連敏 王勇

維生素C普遍存在于植物體內(nèi)，在植物的多個(gè)生理代謝活動(dòng)中發(fā)揮著非常重要的作用。在對(duì)植物的研究中發(fā)現(xiàn)，植物體內(nèi)維生素C含量越高，其抗逆性越強(qiáng)。同時(shí)，維生素C具有抗氧化、防止衰老等功效。但是，人類本身缺少維生素C，人體內(nèi)生物合成代謝途徑中的一種關(guān)鍵酶無(wú)法合成人體所需的維生素C，因此，人們身體所需的維生素C只能從新鮮的水果或蔬菜中獲取。 蘋果富含維生素C、果膠、有機(jī)酸、膳食纖維和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是老少皆宜的大眾水果。鑒于蘋果產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展及維生素C對(duì)動(dòng)植物必不可少的作用，篩選蘋果中維生素C含量測(cè)定方法就顯得尤為重要。

維生素C具有氧化性和還原性，在蘋果果實(shí)中維生素C具有很強(qiáng)的還原性，蘋果切開后，維生素C在空氣中很不穩(wěn)定，容易氧化。維生素C的檢測(cè)方法有很多，如滴定法、熒光分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法等，本文對(duì)這幾種常用的檢測(cè)方法進(jìn)行比較分析，篩選出一種適合蘋果維生素C含量測(cè)定的方法。

一、維生素C測(cè)定方法

（一）滴定法測(cè)定維生素C

滴定法測(cè)定蘋果中維生素C所用藥品和儀器均較少，操作過程需要對(duì)每個(gè)蘋果樣品進(jìn)行過濾后滴定，比較費(fèi)時(shí)，維生素C在空氣中暴露時(shí)間久了容易被氧化，測(cè)定的結(jié)果易偏低。該方法可以對(duì)蘋果中維生素C中含量進(jìn)行簡(jiǎn)單的相對(duì)比較，不能準(zhǔn)確測(cè)定蘋果中維生素C的含量。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，再將樣品融入2%的草酸中，充分混勻避光放置30 min后過濾，濾液便可進(jìn)行滴定。樣品設(shè)置3次重復(fù)。由于維生素C具有還原性，藍(lán)色染料2，6-二氯酚靛酚具有氧化性，并且該染料在酸性溶液中呈紅色，在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色。滴定過程中當(dāng)樣品溶液中維生素C被完全氧化后該染料在草酸溶液中便會(huì)呈現(xiàn)出紅色。根據(jù)滴定草酸樣品所用的藍(lán)色染料2，6-二氯酚靛酚溶液的量，再利用公式便可計(jì)算出蘋果果肉中維生素C的含量。

（二） 熒光分光光度法測(cè)定維生素C

熒光分光光度法測(cè)定蘋果果肉中維生素C所用藥品和儀器少，但操作步驟較多，測(cè)定的準(zhǔn)確度比滴定法測(cè)定稍微高些。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，然后在樣品中加入偏磷酸-冰醋酸溶液，充分混勻后加入適量活性炭，劇烈震蕩20 min后過濾，取一定量濾液加入定量的硼酸-醋酸鈉，充分搖勻后放置10 min，稀釋到定量濃度便可作為樣品溶液。按照步驟制定維生素C的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。在樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液中分別加入定量的鄰苯二胺，混合后避光反應(yīng)35 min后邊便可進(jìn)行測(cè)定。樣品設(shè)置3次重復(fù)。維生素C與活性炭反應(yīng)，可被氧化成脫氧抗壞血酸，它與鄰苯二胺進(jìn)行反應(yīng)生成喹喔啉，利用分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)351 nm和發(fā)射波長(zhǎng)432 nm處測(cè)定喹喔啉的熒光強(qiáng)度。根據(jù)公式便可計(jì)算出蘋果果肉中維生素C的含量。

（三）紫外分光光度法測(cè)定維生素C

紫外分光光度法測(cè)定蘋果果肉中維生素C時(shí)，前面對(duì)樣品抽提較麻煩，整個(gè)操作過程所用藥品偏多，該方法測(cè)定維生素C時(shí)所用到的低溫離心機(jī)和進(jìn)口酶標(biāo)儀價(jià)格較高。因?yàn)榍懊娌僮鞑襟E比較煩瑣，維生素C容易被氧化，所以測(cè)定蘋果果肉中維生素C含量不是很準(zhǔn)確。紫外分光光度法適合大批量測(cè)定樣品，酶標(biāo)儀檢測(cè)靈敏度高、速度快，1次2 min便可檢測(cè)96個(gè)樣品。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，取一定樣品加入提前預(yù)冷的HCL溶液進(jìn)行充分抽提，抽提時(shí)間為30 min，且中間需要顛倒混勻5次。樣品設(shè)置3次重復(fù)。然后利用低溫離心機(jī)進(jìn)行離心，取一定量的上清液加入NaH2PO4，并用NaOH調(diào)試溶液的pH?；靹蚝笕∩锨逡杭尤胍欢舛鹊腘aH2PO4和二硫蘇糖醇，在25℃ 條件下黑暗反應(yīng)30 min。蘋果內(nèi)維生素C分為氧化型和還原型，二硫蘇糖醇具有強(qiáng)還原性，能將蘋果內(nèi)氧化型維生素C還原為還原型維生素C，在波長(zhǎng)265 nm處便可測(cè)定。取一定量前面抽提的上清液加入NaH2PO4，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸收波長(zhǎng)為265 nm處的值，最后加 AO酶，反應(yīng)后再測(cè)1次數(shù)值。樣品設(shè)置3次重復(fù)。根據(jù)維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線便可測(cè)定出蘋果果肉中維生素C的含量。

（四）高效液相色譜法測(cè)定維生素C

高效液相色譜法測(cè)定蘋果果肉中維生素C時(shí)，整個(gè)操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度也快，測(cè)定結(jié)果也較準(zhǔn)確，但高效液相色譜法所用高效液相色譜儀價(jià)格非常高。

取蘋果果肉于液氮中速凍，樣品在液氮中研磨成粉末，取一定樣品加入提前預(yù)冷的HPO3溶液進(jìn)行充分抽提，抽提時(shí)間30 min，且中間需要顛倒混勻5次。樣品設(shè)置3次重復(fù)。采用低溫離心機(jī)離心，并用微孔濾膜抽濾上清液進(jìn)行備用。然后再濾液中加入一定量的二硫蘇糖醇，25℃黑暗條件下反應(yīng)約15 min。蘋果果肉經(jīng)HPO3溶液抽提后，維生素C便可用微孔濾膜分離出來(lái)。此時(shí)便可用高效液相色譜儀在254 nm處檢測(cè)其峰值。用高效液相色譜儀在波長(zhǎng)為254 nm測(cè)出樣品溶液中總維生素C含量，流動(dòng)液相為乙酸緩沖液，測(cè)定時(shí)流速為

1.0 mL·min-1，根據(jù)維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線和出峰的峰面積

即可測(cè)定出蘋果果肉中維生素C的含量。

二、結(jié)論與討論

由于維生素C具有還原性，在空氣中不穩(wěn)定，極易被氧化，所以前人對(duì)維生素C含量的測(cè)定方法做了很多研究。本文通過對(duì)滴定法、熒光分光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法4種測(cè)定方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)高效液相色譜法具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度更高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，更適合測(cè)定蘋果中維生素C含量。

高效液相色譜法雖然比較適合測(cè)定蘋果中維生素C含量，但是該方法所用到的高效液相色譜儀價(jià)格昂貴，且高效液相色譜儀開機(jī)比較麻煩，適合大批量測(cè)定樣品，測(cè)定樣品時(shí)費(fèi)用較高。其他幾種方法雖然準(zhǔn)確性有點(diǎn)低，但可以對(duì)蘋果中維生素C中含量進(jìn)行簡(jiǎn)單的比較。

（責(zé)任編輯? ?程麗紅）