馮 敏，袁 爍，黃艷茜，賴裕玲，曾富玲，鄧高丕*

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405）

卵巢癌是女性中最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌［1］。由于卵巢癌在早期缺乏特異性癥狀和有效的篩查策略，患者多在晚期診斷，因此預(yù)后較差。僅有15%卵巢癌患者能在早期被診斷，而5 年生存率為47%［2］。目前，卵巢癌的一線治療方法為手術(shù)和鉑類及紫杉醇類的藥物化療［3-5］。但化療有諸多不良反應(yīng)，如脫發(fā)、惡心、嘔吐和骨髓抑制等［6］。雖然靶向療法在卵巢癌的治療中取得了重大進(jìn)展，但是其費(fèi)用昂貴且有高血壓、蛋白尿、血栓等并發(fā)癥［7］。

桂枝茯苓丸是婦科經(jīng)典方劑，由桂枝、茯苓、丹皮、芍藥、桃仁組成，在臨床和研究中被用于治療原發(fā)性痛經(jīng)、圍絕經(jīng)潮熱、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮肌瘤、多囊卵巢綜合征、乳腺癌、卵巢癌等［8-15］。研究證實(shí)，桂枝茯苓丸在治療卵巢癌中顯示出安全性和有效性，并抑制了卵巢癌中的腫瘤進(jìn)展。同時(shí)，桂枝茯苓丸還可以改善卵巢癌患者的生活質(zhì)量［16］。

中藥配方是典型的“多組分、多靶點(diǎn)、多途徑” 復(fù)方，在治療卵巢癌中具有很大的優(yōu)勢(shì)。但是，桂枝茯苓丸治療卵巢癌的活性成分、特定靶標(biāo)和分子機(jī)制尚未明確。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法，探究桂枝茯苓丸治療卵巢癌的有效成分、作用靶點(diǎn)及通路，為后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1.1 桂枝茯苓丸活性成分的篩選 通過檢索TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／tcmspw.com／tcmsp.php） 篩選桂枝茯苓丸的活性成分，篩選條件為口服生物利用度（oral bioavailability，OB） ≥30%及類藥性（drug likeness，DL） ≥0.18。

1.1.2 桂枝茯苓丸活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 根據(jù)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取的桂枝茯苓丸活性成分，利用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）得到3D 分子結(jié)構(gòu)文件（.SDF） 和SMILE 結(jié)構(gòu)，通過TCMSP、SwissTargetPrediction（http：／／www.swisstargetprediction.ch／） 和 STITCH（http：／／stitch.embl.de／） 平臺(tái)得到桂枝茯苓丸活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)。最后，使用UniProt 知識(shí)數(shù)據(jù)庫(kù) （www.uniprot.org） 將相應(yīng)靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)化為基因名稱。

1.1.3 卵巢癌疾病靶點(diǎn)的篩選 以“ovarian cancer” 為關(guān)鍵詞檢索 GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù) （http：／／www.genecards.org／） 和 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù) （https：／／www.disgenet.org／），收集卵巢癌的疾病靶點(diǎn)。

1.1.4 桂枝茯苓丸與卵巢癌共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI） 的構(gòu)建 通過R 語言將獲得的活性成分靶點(diǎn)與卵巢癌疾病靶點(diǎn)相交得到交集靶點(diǎn)和Venn 圖，將交集靶點(diǎn)通過STRING （https：／／string-db.org／） 平臺(tái)得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI） 網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建條件為種屬人，最小互作分?jǐn)?shù)0.4。將所得網(wǎng)絡(luò)通過R 語言繪制為蛋白互作網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)條形圖。

1.1.5 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 選取蛋白互作網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)條形圖中前20 個(gè)重要靶點(diǎn)及相應(yīng)活性成分，通過Cytoscape 3.7.1 軟件 （www.cytoscape.org／） 構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算出的連接度（Degree）、緊密中心度（Closeness Centrality） 得到核心活性成分及核心靶點(diǎn)。

1.1.6 GO 功能和KEGG 通路富集分析 將重要靶點(diǎn)通過DAVID （https：／／david.ncifcrf.gov／） 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO） 功能注釋和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，篩選條件為P＜0.05。然后利用Omicshare平臺(tái)對(duì)GO 與KEGG 富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

榜單中較為明顯的變化是，美國(guó)頁巖油氣獨(dú)立生產(chǎn)商有8 家進(jìn)入榜單。加拿大兩家油砂開采商排名也有所提高。榜單中，國(guó)家石油公司有30家，占比60%。

1.1.7 核心活性成分及核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 將獲得的核心成分作為配體及核心靶點(diǎn)作為受體進(jìn)行分子對(duì)接，首先通過PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：／／www.rcsb.org／） 下載核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)，在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核心成分蛋白3D結(jié)構(gòu)，利用AutoDock Tools 對(duì)上述受體和配體進(jìn)行常規(guī)處理并進(jìn)行分子對(duì)接，以自由結(jié)合能的數(shù)值為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，選取最優(yōu)結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 試劑與藥物 桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁均購(gòu)自廣東省康美藥業(yè)有限公司，取桂枝、茯苓、牡丹皮、赤芍、桃仁各15 g，加150 mL 蒸餾水煎煮60 min 后過濾，取濾液加熱濃縮至生藥量1.5 g／mL，于4 ℃保存?zhèn)溆?。?xì)胞增殖毒性檢測(cè)（CCK-8） 試劑（日本東仁公司，批號(hào)NU680）；胎牛血清、RPMI Medium 1640 培養(yǎng)基 （美國(guó)Gibco 公司，批號(hào)16000-044、8119080）；Annexin Ⅴ細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)C1062M、51319190513、10719190418）；PI3K 多克隆抗體、GAPDH 單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)10016961、00083125）；p-PI3K 多克隆抗體、Akt 單克隆抗體、p-Akt 單克隆抗體、抗兔IgG-HRP 抗體（美國(guó)CST 公司，貨號(hào)17366S、4691、4060、7074）；Bax 單克隆抗體、Bcl-2 單克隆抗體 （英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)ab32503、ab32124）。

1.2.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)雌性SD 大鼠20 只，6～8 周齡，體質(zhì)量220～300 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)44007200068190］，飼養(yǎng)環(huán)境恒溫、恒濕，采用12 h／12 h 光／暗周期，大鼠自由飲水、攝食，實(shí)驗(yàn)開始前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.2.3 含藥血清制備 大鼠隨機(jī)分為空白組及桂枝茯苓丸組，每組10 只，桂枝茯苓丸組灌胃給予1.5 g／mL 桂枝茯苓丸藥液（10 g／kg），空白組灌胃給予等體積生理鹽水，每天2 次，連續(xù)5 d。末次給藥0.5 h 后，于大鼠腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置4 h，離心后收集血清分裝至1 mL 離心管中，于-80 ℃保存。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌SKOV3 細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC），使用含有10%FBS、100 μ／mL 青霉素和鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.5 細(xì)胞活力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3 細(xì)胞，以每孔1.0×104個(gè)細(xì)胞的密度接種到96 孔板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，之后加入不同濃度的空白血清及含藥血清，分組為對(duì)照組、10%空白血清組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)6、12、24 h 后，加入10 μL CCK8 試劑，孵育3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定各組450 nm 波長(zhǎng)處吸光度值，篩選出適宜的含藥血清濃度及作用時(shí)間。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SKOV3細(xì)胞，以每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后加入含藥血清及空白血清，分組為對(duì)照組、10%空白血清組、10%含藥血清組，干預(yù)24 h 后收集細(xì)胞，重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取含1×106個(gè)細(xì)胞的懸液，1 000×g離心3 min，加入195 μL Buffer 試劑重懸，避光加入5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI，室溫孵育15 min，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) SKOV3 細(xì)胞按“1.2.6” 項(xiàng)下方法分組、給藥，藥物干預(yù)24 h 后加入細(xì)胞裂解液60 μL，冰上裂解30 min，12 000 r／min 離心15 min，取上清液采用BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，蛋白煮沸變性后上樣、電泳，將目的條帶電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，快速封閉液室溫封閉15 min，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜3 次，二抗室溫孵育1 h，經(jīng)ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，置于凝膠成像系統(tǒng)中成像。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 及GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到桂枝茯苓丸85 種活性成分，其中桂枝7種，茯苓15 種，牡丹皮11 種，赤芍有29 種和桃仁23 種，活性成分具體見表1。根據(jù)所得到的85 種成分，提交至TCMSP、SwissTargetPrediction 和STITCH 平臺(tái)得到桂枝茯苓丸活性成分相關(guān)的476 個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)項(xiàng)目后，共得到203 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。

表1 桂枝茯苓丸活性成分信息表

2.2 卵巢癌疾病靶點(diǎn)篩選 使用GeneCards 和DisGeNET 疾病數(shù)據(jù)庫(kù)篩選得到117 個(gè)卵巢癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)。利用R 語言對(duì)桂枝茯苓丸活性成分的203 個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)及卵巢癌疾病相關(guān)的117 個(gè)靶點(diǎn)取交集，得到23 個(gè)共同靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖，見圖1。

圖1 桂枝茯苓丸-卵巢癌共同靶點(diǎn)

2.3 桂枝茯苓丸與卵巢癌共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）建立 將23 個(gè)共同靶點(diǎn)遞交至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），該網(wǎng)絡(luò)由23 個(gè)節(jié)點(diǎn)和167 條邊組成。在PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中，節(jié)點(diǎn)和邊緣分別代表蛋白質(zhì)／基因靶點(diǎn)及其相互作用。在隨機(jī)選擇23 個(gè)節(jié)點(diǎn)的情況下，獲取的PPI 預(yù)期邊數(shù)為56，平均局部聚類系數(shù)為0.829，PPIN 富集的統(tǒng)計(jì)值為（＜1.0×10-16），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)PPI 圖中的節(jié)點(diǎn)程度利用R 語言得到蛋白互作網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)條形圖，見圖3。

圖2 桂枝茯苓丸與卵巢癌共同靶點(diǎn)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)條形圖

2.4 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)建立 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)如圖4 所示，桂枝茯苓丸對(duì)卵巢癌的治療作用與9 種活性成分和20 個(gè)靶點(diǎn)相關(guān)。在9 種活性成分中，槲皮素連接靶點(diǎn)數(shù)最多，共有18 個(gè)靶點(diǎn)與其相接，因此，槲皮素可能為桂枝茯苓丸治療卵巢癌的關(guān)鍵活性成分。在20 個(gè)靶點(diǎn)中ESR1 與6 種活性成分相關(guān)，ESR1可能為桂枝茯苓丸治療卵巢癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)。疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)如圖5 所示，其中綠色節(jié)點(diǎn)代表疾病，粉紅色節(jié)點(diǎn)代表藥物，黃色節(jié)點(diǎn)代表活性成分，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)。通過連接度、緊密中心度來分析疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣?，可知在這9 種活性成分中，有2 種活性成分的連接度和緊密度中心度高于平均連接度和平均緊密度中心度，包括槲皮素 （連接度38，緊密度中心度0.576）、鞣花酸（連接度23，緊密度中心度0.507）。在20個(gè)靶點(diǎn)中，網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣黠@示EGFR （連接度6，緊密度中心度0.447）、ESR1 （連接度12，緊密度中心度0.486）、VEGFA （連接度6，緊密度中心度0.459）、AR （連接度8，緊密度中心度0.472）、CASP8 （連接度8，緊密度中心度0.459）、IGF2 （連接度6，緊密度中心度0.459）、Akt1（連接度6，緊密度中心度0.459） 是核心靶點(diǎn)。

圖4 活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖5 疾病-藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO 和KEGG 富集分析 GO 富集分析是根據(jù)基因的功能對(duì)其進(jìn)行分類的一種分析方法，可分為生物過程（BP）、分子功能（MF） 和細(xì)胞組成（CC）。本研究BP 主要涉及ERBB2 信號(hào)通路、上皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞對(duì)胰島素刺激反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞對(duì)表皮生長(zhǎng)因子刺激反應(yīng)、凋亡負(fù)反饋等，見圖6A。CC 主要涉及核漿、蛋白質(zhì)復(fù)合體、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、線粒體等，見圖6B。MF 主要涉及蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、ATP 結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合等，見圖6C。

圖6 GO 功能富集分析

KEGG 富集分析共獲得了26 條相關(guān)途徑，其中主要涉及腫瘤的蛋白聚糖、腫瘤碳代謝，局部黏附、PI3K-Akt 信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、泌乳素信號(hào)通路等，具體見圖7。

圖7 KEGG 通路富集分析

2.6 核心活性成分及核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 將核心活性成分槲皮素、鞣花酸和核心靶點(diǎn)分子ESR1、AR、EGFR、CASP8、VEGFA 進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果見表2。文獻(xiàn)研究認(rèn)為，若結(jié)合能＜0，表明配體和受體能自發(fā)結(jié)合；若結(jié)合能＜-4.25 kJ／mol 表明配體與受體有一定的結(jié)合活性；＜-5.0 kJ／mol表明受體和配體有較好的結(jié)合活性；＜-7.0 kJ／mol 表明配體和受體有強(qiáng)烈的結(jié)合活性［17］?；钚猿煞珠纹に嘏cESR1、AR、EGFR、CASP8 有較低的結(jié)合能，因此結(jié)合活性好；活性成分鞣花酸與VEGFA 有較低的結(jié)合能，結(jié)合活性好，具體分子對(duì)接結(jié)合模式見圖8。

圖8 桂枝茯苓丸核心活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

表2 核心活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能預(yù)測(cè)表（kJ／mol）

2.7 桂枝茯苓丸對(duì)SKOV3 細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組比較，給藥干預(yù)24 h 后，10%空白血清組細(xì)胞活力無明顯變化（P＞0.05），不同濃度桂枝茯苓丸含藥血清組SKOV3細(xì)胞均受到抑制（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見圖9A。10%、15%含藥血清在6、12、24 h 對(duì)SKOV3 細(xì)胞均有不同程度的抑制作用（P＜0.05），且呈時(shí)間依賴性，見圖9B。10%含藥血清作用于SKOV3 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞存活率為63.23%，抑制作用較強(qiáng)，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用此濃度及時(shí)間。

圖9 桂枝茯苓丸對(duì)SKOV3 細(xì)胞增殖活力的影響

2.8 桂枝茯苓丸對(duì)SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響 如圖10、表3所示，與對(duì)照組比較，10% 空白血清組細(xì)胞凋亡率無明顯變化（P＞0.05）；與對(duì)照組和10% 空白血清組比較，10%含藥血清組細(xì)胞凋亡率均升高（P＜0.05），且凋亡主要以晚期凋亡為主。

圖10 各組SKOV3 細(xì)胞凋亡情況

表3 桂枝茯苓丸對(duì)SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）

表3 桂枝茯苓丸對(duì)SKOV3 細(xì)胞凋亡的影響（±s，n＝3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與空白血清組相比，＃P＜0.05。

組別細(xì)胞凋亡率／%對(duì)照組6.65±0.43 10%空白血清組7.43±0.52 10%含藥血清組34.20±1.90*＃

2.9 桂枝茯苓丸對(duì)SKOV3 細(xì)胞凋亡蛋白及PI3K／Akt 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 如圖11、表4 所示，與對(duì)照組比較，10%空白血清組細(xì)胞p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)無明顯變化（P＜0.05）；與對(duì)照組和10% 空白血清組比較，10%含藥血清組細(xì)胞p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt、Bax 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Bax 表達(dá)升高（P＜0.05）。

圖11 各組SKOV3 細(xì)胞PI3K、Akt、Bax、Bcl-2 蛋白條帶圖

表4 桂枝茯苓丸對(duì)SKOV3 細(xì)胞凋亡蛋白及PI3K／Akt 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

表4 桂枝茯苓丸對(duì)SKOV3 細(xì)胞凋亡蛋白及PI3K／Akt 信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與10%空白血清組比較，＃P＜0.05。

組別p-PI3K／PI3Kp-Akt／AktBaxBcl-2對(duì)照組0.92±0.041.01±0.070.96±0.021.55±0.10 10%空白血清組0.88±0.020.95±0.081.01±0.061.46±0.06 10%含藥血清組0.33±0.01*＃0.49±0.20*＃1.27±0.11*＃0.68±0.07*＃

3 討論

卵巢癌死亡率位居?jì)D科腫瘤之首，嚴(yán)重威脅了女性的生命健康［18］。目前，桂枝茯苓丸對(duì)卵巢癌的臨床療效已獲得廣泛認(rèn)可，在強(qiáng)化腫瘤控制效果、提高免疫力、減少化療不良反應(yīng)等方面具有優(yōu)越性［19-20］。但是桂枝茯苓丸治療卵巢癌的機(jī)制目前尚不明確，故本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)來闡明桂枝茯苓丸對(duì)卵巢癌的治療機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)槲皮素和鞣花酸的連接度要比其他活性成分高，有可能是桂枝茯苓丸治療卵巢癌的核心成分。鞣花酸是一種天然的多酚化合物，具有很強(qiáng)的抗癌作用［21］。據(jù)報(bào)道，鞣花酸能抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和遷移，降低基質(zhì)MMP2 和MMP9 表達(dá)［22］。鞣花酸還可改善順鉑誘導(dǎo)的腎小管擴(kuò)張、壞死、退行性變等病理改變［23］。槲皮素是一種類黃酮化合物，目前已證明合理劑量的槲皮素具有抗炎、抗氧化劑、抗癌作用等［24］。在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)靜脈注射槲皮素不僅能抗腫瘤且具有良好的安全性［25］。本研究還發(fā)現(xiàn)有7 個(gè)靶點(diǎn)在活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中連接度大于4.5 （平均連接度），分別為 ESR1、AR、EGFR、CASP8、VEGFA、IGF2、Akt1。ESR1 是雌激素受體α （ERα） 的編碼基因，其甲基化會(huì)影響卵巢癌的發(fā)展，并可能在卵巢癌患者的預(yù)后中發(fā)揮作用［26］。AR是編碼雄激素受體的基因，在卵巢癌中AR基因表達(dá)上調(diào)［27］，AR 信號(hào)通路已被證明可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲［28-29］。EGFR 是一種跨膜糖蛋白，是酪氨酸激酶受體ErbB 家族成員之一，EGFR 參與了腫瘤啟動(dòng)、血管生成和轉(zhuǎn)移等過程［30］。CASP8 基因位于人類染色體2q33.1 上，是一種啟動(dòng)外部凋亡途徑的半胱氨酸蛋白酶，其高表達(dá)與卵巢癌預(yù)后不良和進(jìn)展相關(guān)［31］。VEGFA 是最有效的血管生成因子，在正常和癌癥組織中均可刺激干細(xì)胞樣細(xì)胞，它在卵巢癌中過表達(dá)，誘導(dǎo)DNMT3A 蛋白上調(diào)，介導(dǎo)了卵巢癌中干細(xì)胞樣細(xì)胞的擴(kuò)張［32］。IGF-2 是一種小型多肽配體，與癌癥的發(fā)展、進(jìn)展和化療反應(yīng)有關(guān)［33］。Akt1 屬于絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶家族，在Akt 基因家族中，Akt1 在細(xì)胞生存、分化和代謝中發(fā)揮重要作用，Akt1 的E17K 突變是一種致癌突變，這種突變主要發(fā)生在卵巢癌中［34］。

GO 富集分析結(jié)果提示20 個(gè)靶點(diǎn)主要參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和分化、蛋白磷酸化等過程。細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)異常的細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致許多人類疾病，尤其是癌癥［35］。而細(xì)胞凋亡在預(yù)防癌癥發(fā)生中起著重要作用［36］。Bcl-2 通常被認(rèn)為是抗凋亡相關(guān)蛋白，其過表達(dá)已被確定為一些癌癥的原因［37］。不受控制的細(xì)胞增殖是癌癥的一個(gè)特征，在卵巢癌中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STATs） 將信號(hào)從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞核，在控制細(xì)胞增殖和分化方面發(fā)揮基礎(chǔ)性作用［38］。腫瘤發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的過程，lncRNA 表現(xiàn)出多種功能，例如ANRIL 能在卵巢癌細(xì)胞系過表達(dá)和影響細(xì)胞增殖［39］。有報(bào)道稱，HOST2在卵巢癌中過表達(dá)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移［40］。多種分子的磷酸化與腫瘤發(fā)展相關(guān)，如Akt、ERK1 和ERK2 的磷酸化與腫瘤密切相關(guān)［41］。研究表明p53 蛋白在絲氨酸15 位點(diǎn)磷酸化（Ser15） 和絲氨酸20 位點(diǎn)磷酸化（Ser20） 決定腫瘤細(xì)胞的凋亡活性［42］。

KEGG 通路分析結(jié)果表明20 個(gè)靶點(diǎn)主要參與26 條通路，這些信號(hào)通路可能是桂枝茯苓丸治療卵巢癌的機(jī)制。腫瘤蛋白聚糖、腫瘤中心碳代謝、局灶性粘附、PI3K／Akt信號(hào)通路、ErbB 信號(hào)通路是富集程度最高的5 條通路。蛋白聚糖是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，它們?cè)谛纬赡[瘤生長(zhǎng)的臨時(shí)基質(zhì)中發(fā)揮重要作用，影響細(xì)胞-細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)間的相互作用和腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)［43］。細(xì)胞能量代謝失調(diào)是癌癥的一個(gè)標(biāo)志［44］。丙氨酸、精氨酸、谷氨酸和天冬酰胺與癌癥的中心碳代謝有關(guān)［45］。既往研究表明，在卵巢癌中二甲雙胍和天冬酰胺影響了葡萄糖進(jìn)入線粒體的能力［46］。粘附局灶激酶（FAK） 在粘附局灶動(dòng)力學(xué)調(diào)控中具有重要作用［47］。在卵巢癌中，F(xiàn)AK 調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的遷移和侵襲［48］。眾所周知，PI3K／Akt 通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)、生存和代謝以及血管生成等方面發(fā)揮重要作用［49］。近70%的卵巢癌過度激活了PI3K／Akt 通路［50］。因此，PI3K 信號(hào)級(jí)聯(lián)異?？赡苁侵委熉殉舶┑囊粋€(gè)潛在靶點(diǎn)［51］。ERBB 信號(hào)通路參與多種人類癌癥，大約20%～30% 的卵巢癌存在ErbB2、ErbB3 的過表達(dá)［52-53］。

本研究重點(diǎn)驗(yàn)證了桂枝茯苓丸通過抑制PI3K／Akt 通路誘導(dǎo)SKOV3 細(xì)胞凋亡。研究報(bào)道，50%以上的腫瘤細(xì)胞存在凋亡缺陷，可以通過多種途徑逃避凋亡［54］。因此，誘導(dǎo)凋亡是諸多化療藥物治療腫瘤的作用機(jī)制，而且許多中藥活性成分也通過抑制抗凋亡蛋白達(dá)到相同目的［55］。在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過程中，PI3K／Akt 信號(hào)通路異常激活，PI3KCA 基因作為PI3K 的催化亞基的編碼基因，在80%的早期卵巢癌中發(fā)生了突變，從而引起了PI3K 的活化，Akt是PI3K 下游的重要靶點(diǎn)，Akt 磷酸化抑制或激活細(xì)胞的分化、增殖及凋亡等過程［56-58］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桂枝茯苓丸能下調(diào)SKOV3 細(xì)胞p-PI3K／PI3K、p-Akt／Akt 表達(dá)，證實(shí)桂枝茯苓丸能抑制PI3K／Akt 信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，桂枝茯苓丸促進(jìn)了SKOV3 細(xì)胞的凋亡，提示桂枝茯苓丸通過抑制PI3K／Akt 信號(hào)通路來促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞凋亡，抑制卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，桂枝茯苓丸治療卵巢癌的活性成分可能為槲皮素和鞣花酸等，這些活性成分作用于ESR1、AR、EGFR、CASP8、VEGFA、IGF2、Akt1 等靶點(diǎn)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、PI3K／Akt 信號(hào)通路等。體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證桂枝茯苓丸可能通過抑制PI3K／Akt 通路來促進(jìn)SKOV3 細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗腫瘤的作用。本研究為桂枝茯苓丸治療卵巢癌的作用機(jī)制提供了參考，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。