李奕東，劉甜，姚佳，杜旭芳

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指各種急性損傷因素作用下，肝功能相對(duì)穩(wěn)定的慢性肝病病人迅速惡化的肝衰竭綜合征［1］。常見(jiàn)的急性誘因包括乙醇、藥物、病毒性或細(xì)菌感染等。多種因素刺激下先天免疫系統(tǒng)激活引發(fā)炎癥細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)過(guò)度炎癥反應(yīng)，機(jī)體處于全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）狀態(tài)。隨著病情發(fā)展，這種高炎癥狀態(tài)最終破壞了宿主免疫細(xì)胞的防御機(jī)制導(dǎo)致免疫麻痹，使ACLF病人更容易出現(xiàn)繼發(fā)感染。繼發(fā)感染是ACLF病人出現(xiàn)器官功能衰竭和高死亡率的主要原因［2］。因此，深入了解肝衰竭病人免疫功能障礙的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，可為ACLF防治提供新的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。本研究通過(guò)臨床和基礎(chǔ)研究從先天性免疫和獲得性免疫兩個(gè)方面闡述ACLF免疫障礙機(jī)制、監(jiān)測(cè)評(píng)估以及免疫增強(qiáng)的藥物治療，旨在更深入地認(rèn)識(shí)ACLF的免疫功能障礙狀態(tài)及其臨床意義。

1 ACLF先天性免疫功能障礙

先天性免疫是感染后第一道防線(xiàn)，對(duì)各種入侵的病原微生物反應(yīng)迅速。單核/巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、自然殺傷T細(xì)胞（NKT細(xì)胞）都是其組成部分［3］。這些細(xì)胞殺傷、吞噬病原體，隨著疾病持續(xù)，促炎反應(yīng)逐漸向抗炎反應(yīng)傾斜，最終抗炎反應(yīng)占主導(dǎo)地位，各種免疫細(xì)胞被消耗或處于功能耗竭狀態(tài)，其在數(shù)量、功能、表達(dá)狀態(tài)等方面均發(fā)生相應(yīng)改變。

1.1 單核/巨噬細(xì)胞 Kuffer細(xì)胞是肝臟原居的巨噬細(xì)胞，ACLF發(fā)病初，細(xì)菌和病原體相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）從腸道中“溢出”，受損的肝細(xì)胞持續(xù)釋放損傷相關(guān)分子模式（damage-associated molecular pattern，DAMPs），Kuffer細(xì)胞表面受體識(shí)別PAMPs和DAMPs而廣泛活化，啟動(dòng)促炎反應(yīng)，分泌促炎因子，介導(dǎo)肝損傷［3］。被激活的外周血單核細(xì)胞向肝臟組織聚集，同時(shí)骨髓來(lái)源的循環(huán)單核細(xì)胞被激活，產(chǎn)生的細(xì)胞因子及趨化因子釋放到體循環(huán)會(huì)引發(fā)SIRS。然而，長(zhǎng)期暴露于抗原和炎癥信號(hào)中，單核/巨噬細(xì)胞防御機(jī)制被破壞，對(duì)抗原刺激反應(yīng)不充分，抗菌功能受損，逐漸出現(xiàn)類(lèi)似于膿毒癥的免疫麻痹現(xiàn)象［3］。

近年來(lái)，關(guān)于ACLF中單核/巨噬細(xì)胞免疫功能障礙的研究逐步增多。外周血單核細(xì)胞、Kuffer細(xì)胞、模式識(shí)別受體及其補(bǔ)體系統(tǒng)在數(shù)量上缺失，通過(guò)調(diào)節(jié)核因子κB，外周血中單核細(xì)胞表面人類(lèi)白細(xì)胞DR位點(diǎn)抗原（human leukocyte antigen DR，HLADR）表達(dá)減少，先天免疫功能下降。然而，骨髓來(lái)源的單核抑制細(xì)胞數(shù)量不降反增［1］。反復(fù)Toll樣受體（TLR）-2和TLR-4刺激下，循環(huán)中具有免疫抑制作用的髓源單核抑制細(xì)胞（CD14+HLA-DR-Myeloid-derived suppressor cells， CD14+HLA-DR-M-MDSCs）數(shù)量增加［4］，其可抑制T細(xì)胞的增殖，損害先天性和適應(yīng)性免疫，運(yùn)用TLR-3激動(dòng)劑可使M-MDSCs擴(kuò)增并恢復(fù)先天免疫功能。

除了各種先天免疫細(xì)胞數(shù)量上的改變外，Kuffer細(xì)胞表型及分泌功能發(fā)生轉(zhuǎn)變，主要表現(xiàn)為具有抗炎特性的M2表型，釋放一些抗炎因子，如：白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-10、IL-13、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β），發(fā)揮免疫抑制作用，IL-10的升高提示肝衰竭預(yù)后不良［5］。

此外，單核/巨噬細(xì)胞表面受體表達(dá)的改變，對(duì)獲得性免疫細(xì)胞的啟動(dòng)及效應(yīng)產(chǎn)生抑制作用。免疫抑制狀態(tài)下的單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)CD163清道夫受體，抑制T細(xì)胞活化增殖，可溶性CD163具有類(lèi)細(xì)胞因子功能，直接抑制輔助性T淋巴細(xì)胞，表現(xiàn)抗炎特性，表達(dá)水平越高預(yù)示預(yù)后越差［6］。另外，分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑介導(dǎo)外周血單核細(xì)胞膜上Mer受體酪氨酸激酶（Mer receptor tyrosine kinase，MERTK）表達(dá)增加，也是單核/巨噬細(xì)胞功能受損的一種重要機(jī)制，應(yīng)用MERTK抑制劑可恢復(fù)促炎因子的產(chǎn)生，并可能恢復(fù)病人的先天免疫應(yīng)答［7］，成為晚期ACLF病人免疫抑制狀態(tài)的潛在治療靶點(diǎn)，有待臨床進(jìn)一步研究。

單核/巨噬細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄代謝水平上也會(huì)受到影響。ACLF中分離的CD14+CD16-循環(huán)單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄分析顯示，一系列免疫抑制參數(shù)上調(diào)，如：糖酵解途徑中的谷氨酰胺合成代謝（glutamine anabolism，GLUL），抗菌和抗原遞呈機(jī)制受損，單核細(xì)胞的吞噬反應(yīng)和代謝過(guò)程均變得遲鈍。通過(guò)抑制GLUL，M2型單核/巨噬細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)镸1表型，發(fā)揮促炎作用，抵抗機(jī)體免疫抑制［8］。因此，使用谷氨酰胺合成酶抑制劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行代謝重組，可以部分恢復(fù)單核/巨噬細(xì)胞吞噬和促炎能力，改善病人免疫抑制狀態(tài)，為這些病人的靶向治療提供了新的選擇。

針對(duì)ACLF免疫抑制的治療，補(bǔ)充人體血清白蛋白也起到重要作用，低蛋白血癥病人機(jī)體免疫麻痹狀態(tài)嚴(yán)重，感染風(fēng)險(xiǎn)增高，提高人血白蛋白濃度可改善血漿前列腺素（prostaglandin，PG）E2介導(dǎo)的免疫抑制［9］。因此，免疫障礙下的ACLF病人可考慮應(yīng)用。

1.2 DC DCs是主要的抗原呈遞細(xì)胞，主要存在于肝臟組織中，分為髓樣DC和漿性DC兩種。隨著疾病持續(xù)，循環(huán)中DCs大量凋亡致數(shù)量減少，其細(xì)胞表面程序性細(xì)胞死亡蛋白-1配體表達(dá)增加，同時(shí)產(chǎn)生腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和IL-12的能力受損［10］，DC的這種功能損傷可能介導(dǎo)宿主特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答抑制。上述研究主要以循環(huán)DCs為主要研究對(duì)象，對(duì)肝臟DCs的組成及功能研究較少。然而，有人發(fā)現(xiàn)乙肝相關(guān)ACLF病人肝臟組織中，髓樣DC和漿性DC大量積累并被激活，分泌IL-10、TGF-β水平上升，同時(shí)伴隨調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）數(shù)增多，起到局灶免疫抑制作用［11］。粒細(xì)胞刺激因子通過(guò)動(dòng)員DC和T淋巴細(xì)胞進(jìn)入肝臟， 減輕γ干擾素誘導(dǎo)的肝損傷，以此恢復(fù)ACLF病人的免疫功能障礙。

1.3 NK/NKT細(xì)胞 NK/NKT細(xì)胞是一種具有免疫調(diào)節(jié)特性和細(xì)胞毒性的免疫細(xì)胞，與自身免疫性疾病、肝炎和纖維化等多種肝病的肝損害有關(guān)［12］。其中NKT是一種特殊的T細(xì)胞亞群，細(xì)胞表面同時(shí)具有T細(xì)胞受體（TCR）和NK細(xì)胞受體。NK/NKT二者在ACLF的發(fā)病機(jī)制中也起著關(guān)鍵作用。Liu等［13］針對(duì)ACLF、慢性乙型肝炎（CHB）及健康者外周血NK細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)ACLF（16.64±12.32）和CHB（19.16±9.65）病人外周血NK細(xì)胞數(shù)量百分比較健康個(gè)體（21.35±8.81）降低。有人還發(fā)現(xiàn)相比健康對(duì)照組，肝衰竭病人脾臟（4.32%比5.72%，1.68×105比6.01×105）和骨髓中（0.74%比2.27%，7.40×104比5.68×104）的NK細(xì)胞比例和數(shù)量也明顯減少［14］。另一方面，ACLF病人中，具有細(xì)胞毒性CD56dimCD16brightNK細(xì)胞減少，而CD56dimCD16-、CD56brightCD16-NK細(xì)胞增加，NK細(xì)胞毒亞群的變化也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性功能的降低，殺傷作用減弱［13］。NK/NKT在分泌功能上也受到了影響，體內(nèi)高水平的抑炎因子IL-10抑制NK/NKT細(xì)胞分泌γ干擾素和TNF-α的產(chǎn)生［13，15］。同時(shí)NK細(xì)胞上表達(dá)多種激活性和抑制性受體，具體表現(xiàn)為NKG2D分子、NK細(xì)胞蛋白（NKp）30、NKp44、NKp46激活受體升高，CD158a抑制受體增加，而CD158b抑制受體減少［13］。而NKT細(xì)胞表面高表達(dá)T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白3（TIM3）免疫抑制受體［16］。以上描述證明NK/NKT細(xì)胞受體的異常表達(dá)與ACLF病人先天免疫反應(yīng)受損存在關(guān)聯(lián)。不僅如此，抑制NK細(xì)胞中鉀離子通道相關(guān)基因的表達(dá)，封鎖鈉離子和鉀離子通道抑制T細(xì)胞激活，削弱NK細(xì)胞活化［12，17］?？傊?，NK/NKT細(xì)胞數(shù)量的減少、細(xì)胞毒亞群、表面受體的改變以及相關(guān)細(xì)胞因子產(chǎn)生減少、相關(guān)基因改變可能都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒功能下降，削弱機(jī)體對(duì)感染的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫麻痹，導(dǎo)致病情進(jìn)一步惡化［13］。

2 獲得性免疫

肝衰竭的發(fā)病過(guò)程中免疫介導(dǎo)的肝損傷起主要作用，而T淋巴細(xì)胞在清除病毒和壞死肝細(xì)胞中起到重要作用。免疫應(yīng)答異常和免疫失衡是ACLF的重要發(fā)病機(jī)制之一。隨著ACLF進(jìn)展，獲得性免疫功能受損，T細(xì)胞功能障礙，T細(xì)胞逐漸耗盡，進(jìn)入一種“衰竭”狀態(tài)，具體表現(xiàn)為外周血T細(xì)胞數(shù)量減少、細(xì)胞活性降低、增殖分泌功能障礙、T淋巴細(xì)胞反應(yīng)性降低或無(wú)反應(yīng)性［18］。

2.1 CD8+T淋巴細(xì)胞 在數(shù)量上，ACLF病人中外周血CD8+T淋巴細(xì)胞呈進(jìn)行性下降，尤其是活化的外周血CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯降低［19］。此外，Wang等［20］針對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞百分比與終末期肝病模型（model for end-stage liver disease， MELD）評(píng)分之間關(guān)系進(jìn)行了疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后分析，研究顯示ACLF病人外周血T淋巴細(xì)胞比例明顯低于健康對(duì)照組，提示病人機(jī)體此時(shí)處于免疫衰竭狀態(tài)。同時(shí)MELD評(píng)分與外周血T淋巴細(xì)胞百分比存在明顯負(fù)性相關(guān)，治療前狀態(tài)下，淋巴細(xì)胞百分比越低，MELD評(píng)分越高。經(jīng)4周綜合治療后，T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少趨勢(shì)較慢，疾病進(jìn)展緩慢，預(yù)后較好。因此，針對(duì)外周血T淋巴細(xì)胞的免疫治療也可能為解除ACLF免疫抑制提供可能性。

CD8+T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)改變也是肝衰竭免疫抑制狀態(tài)的一種特征性表現(xiàn)。ACLF病人中，活性降低的CD8+T淋巴細(xì)胞其表面激活標(biāo)志物（CD69、CD38和穿孔素）表達(dá)下降［21］。而在ACLF病人免疫抑制狀態(tài)下，CD8+T細(xì)胞上的共刺激［如CD40L，誘導(dǎo)性共刺激分子（ICOS），OX40，CD69，CD38，CD95，糖皮質(zhì)類(lèi)固醇誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體（GITR），TIM-1］和抑制性免疫檢查點(diǎn)（如PD1，KLRG1，PDPN，PROCR，TIM3，CTLA4，TIGIT）均表達(dá)上調(diào)［1］。除此之外，NKG2A也是表達(dá)于NK細(xì)胞和CD8+T淋巴細(xì)胞的抑制性受體，在維持這些免疫細(xì)胞的功能和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用，ACLF病人中，CD8+T細(xì)胞上NKG2A表達(dá)上調(diào)，同時(shí)NK細(xì)胞上激活性受體NKG2D表達(dá)下調(diào)， 兩種受體之間的失衡可能加速乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)ACLF的進(jìn)展［22］，促進(jìn)免疫功能障礙。胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率群盒蛋白通過(guò)上調(diào)各種抑制受體的表達(dá)，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞衰竭和功能失調(diào)表型引起免疫功能麻痹［23］。

在功能上，ACLF病人CD8+T淋巴細(xì)胞受刺激后的分泌能力明顯下降，表現(xiàn)為無(wú)法有效產(chǎn)生IL-2，IL-6，IL-8和γ干擾素和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子［5］。除此之外，其抑炎因子產(chǎn)生增多，如IL-35，IL-10［3］。其中IL-10是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT-3）誘導(dǎo)細(xì)胞因子，可減弱T細(xì)胞活化，阻斷IL-10產(chǎn)生可以預(yù)防并逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭［5］。近兩年新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子IL-35，既可抑制抗原非特異性細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞的活性，又可抑制細(xì)胞因子介導(dǎo)的靶細(xì)胞死亡。IL-35刺激下，ACLF病人外周血CD8+T細(xì)胞呈現(xiàn)出耗竭表型，表現(xiàn)為程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1，PD-1）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4）、淋巴細(xì)胞活化基因-3上調(diào)，穿孔素、顆粒酶B、Fas配體下調(diào)，抑制細(xì)胞毒性和腫瘤壞死因子-γ的產(chǎn)生。因此，IL-35可能是改善ACLF免疫抑制治療靶點(diǎn)之一［24］，有待進(jìn)一步研究。

另外，除了細(xì)胞因子參與CD8+T細(xì)胞耗竭調(diào)控外，其他可溶性介質(zhì)也參與其中。前列腺素E受體2（prostaglandin E receptor 2，EP2）是一種免疫平衡調(diào)節(jié)分子。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，PGE2具有免疫抑制作用，ACLF病人CD8+T細(xì)胞表面EP2表達(dá)降低，PGE2水平顯著升高［9］，使機(jī)體處于免疫低反應(yīng)狀態(tài)，與繼發(fā)感染易感性相關(guān)［25］。不僅如此，EP2也在先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮抑制作用，EP2選擇性激動(dòng)劑可減少外周血單個(gè)核細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生。因此，PGE2及EP2的改變可抑制ACLF病人先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞對(duì)LPS或大腸桿菌的過(guò)度炎癥反應(yīng)［9］。輸注白蛋白治療后，將人血白蛋白水平升高至30 g/L以上，通過(guò)結(jié)合和滅活PGE2逆轉(zhuǎn)了免疫功能障礙［26］。EP2可能成為治療ACLF免疫抑制的新潛在靶標(biāo)。

以上，從細(xì)胞計(jì)數(shù)、分泌功能、表面標(biāo)志物表達(dá)情況及血清中其他可溶性介質(zhì)含量等方面綜述了免疫失調(diào)過(guò)程中CD8+T淋巴細(xì)胞免疫狀態(tài)，提示CD8+T淋巴細(xì)胞參與了ACLF的免疫抑制過(guò)程。

2.2 CD4+T淋巴細(xì)胞（調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、輔助性T淋巴細(xì)胞） Treg和輔助性T淋巴細(xì)胞17（helper T cell 17，Th17）具有共同的起源，都來(lái)源于初始T細(xì)胞。IL-6可以決定初始T淋巴細(xì)胞分化途徑的方向，當(dāng)IL-6不存在時(shí)分化趨向具有免疫抑制作用的Treg子集；在IL-6存在的情況下分化趨向介導(dǎo)炎性反應(yīng)的Th17子集，兩種細(xì)胞作用相反，在分化過(guò)程中存在一定的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系并處于動(dòng)態(tài)平衡中［27］。肝衰竭進(jìn)展晚期，Th17細(xì)胞數(shù)量降低，促炎細(xì)胞因子減少，促炎功能減弱，同時(shí)發(fā)揮免疫抑制作用的Treg細(xì)胞數(shù)量上升明顯［27］。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白抑制劑作為負(fù)調(diào)控因子可抑制IL-6/STAT3信號(hào)通路［28］，在ACLF過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)CD4+CD2 5+Treg的增殖，抑制Th17的增長(zhǎng)，這說(shuō)明了Th17細(xì)胞與CD4+CD25+Treg細(xì)胞之間存在免疫失衡，二者動(dòng)態(tài)變化共同介導(dǎo)肝衰竭免疫麻痹［29］。通過(guò)恢復(fù)Th17/Treg免疫平衡，可以阻止本病的進(jìn)展［27］。

除了數(shù)量上的變化，Treg細(xì)胞還可通過(guò)表面標(biāo)志物改變以及分泌功能障礙來(lái)發(fā)揮免疫抑制作用。細(xì)胞高表達(dá)CTLA-4和PD-1，通過(guò)傳遞抑制信號(hào)而抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活化［30］，還可抑制DC活化以及影響細(xì)胞因子分泌，如IL-10產(chǎn)生增多。表達(dá)不同的表面分子的Treg細(xì)胞亞群，其作用也不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，CTLA-4、HLA-DR、CD45RO、Ki-67等表面標(biāo)志物在CD39+FoxP3+Treg細(xì)胞的表達(dá)明顯高于CD39-FoxP3+Treg，表達(dá)CD39+的Treg細(xì)胞抑制細(xì)胞增殖功能明顯增強(qiáng)，且能明顯抑制外周血單個(gè)核細(xì)胞γ干擾素的分泌，介導(dǎo)肝衰竭免疫麻痹［29］。

2.3 黏膜相關(guān)恒定T 細(xì)胞（MAIT） MAIT是對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生免疫應(yīng)答的豐富T細(xì)胞亞群，其特征是含有不變TCR鏈，表現(xiàn)為天然殺傷細(xì)胞標(biāo)志物CD161的高表達(dá)。在肝功能衰竭的中晚期，可能由于長(zhǎng)期的慢性進(jìn)程，循環(huán)中MAIT細(xì)胞逐漸衰竭，數(shù)量減少，機(jī)體免疫反應(yīng)功能失調(diào)，進(jìn)入免疫抑制狀態(tài)。病毒持續(xù)存在，病情加重，機(jī)會(huì)性感染的風(fēng)險(xiǎn)增加都是可能造成的嚴(yán)重后果。經(jīng)治療后，肝衰竭改善狀態(tài)下，循環(huán)MAIT細(xì)胞的數(shù)量可部分恢復(fù)，表明循環(huán)MAIT細(xì)胞是預(yù)測(cè)HBV相關(guān)肝衰竭預(yù)后的主要標(biāo)志物，死亡病人的MAIT細(xì)胞較存活病人明顯減少，且MAIT細(xì)胞的數(shù)量越高，病人存活率越高。因此，恢復(fù)MAIT細(xì)胞數(shù)量可能成為治療肝衰竭免疫抑制的良好手段［31］。

3 總結(jié)

總之，晚期ACLF病人體內(nèi)存在嚴(yán)重的免疫問(wèn)題，代償性抗炎反應(yīng)缺陷，固有和適應(yīng)性免疫衰竭和失調(diào)，隨之而來(lái)的功能性免疫癱瘓，多種免疫細(xì)胞在數(shù)量、增殖活性以及分泌能力上都受到了影響。然而，嚴(yán)重的免疫紊亂在ACLF獨(dú)特的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，可導(dǎo)致器官衰竭、更高的感染風(fēng)險(xiǎn)和ACLF進(jìn)一步進(jìn)展。因此，防止這些免疫紊亂的發(fā)展是ACLF新的治療策略。