蔣瓊 姚瑞峰 伍啟陽(yáng) 王國(guó)芬 王俊松 羅心靜

關(guān)節(jié)滑膜組織中成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblastlike synoviocyte，F(xiàn)LS）的活化及其產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的病理機(jī)制中起關(guān)鍵作用[1-2]。RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 受關(guān)節(jié)局部各種有害因子刺激時(shí)被激活，其不僅產(chǎn)生多種促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)滑膜炎癥反應(yīng)，還產(chǎn)生多種基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP），如MMP-1、MMP-3、MMP-9 等，介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨及骨的細(xì)胞外基質(zhì)降解，參與RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 的遷移、侵襲及關(guān)節(jié)破壞[1，3]。已有研究表明，關(guān)節(jié)炎性缺氧微環(huán)境是RA 重要特征之一，滑膜炎癥會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)局部的缺氧，而關(guān)節(jié)缺氧微環(huán)境又會(huì)促進(jìn)滑膜細(xì)胞合成和分泌炎癥細(xì)胞因子和MMP，加重滑膜炎癥，促進(jìn)血管新生、軟骨及骨的破壞[4-5]。以往的研究多集中在單獨(dú)缺氧或促炎因子對(duì)滑膜細(xì)胞炎癥介質(zhì)生成影響[6]，缺氧和促炎因子聯(lián)合刺激作用報(bào)道很少,其機(jī)制也尚未闡明。

低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1α通路和NF-κB 通路都是缺氧和炎癥反應(yīng)中的重要信號(hào)通路。HIF-1α和NF-κB均在RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中表達(dá)上調(diào)，并且參與滑膜炎癥、滑膜增生、軟骨及骨侵蝕破壞等病理過(guò)程[7-9]。但缺氧和炎癥因子聯(lián)合刺激對(duì)MMP生成的影響及機(jī)制尚不明確。本研究采用組織塊法從RA患者滑膜組織分離原代FLS，探討低氧和IL-1β 聯(lián)合刺激對(duì)MMP-1、MMP-3、MMP-9表達(dá)的影響，并分析HIF-1α和NF-κB在其中的調(diào)控作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM 培養(yǎng)基、FBS 購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；Trizol 試劑、RevertAid 第一鏈cDNA 合成試劑盒、SYBR Green Master Mix 試劑 盒 購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems 公司；磷酸化的NF-κB p65（p-p65）兔多克隆抗體、HIF-1α 兔多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 購(gòu)自中國(guó)Biosharp 公司；MMP-1、MMP-3 ELISA 試劑盒購(gòu)自中國(guó)博士德公司；MMP-9 ELISA 試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司；WesternBright ECL 購(gòu)自中國(guó)環(huán)亞生物科技；重組人IL-1β 購(gòu)自中國(guó)近岸蛋白公司；HIF-1α 抑制劑YC-1、NF-κB 抑制劑BAY-117082 購(gòu)自美國(guó)MCE 公司。

1.2 方法

1.2.1 RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 分離、傳代和鑒定 本研究通過(guò)臺(tái)州學(xué)院附屬臺(tái)州市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：2020-sc-032）?；?biāo)本來(lái)源于2 例RA 患者關(guān)節(jié)腔手術(shù)和關(guān)節(jié)置換術(shù)切取的滑膜組織。FLS 分離采用組織塊法，具體操作如下：將手術(shù)切取的RA 滑膜標(biāo)本去除脂肪和肌肉，修剪成5～8 mm2組織塊，置于25 cm2培養(yǎng)瓶（每個(gè)培養(yǎng)瓶約7～8個(gè)組織塊）中貼壁培養(yǎng)，1 h 后加入2 mL 含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，24 h 后再加入3 mL，3～5 d 細(xì)胞長(zhǎng)出，去除組織塊，更換培養(yǎng)基，1 次/3 d。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)融合時(shí)，用胰酶消化，并按照1∶3 傳代。傳至3 代后細(xì)胞用Vimentin 染色（免疫熒光法）鑒定，貼壁細(xì)胞基本上為均一的FLS。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)采用的是4～9 代細(xì)胞。將細(xì)胞傳代貼壁24 h 后置于三氣培養(yǎng)箱低氧培養(yǎng)（1% O2、5% CO2、94% N2）。將細(xì)胞傳代貼壁24 h 后置于普通CO2培養(yǎng)箱常氧培養(yǎng)（21% O2、5% CO2、94% N2）。一階段實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞分為4 組，分別為常氧組（細(xì)胞常氧培養(yǎng)）、低氧組（細(xì)胞低氧培養(yǎng)）、IL-1β 組（細(xì)胞加入終濃度10 ng/mL 的IL-1β 后常氧培養(yǎng)）、IL-1β+低氧組（細(xì)胞加入終濃度10 ng/mL 的IL-1β 后低氧培養(yǎng)）；二階段實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞分為4 組，分別為IL-1β+低氧組（細(xì)胞在10 ng/mL 的IL-1β 和低氧環(huán)境培養(yǎng)）、YC 組（細(xì)胞先經(jīng)5 μmol/L YC-1 預(yù)處理2 h 后，再在10 ng/mL 的IL-1β和低氧環(huán)境培養(yǎng)）、BAY 組（細(xì)胞先經(jīng)10 μmol/L BAY11-7082 預(yù)處理2 h 后，再在10 ng/mL 的IL-1β 和低氧環(huán)境培養(yǎng)）、YC+BAY 組（細(xì)胞先經(jīng)10 μmol/L YC-1 和5 μmol/L BAY11-7082 共 處 理2 h 后，再 在10 ng/mL 的IL-1β 和低氧環(huán)境培養(yǎng)）。

1.2.3 MMP-1、MMP-3、MMP-9 水平測(cè)定 經(jīng)低氧和（或）IL-1β 處理24 h 后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用ELISA 法（按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度（optical density，OD）值，對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白及對(duì)應(yīng)的OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)公式計(jì)算MMP-1、MMP-3、MMP-9 水平。

1.2.4 MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 表 達(dá)水平測(cè)定 經(jīng)低氧和（或）IL-1β 處理12 h 后收集各組細(xì)胞，采用Trizol 法提取總RNA，并將1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄操作按照RevertAid 第一鏈cDNA 合成試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。將合成的cDNA（0.4 μmol/L）、相應(yīng)引物（0.2 μmol/L）與10 μL SYBR green PCR master mix 混合，于定量PCR 儀進(jìn)行Real-time PCR 法擴(kuò)增反應(yīng)，引物序列見(jiàn)表1。各組數(shù)據(jù)分析采用ΔCt 法，計(jì)算各組2-ΔΔCt值。

表1 定量PCR 引物

1.2.5 HIF-1α 和p-p65 蛋白表達(dá)水平測(cè)定 采用Western blot 法。經(jīng)低氧和（或）IL-1β 處理6 h 后，收集各組細(xì)胞，用RIPA 緩沖液與蛋白酶抑制劑混合液裂解細(xì)胞30 min，離心收集上清液，用BCA 法測(cè)定蛋白表達(dá)水平。取各組裂解上清液蛋白20 μg 與蛋白上樣緩沖液，1∶5 混合煮沸后上樣，蛋白經(jīng)8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后經(jīng)轉(zhuǎn)印至甲醇預(yù)處理的聚偏二氟乙烯膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 緩沖液封閉4 h 后，加入HIF-1α、p-p65 或GAPDH 一抗4 ℃孵育過(guò)夜，第2 天經(jīng)TBST 緩沖液漂洗后加入二抗室溫孵育1 h，再經(jīng)TBST 緩沖液漂洗后加入ECL 試劑室溫孵育5 min，于化學(xué)發(fā)光熒光影像分析儀成像，檢測(cè)HIF-1α和p-p65 蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 HIF-1α 和p-p65 核移位測(cè)定 細(xì)胞接種于鋪有爬片的6 孔板中（5×105個(gè)/孔），第2 天經(jīng)低氧和（或）IL-1β處理2 h。然后細(xì)胞用5%多聚甲醛固定2 h，0.1% Triton X-100 通透（增加抗體對(duì)細(xì)胞膜的穿透性）20 min、封閉液封閉1 h；加入HIF-1α 或p-p65 抗體4 ℃孵育過(guò)夜；加入Cy3 標(biāo)記的IgG 室溫孵育1 h，加二脒基-2-苯基吲哚染核5 min，清洗后加入淬滅液，熒光顯微鏡觀察，測(cè)定HIF-1α 和p-p65 核移位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 7 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 的觀察及鑒定 倒置顯微鏡下觀察顯示，RA 滑膜組織塊貼壁3 d 左右有細(xì)胞從組織塊邊緣長(zhǎng)出，以長(zhǎng)梭形細(xì)胞為主，也有少量卵圓形和不規(guī)則形細(xì)胞。14 d 左右培養(yǎng)瓶里可長(zhǎng)滿(mǎn)細(xì)胞，主要是貼壁的長(zhǎng)梭形滑膜細(xì)胞。細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，細(xì)胞傳至3 代后90%以上細(xì)胞為Vimentin 染色陽(yáng)性的FLS。見(jiàn)圖1（插頁(yè)）。

圖1 RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 的生長(zhǎng)及鑒定圖（A：倒置顯微鏡下的細(xì)胞生長(zhǎng)，×10；B：免疫熒光法鑒定RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS，Vimentin 染色，×10）

2.2 一階段實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 水平比較 常氧組與低氧組比較，MMP-1、MMP-3、MMP-9 水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），IL-1β組上述3 個(gè)指標(biāo)水平均高于常氧組（均P＜0.05），IL-1β+低氧組上述3 個(gè)指標(biāo)水平均高于IL-1β 組（均P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 水平比較（ng/mL）

2.3 一階段實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平比較 與常氧組比較，低氧組和IL-1β 組MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）；與IL-1β 組比較，IL-1β+低氧組MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平均升高（均P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平比較

2.4 一階段實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞HIF-1α 和p-p65 表達(dá)水平比較 與常氧組比較，低氧組和IL-1β 組HIF-1α 及pp65 表達(dá)水平明顯升高，IL-1β+低氧組升高更為顯著，見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞HIF-1α 和p-p65 蛋白表達(dá)的電泳圖

2.5 一階段實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞HIF-1α 和p-p65 核移位情況比較 與常氧組比較，低氧組HIF-1α 核移位較為明顯，p-p65 核移位有所增加，IL-1β 組細(xì)胞p-p65 核移位較為明顯，p-p65 核移位有所增加，而IL-1β+低氧組HIF-1α 和p-p65 核移位均更為顯著，見(jiàn)圖3（插頁(yè)）。

圖3 各組細(xì)胞HIF-1α 和p-p65 核移位的細(xì)胞免疫熒光圖（cy3 染色，×200）

2.6 二階段實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 水平比較 與IL-1β+低氧組相比，YC 組、BAY 組和YC+BAY組MMP-1、MMP-3、MMP-9水平均降低（均P＜0.05），其中YC+BAY 組降低最明顯，見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 水平比較（ng/mL）

2.7 二階段實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平比較 與IL-1β+低氧組相比，YC 組、BAY 組和YC+BAY 組MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA表達(dá)水平均降低（均P＜0.05），其中YC+BAY 組降低最明顯（均P＜0.01），見(jiàn)表5。

表5 各組細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平比較

3 討論

RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 合成和分泌的MMP 在RA 軟骨及骨破壞中發(fā)揮重要作用。目前已發(fā)現(xiàn)20 多種MMP 家族成員，其中MMP-1、MPP-3、MMP-9 是RA病變中主要作用的MMP，與正常人滑膜相比，它們?cè)赗A 患者滑膜組織和滑膜液中表達(dá)水平顯著增高，其不僅介導(dǎo)RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 的侵襲及軟骨和骨質(zhì)的降解，而且能促進(jìn)新生血管生成，在RA 關(guān)節(jié)破壞中起重要作用[10]。因此，抑制MMP-1、MMP-3、MMP-9已經(jīng)成為RA 治療的有效靶點(diǎn)。

研究表明，RA 關(guān)節(jié)缺氧微環(huán)境也可能在炎癥介質(zhì)表達(dá)及其引發(fā)的關(guān)節(jié)破壞中起重要作用[5]。關(guān)節(jié)缺氧炎癥是RA 的重要特征，關(guān)節(jié)局部炎癥和缺氧是相互促進(jìn)的[11]。雖然缺氧或促炎因子單獨(dú)刺激對(duì)滑膜細(xì)胞炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響已有報(bào)道，但缺氧和促炎因子聯(lián)合刺激對(duì)MMPs 報(bào)道甚少。Lee 等[12]研究表明，缺氧和IL-1β 聯(lián)合刺激RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 后MMP-1表達(dá)升高，但MMP-13 表達(dá)下降。本研究顯示，RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 受單獨(dú)的低氧刺激后MMP-1、MMP-3、MMP-9 水平均無(wú)顯著改變，單獨(dú)IL-1β 刺激后有明顯升高，而低氧和IL-1β 聯(lián)合刺激后升高更為顯著。此外，單獨(dú)低氧或IL-1β 刺激都能誘導(dǎo)細(xì)胞MMP-1、MMP-3、MMP-9 mRNA 表達(dá)水平升高，低氧和IL-1β 聯(lián)合刺激后這些炎癥介質(zhì)mRNA 表達(dá)更為顯著。以上研究提示，RA 關(guān)節(jié)滑膜炎癥和缺氧微環(huán)境可能會(huì)協(xié)同促進(jìn)RA 關(guān)節(jié)滑膜組織中FLS 表達(dá)和分泌MMP-1、MMP-3、MMP-9，從而加重軟骨和骨質(zhì)的降解及關(guān)節(jié)破壞。

HIF-1α 是缺氧誘導(dǎo)的主要轉(zhuǎn)錄因子。在常氧條件下，HIF-1α 被脯氨酰4-羥化酶（prolyl 4-hydroxylase，PHD）和缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子（hypoxia inducible factor inhibitor，F(xiàn)IH）羥基化，導(dǎo)致HIF-1α 降解。在缺氧條件下，PHD 和FIH 活性降低，HIF-1α 積聚并遷移到細(xì)胞核，并與HIF-1β 和腺病毒E1A 相關(guān)的300 kD 蛋白（p300）/環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CBP）形成復(fù)合物，與低氧反應(yīng)元件結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，遷移、侵襲、凋亡和血管生成[13]。研究表明，HIF-1α 在RA 滑膜組織高表達(dá)，它通過(guò)調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子、MMP 及血管生成因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）生成介導(dǎo)RA 關(guān)節(jié)炎癥和骨質(zhì)破 壞[14]。本研究證實(shí)，單獨(dú)低氧或IL-1 均能誘導(dǎo)HIF-1α 在FLS中的表達(dá)和核移位，低氧和IL-1β 聯(lián)合作用更為顯著。為了闡明HIF-1α 通路在低氧和IL-1β 聯(lián)合刺激滑膜細(xì)胞MMP 表達(dá)中的作用，本研究采用HIF-1α 抑制劑YC-1 預(yù)處理FLS，結(jié)果顯示HIF-1α 抑制劑能降低MMP-1、MMP-3 和MMP-9 在FLS 中 的 表 達(dá) 及 分泌。以上研究表明，HIF-1α 通路可能在低氧和IL-1β協(xié)同促進(jìn)MMP 表達(dá)中起重要作用。

NF-κB 是炎癥信號(hào)通路的重要轉(zhuǎn)錄因子，其常以RelA（p65）/ NF-κB1（p50）二聚體形式存在。在靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB 與抑制蛋白IκB 結(jié)合以無(wú)活性形式存在于胞漿；當(dāng)受炎癥因子刺激時(shí)，IκB 激酶被激活并降解IκB，NF-κB 被釋放出來(lái)后進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合并調(diào)節(jié)其表達(dá)。NF-κB 與RA 促炎因子及MMP 生成調(diào)節(jié)密切相關(guān),其高度活化導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜炎癥、軟骨和骨破壞[15]。缺氧能誘導(dǎo)多種細(xì)胞（如前列腺癌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞）NF-κB 活化。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧或IL-1β 均能誘導(dǎo)FLS 中NF-κB 活化，低氧和IL-1β 聯(lián)合刺激后NF-κB 活化更為顯著。本研究還發(fā)現(xiàn)，NF-κB 抑制劑BAY11-7082 能顯著下調(diào)低氧和IL-1β 聯(lián)合誘導(dǎo)的MMP-1、MMP-3、MMP-9 表達(dá)及分泌。這些研究表明NF-κB 通路在低氧和IL-1β 協(xié)同促進(jìn)MMP 表達(dá)中也發(fā)揮重要作用。

雖然本研究證實(shí)HIF-1α 和NF-κB 在低氧和IL-1β 聯(lián)合刺激誘導(dǎo)的MMP-1、MMP-3、MMP-9 的表達(dá)中起重要調(diào)節(jié)作用。然而，HIF-1α 和NF-κB 調(diào)控這些MMP 表達(dá)的機(jī)制尚不清楚。HIF-1α 和NF-κB 是否直接與這些MMP 啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)節(jié)其表達(dá)，需進(jìn)一步研究。有研究表明HIF-1α 和NF-κB 相互作用促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞CXCR1/2 的表達(dá)[16]。那么HIF-1α 是否與NF-κB 相互作用協(xié)調(diào)促進(jìn)MMP-1、MMP-3、MMP-9 的表達(dá)，也需要進(jìn)一步證實(shí)。

總之，低氧和IL-1β 能協(xié)同促進(jìn)FLS 中MMP-1、MMP-3、MMP-9 的表達(dá)及分泌，而NF-κB 通路和HIF-1α 通路可能在這一調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究初步揭示了關(guān)節(jié)缺氧微環(huán)境中的病變機(jī)制，可為RA 防治提供新策略和靶點(diǎn)。