菌群落之間存在較強的相關性。如表2 所示，本研究中Firmicutes 與intI1（P＜0.01）、tetW（P＜0.01）、tetG、blaTEM-1、ermQ呈正相關，堆肥后Firmicutes相對豐度降低可解釋intI1、tetW、tetG、blaTEM-1、ermQ豐度的減少。Bacteroidetes、Chloroflexi 與sul1、sul2呈正相關，堆肥結束時Bacteroidetes、Chloroflexi 的豐度較第0 天顯著增加，可解釋sul1、sul2削減效果較差?？梢?，細菌群落是影響堆肥過程中ARGs 豐度變化的主要因素[36]。Zhang 等[37]的研究表明，堆肥過程中可通過降低intI1的豐度抑制其介導的水平基因轉移，從而影響堆肥中ARGs 豐度的變化。本研究中，intI1與tetW（P＜0.01）、blaTEM-1（P＜0.05）、ermQ（P＜0.05）呈顯著正相關，堆肥后T1 和T2 組intI1相對豐度分別降低59.33% 和99.91%，說明異位發(fā)酵床堆肥可能是通過降低intI1的豐度抑制水平基因轉移進而降低ARGs的豐度。

圖7 ARGs、細菌群落、intI1、溫度和pH的冗余分析Figure 7 Redundancy analysis ARGs，bacterial communities，intI1，temperature and pH

表2 基于相對豐度的ARGs、MGEs和細菌菌門之間的Pearson′s相關系數(shù)Table 2 Pearson′s correlation coefficients between ARGs，MGEs and bacteriophages based on their relative abundance

2.5 異位發(fā)酵床降解過程中ARGs和intI1的潛在宿主菌分析

為進一步探討ARGs變化的影響因素，基于Pearson相關系數(shù)，進行網(wǎng)絡分析。從圖8 可以看出，網(wǎng)絡中42 個節(jié)點（包括6 種ARG、intI1和35 個細菌屬）間存在顯著相關性（P＜0.05）。Facklamia、Clostridiaceae_Clostridium和Turicibacter是tetW、ermQ、blaTEM-1的共同潛在宿主菌，Li 等[38]和Zhou 等[33]研究發(fā)現(xiàn)Facklamia、Clostridiaceae_Clostridium和Turicibacter是tetW、ermQ、blaTEM-1的潛在宿主菌，與本研究結果一致，堆肥后這些菌屬相對豐度顯著降低可解釋tetW、ermQ和blaTEM-1相對豐度降低。Epulopiscium、Aquabacterium和Clostridum等菌屬分別為intI1和sul1、tetG、tetW、blaTEM-1、ermQ共同潛在宿主菌，這與Wang 等[39]報道的ARG 和intI1可同時共存在同一細菌中的結果一致，說明intI1和ARGs 可能同時存在于同一細菌中，并可通過同一個細菌傳播。Prevotella是tetG和sul2的潛在宿主菌，Dyella是tetG、sul1、sul2的潛在宿主菌，Hyphomicrobium、Ruminofilibacter和Steroidobacter是sul1和sul2獨有的潛在宿主菌，這與張鑫[40]報道的Ruminofilibacter是sul1和sul2獨有的潛在宿主菌的結果一致，堆肥后這些菌屬的豐度增加，可解釋tetG、sul1和sul2消除效果不理想。Clostridium、Clostridiaceae_Clostridium、Shigella是tetG、tetW和intI1的潛在宿主菌，堆肥結束時T1 和T2 組中這3 種菌屬相對豐度較第0 天分別降低了11.05%、3.00%、0.64%和11.35%、3.23%、1.03%，可解釋T2組tetG、tetW和intI1相對豐度降幅更大。本研究中intI1的潛在宿主菌達22 個，且與多個目標基因有共同潛在宿主菌，如Aquabaterium是sul1、tetG、tetW、blaTEM-1、ermQ和intI1的共同潛在宿主菌，Butyrivbrio是sul2、tetG、tetW、ermQ和intI1的共同潛在宿主菌，說明ARGs 可能通過intI1介導的水平基因轉移在不同宿主菌間轉移和傳播[41]。綜上，糞污異位發(fā)酵床降解過程中可能主要是通過降低ARGs 潛在宿主菌豐度及抑制intI1介導的ARGs 水平基因轉移，從而降低多數(shù)ARGs的豐度。

3 結論

（1）異位發(fā)酵床堆肥過程中翻堆有利于提高堆肥的溫度，延長其高溫期，改變細菌群落結構，顯著降低intI1和ARGs的相對豐度。

（2）細菌群落和intI1的變化是影響ARGs 豐度變化的主要因素。此外，堆肥還能徹底清除或顯著降低人類致病菌的豐度。

（3）奶牛糞污異位發(fā)酵床降解過程中2 d 翻堆1次可有效去除大部分ARGs，降低環(huán)境中ARGs 的傳播風險。