耿雨欣，吳雅詩(shī)，黃曼林，侯麗萍

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006）

內(nèi)分泌干擾物（Endocrine disruption chemical，EDCs）屬于一種存在于自然環(huán)境中的、具有類激素效果的化學(xué)物質(zhì)，它會(huì)對(duì)生命體內(nèi)源激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解過(guò)程產(chǎn)生影響，從而對(duì)生命體的生殖發(fā)育、免疫、內(nèi)分泌和神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，并可造成其后多代的內(nèi)分泌代謝失調(diào)[1]。EDCs 主要來(lái)源于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和民眾日常生活產(chǎn)生的廢氣、廢水和廢渣。大量文獻(xiàn)表明，當(dāng)前全球主要水體中均已含有多種EDCs。由于水體的流動(dòng)性較強(qiáng)，EDCs 可以隨水體流動(dòng)進(jìn)行長(zhǎng)距離的擴(kuò)散污染。因此，EDCs對(duì)水生動(dòng)物的暴露毒理效應(yīng)已經(jīng)成為備受關(guān)注的全球性環(huán)境問題[2]。不同于常見的已知有毒化合物如殺蟲劑、雙酚A、二噁英等，天然和人工合成的5大類類固醇激素（糖皮質(zhì)激素、鹽皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素與孕激素）被發(fā)現(xiàn)是一類新型EDCs 且活性較強(qiáng)[3-4]。與雌激素和雄激素類物質(zhì)的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)研究報(bào)道[5-7]相比，有關(guān)環(huán)境糖皮質(zhì)激素的生態(tài)毒理學(xué)研究報(bào)道相對(duì)較少。

糖皮質(zhì)激素作為一種類固醇激素，是由下丘腦—垂體—腎上腺軸調(diào)控，并由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌，其在生物體內(nèi)是由糖皮質(zhì)激素受體（Glucocorticoid receptor，GR）介導(dǎo)，隨后發(fā)揮多種生物學(xué)功能。糖皮質(zhì)激素以其抗炎癥和免疫抑制作用在人類臨床和獸醫(yī)臨床上應(yīng)用廣泛[8]。

由于污水處理不充分或直接排放，導(dǎo)致工廠廢水、畜牧場(chǎng)排水和地表水等水體環(huán)境中含有不同濃度的糖皮質(zhì)激素，從幾十ng/L 到幾百ng/L 范圍不等[3-4]。研究表明，魚類暴露于外源性糖皮質(zhì)激素環(huán)境下，其生理生化和遺傳過(guò)程均可能受到不良影響。例如，除了改變葡萄糖穩(wěn)態(tài)以外，糖皮質(zhì)激素還會(huì)影響免疫系統(tǒng)（如白細(xì)胞計(jì)數(shù)的減少和免疫抑制）和內(nèi)分泌系統(tǒng)（如雄激素效應(yīng)）[9]。Willi 等[10-11]研究表明，可的松或丙酸氯倍他索的生理效應(yīng)主要包括使斑馬魚胚胎心率增加，減少其自發(fā)性肌肉收縮，并加速其孵化等；而地塞米松則被發(fā)現(xiàn)可使斑馬魚心臟體積增大，心肌細(xì)胞變大，心臟性能增強(qiáng)。盡管脊椎動(dòng)物的生殖是由下丘腦—垂體—性腺軸來(lái)控制的，但糖皮質(zhì)激素在機(jī)體生殖過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用[12]。這可以由糖皮質(zhì)激素受體和雌激素受體之間的某些相互作用來(lái)證明。例如：糖皮質(zhì)激素受體的激活阻止了雌二醇對(duì)雌激素受體表達(dá)的正向調(diào)節(jié)作用[13]，糖皮質(zhì)激素和雌激素受體在鱒魚大腦和垂體中的分布重疊[14]，皮質(zhì)類固醇和性類固醇之間可能存在拮抗作用[15]，性類固醇調(diào)節(jié)皮質(zhì)類固醇的產(chǎn)生，這些結(jié)果都進(jìn)一步支持糖皮質(zhì)激素受體和雌激素受體在生殖周期中存在相互作用這一論斷。由此推斷，皮質(zhì)類固醇可能直接或間接參與卵母細(xì)胞成熟的控制，糖皮質(zhì)激素和雌激素的代謝途徑之間可能存在潛在干擾。因此，利用可的松評(píng)價(jià)糖皮質(zhì)激素對(duì)雌性斑馬魚生殖損傷的毒理風(fēng)險(xiǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)意義。

除了探究糖皮質(zhì)激素對(duì)親代的毒性效應(yīng)以外，學(xué)者們還發(fā)現(xiàn)EDCs 對(duì)其子代也可能造成不利影響，即化合物的跨代毒性效應(yīng)。特別是當(dāng)親代接受暴露后無(wú)明顯表型改變時(shí)，化合物對(duì)子代得影響可能更容易被忽視[16]。成年雌性斑馬魚暴露于低濃度的氟氫可的松21 d 后，其機(jī)體免疫應(yīng)答和大腦晝夜節(jié)律相關(guān)基因的差異性表達(dá)顯著，子一代幼魚的孵化率、心跳和游動(dòng)行為都在6 和42 ng/L 的氟氫可的松暴露下顯著增加[17]。Ma 等[18]探究了環(huán)境中雄激素1,4-雄烯二酮（ADD）和雄烯二酮（AED）對(duì)斑馬魚的跨代效應(yīng)，將受精后21～144 d 的F0代斑馬魚分別暴露于0～500 ng/L 的ADD 和AED 中，其F1代在清水中培養(yǎng)0～144 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在F0代中，ADD 和AED 均顯著增加了雌魚的數(shù)量，表現(xiàn)雌激素效應(yīng)；在F1代中，高濃度（393 ng/L）ADD 組的雌魚仍然顯著多于雄魚，占比為63.5%，而高濃度（428 ng/L）AED 組的雄魚顯著多于雌魚，占比為78.7%。

為了探究可的松對(duì)雌性斑馬魚生殖系統(tǒng)是否具有毒性效應(yīng)和跨代效應(yīng)，研究以雌性斑馬魚及其子一代為研究對(duì)象，從形態(tài)學(xué)、病理組織學(xué)、行為學(xué)等方面評(píng)估糖皮質(zhì)激素可的松的毒理風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

斑馬魚購(gòu)于廣州花鳥市場(chǎng)，魚齡120 d 左右。水質(zhì)監(jiān)測(cè)采用Thermo 多道水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀（Thermo Orion，520M-01，廣州）。

主要試劑有可的松（CAS 53-06-5，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）、二甲基亞砜[DMSO，CAS 67-68-5，生工生物工程（上海）股份有限公司]、Bouin' s 固定液（飛凈生物科技有限公司）。暴露試劑以DMSO 為助溶劑，配制成1 g/L 的母液，再依次稀釋到相應(yīng)濃度，4℃避光保存。

主要設(shè)備有體式顯微鏡及成像系統(tǒng)（Leica MC170 HD，新加坡）、高清攝像頭（RERVISION RER-BXH2MP 0550，中國(guó)）以及動(dòng)物軌跡跟蹤系統(tǒng)（EthoVision XT，荷蘭）。養(yǎng)殖容器為方形玻璃缸（25 cm×20 cm×20 cm）。

1.2 試驗(yàn)方法

將斑馬魚在實(shí)驗(yàn)室條件下穩(wěn)定飼養(yǎng)2 周且無(wú)死亡狀況出現(xiàn)后再用于慢性毒理試驗(yàn)，期間控制飼養(yǎng)水體環(huán)境的硬度、pH 值、溶解氧含量、溫度、光周期等參數(shù)，穩(wěn)定飼養(yǎng)和暴露期間采用自然光源，每日喂食2 次。

可的松暴露濃度分別為5、50、500 ng/L，以等體積的DMSO 為對(duì)照，共4 個(gè)處理，設(shè)置3 個(gè)平行，每個(gè)容器10 尾健康活潑的雌性斑馬魚（肉眼分辨），共120 尾斑馬魚。試驗(yàn)期間保證24 h 換一次水。暴露周期持續(xù)60 d。

暴露結(jié)束后，在交配產(chǎn)卵前夜選擇發(fā)育良好、游動(dòng)活躍的F0代魚，挑出雌魚和雄魚以1 ∶2 的比例置于有隔板的產(chǎn)卵缸內(nèi)進(jìn)行交配試驗(yàn)（每缸中5條雌魚，每暴露組共15 條）。第二日早上8：00 抽開隔板，30 min 后收集魚卵。將產(chǎn)卵缸中的魚卵收集到準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)卵數(shù)和孵化率。

每缸中挑選5 尾雌魚于冰水混合物上暈眩并解剖，為了避免晝夜節(jié)律造成的試驗(yàn)差異，采用多人合作模式，保證在2 h 內(nèi)解剖完60 尾。解剖前稱量體重，解剖后稱量性腺重量，并計(jì)算性腺指數(shù)（GSI= 性腺重/魚體重量）。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1 斑馬魚卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察解剖時(shí)將新鮮的雌魚性腺組織置于Bouin's 固定液中，取固定24 h 后的性腺組織用酒精脫水，用二甲苯透明，石蠟包埋，切片，H&E 染色，中性樹膠封片，最后在Olympus BX-51 顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.2 幼魚發(fā)育形態(tài)學(xué)觀察對(duì)子一代胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，分別在產(chǎn)卵后24、48、72、120、144 h 使用體視顯微鏡觀察斑馬魚胚胎有無(wú)畸變發(fā)育，拍照記錄。

1.3.3 幼魚行為學(xué)測(cè)定受精后144 h 時(shí)選擇形態(tài)正常的幼魚記錄其活動(dòng)。將單條魚（n=7）放置在圓形玻璃皿（半徑為2 cm）中，在27±1℃的黑暗環(huán)境下觀察 6 min，使用動(dòng)物軌跡跟蹤系統(tǒng)記錄幼魚的基本運(yùn)動(dòng)情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 26 統(tǒng)計(jì)分析軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA）、差異顯著性分析及t檢驗(yàn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 可的松對(duì)親代成年雌魚性腺的毒性作用

由圖1 可知，成年雌性斑馬魚卵巢中的卵泡發(fā)育包括核仁外周卵母細(xì)胞（PO）、皮質(zhì)肺泡卵母細(xì)胞（CO）、早期卵黃卵母細(xì)胞（EV）、晚期-成熟卵黃卵母細(xì)胞（LV）等4 個(gè)階段。對(duì)照組可觀察到典型的成年雌魚性腺切片，即主要由EV 和LV 占據(jù)的性腺切片（圖1a）。通過(guò)比較不同處理各發(fā)育階段卵母細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量百分比（圖2）發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，5、50 和500 ng/L 可的松暴露處理的核仁外周卵母細(xì)胞（PO）比例分別上升了205.26%、341.92%和379.36%，差異極顯著（P＜0.001）；對(duì)照組中幾乎不可見皮質(zhì)肺泡卵母細(xì)胞（CO，比例僅為0.03%），而5、50 和500 ng/L 處理組中CO 比例相對(duì)上升了13.77、10.78 和10.41 個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.001）；EV 與LV 為發(fā)育更為成熟的卵母細(xì)胞，二者的細(xì)胞頻率處于下降趨勢(shì)，雖然EV 在可的松暴露組中的比例下降不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是LV 在50 和500 ng/L 可的松暴露組的比例分別比對(duì)照下降了88.62%和90.88%，差異顯著（P＜0.05）?？傮w來(lái)看，可的松暴露顯著提高了早期發(fā)育階段卵母細(xì)胞的比例，同時(shí)高濃度暴露處理的晚期-成熟卵黃卵母細(xì)胞（LV）數(shù)量顯著減少。這表明高濃度的可的松暴露會(huì)抑制卵母細(xì)胞發(fā)育。從圖3 可以看出，各組成年雌性斑馬魚的GSI 指數(shù)和性腺重量未出現(xiàn)顯著變化。

圖1 成年雌性斑馬魚在不同濃度可的松中暴露60 d 后卵巢典型組織切片

圖2 暴露可的松60 d 后斑馬魚卵巢不同發(fā)育階段卵母細(xì)胞數(shù)量百分比變化

圖3 成魚性腺GSI（a）和性腺重量（b）

2.2 可的松對(duì)子一代胚胎早期發(fā)育的毒性效應(yīng)

從表1 可以看出，高濃度（500 ng/L）暴露組的雌魚無(wú)法產(chǎn)卵，而中濃度（50 ng/L）暴露組的產(chǎn)卵量比對(duì)照組少88.16%，孵化率也比對(duì)照組低67.51 個(gè)百分點(diǎn)，差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.001）；而低濃度（5 ng/L）暴露組的產(chǎn)卵量下降41.30%（P＜0.01），孵化率則降低6.71 個(gè)百分點(diǎn)，差異也達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。由此可見，暴露于可的松的成年雌性斑馬魚產(chǎn)卵量與孵化率隨暴露濃度升高而降低，具有濃度依賴性。

表1 不同暴露濃度下產(chǎn)卵量和孵化率

從幼魚行為測(cè)試熱圖（圖4a）可以看出，5 ng/L可的松暴露組的子一代幼魚活動(dòng)明顯增加，對(duì)其移動(dòng)距離和移動(dòng)速度的統(tǒng)計(jì)（圖4b）也可以看出這一點(diǎn)，5 ng/L 可的松暴露組的移動(dòng)距離和移動(dòng)速度分別比對(duì)照組分別增加了455.28%和803.87%，差異極顯著（P＜0.001）；50 ng/L 處理組的子一代幼魚游動(dòng)速度為60.92 cm/s，比對(duì)照組提升了504.37% （P＜0.001）。行為測(cè)試結(jié)果表明可的松暴露使得子一代幼魚更加興奮。由圖5 可知，5～50 ng/L 可的松暴露下，斑馬魚子一代沒有出現(xiàn)明顯的畸變現(xiàn)象。

圖4 不同處理幼魚游動(dòng)能力的比較

圖5 胚胎發(fā)育形態(tài)學(xué)觀察

3 結(jié)論與討論

在脊椎動(dòng)物中糖皮質(zhì)激素作為一種甾體激素能直接作用于性腺，導(dǎo)致下丘腦—垂體—性腺軸功能被抑制，從而抑制性腺甾體激素的合成、延遲青春期的發(fā)育，干擾正常的卵巢周期和排卵[19]。該研究中高濃度可的松暴露后卵巢中PO 頻率大幅升高，而EV 和LV 的頻率下降，說(shuō)明可的松慢性暴露能夠抑制卵泡發(fā)育。除此之外，可的松慢性暴露成年雌性斑馬魚導(dǎo)致生殖損傷還表現(xiàn)為減少產(chǎn)卵數(shù)量，具體表現(xiàn)為產(chǎn)卵數(shù)量隨暴露濃度升高而顯著減少，并且經(jīng)過(guò)高濃度（500 ng/L）暴露的雌性斑馬魚不能產(chǎn)卵。Lalone 等[20]的研究也表明，500 ng/L 的地塞米松暴露成年雌性黑頭呆魚21 d 后可降低成年雌魚的產(chǎn)卵量。皮質(zhì)醇被發(fā)現(xiàn)可體外抑制鱒魚卵泡中性類固醇的分泌[21]。以上結(jié)果均表明糖皮質(zhì)激素暴露對(duì)成年雌性斑馬魚具有生殖毒性。該研究中，5～50 ng/L可的松處理處理對(duì)孵化出的子一代形態(tài)學(xué)尚未產(chǎn)生明顯的毒理效應(yīng)，但行為分析中可以觀察到明顯的游動(dòng)速度加快。在Willi 等[10]的研究中也得到這樣的結(jié)果，胚胎分別暴露于丙酸氯倍他索、皮質(zhì)醇和可的松下時(shí)，前兩者胚胎出現(xiàn)明顯肌肉收縮減少、心率以及孵化速度加快的現(xiàn)象，而可的松暴露組未出現(xiàn)類似現(xiàn)象，這可能是由于藥物的生物學(xué)活性不同所致。該試驗(yàn)初步探究了環(huán)境濃度的可的松對(duì)雌性斑馬魚的生殖毒性作用和跨代效應(yīng)，為深入研究可的松對(duì)斑馬魚生殖毒理機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支持，后續(xù)可進(jìn)一步研究可的松對(duì)斑馬魚性腺軸基因表達(dá)和相關(guān)通路的影響。