榮俊，李楊*，楊玉瑩，李國攀

1.長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025 2.長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025

雞傳染性貧血病毒(Chicken anemia virus，CAV)屬于圓環(huán)病毒科環(huán)狀病毒屬，是一種無包膜的二十面體病毒[1]。自我國于1992年由崔現(xiàn)蘭等[2]首次分離報道該病毒后，全國各地相繼發(fā)現(xiàn)該病的流行。在對我國多個省市2014—2015年CAV的分子流行病學的調查中發(fā)現(xiàn)，CAV陽性率為13.30%，其中混合感染率為55.56%，為主要的感染類型[3]。對我國13個省市的調查表明，2016-2019年CAV陽性率為12.5%～25.69%[4]，而且CAV的感染在很多國家普遍存在，陽性率甚至高達60%以上[5-6]。CAV在雞群中是水平和垂直傳播的[7]，且不同日齡的雞均容易感染，幼雞感染后會導致嚴重貧血和免疫抑制，甚至死亡。高日齡雞感染后會導致免疫系統(tǒng)受損，從而與禽腺病毒(FADV)、馬立克氏病毒(MDV)等病毒產生混合感染[8]。因存在誘發(fā)多種疾病混合感染與疫苗免疫失敗的風險，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴重的經濟損失。

CAV基因組全長約2.3 kb，為單股負鏈環(huán)狀DNA，共含有3個開放讀碼框，分別編碼主要為結構蛋白的VP1、支架蛋白VP2以及名為凋亡蛋白的非結構蛋白VP3，VP1和VP2是中和抗體的主要靶點[9]。VP1與高度保守的VP2和VP3不同，VP1從氨基酸位點139到151位為高突變區(qū)，這些氨基酸的突變可能直接影響CAV的復制、傳染性及其致病性。因此，VP1通常用于CAV的遺傳進化和分子研究[10]。

由于對近年的分離毒株的致病性研究較少，為進一步了解CAV的流行情況與毒株的致病性，本研究通過PCR檢測，調查了湖北荊州地區(qū)菜市場肉雞感染CAV情況，對CAV全長核苷酸序列和VP1的氨基酸序列進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，分析了CAV的遺傳進化以及VP1蛋白的分子特征，并采用動物回歸試驗分析強毒株JZ2118的致病性，以期更好地了解在我國傳播的CAV的流行病學及分子特征與致病性之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DNA提取試劑盒與pTOPO-BluntT 載體購自北京艾德萊生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Omega公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司；2×Hieff Canace?Plus PCR Master Mix(With Dye)高保真酶預混液與Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix購自翌圣生物科技股份有限公司。

1.2 樣本收集與處理

2021年在湖北荊州地區(qū)6個菜市場收集肉雞雞肝樣品224份，將收集雞肝用高通量組織冷凍研磨儀進行勻漿，研磨后的組織勻漿4 000g離心5 min，取得勻漿上清并參照艾德萊DNA提取試劑盒說明書提取DNA，所提取的DNA儲存于-20 ℃。

1.3 病料中CAV的PCR檢測

根據(jù)GenBank中參考序列NX15091(KY486150)設計1對PCR引物，CIAV All Seq F(5′-GCATTCCGAGTGGTTACTATT-3′)/CIAV All Seq R(5′-GATTGTGCGGTAAAAGCATTT-3′)覆蓋CAV全基因組序列。PCR產物通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像進行分析，并用Omega DNA凝膠回收試劑盒進行回收。

1.4 CAV全基因測序及序列分析

將PCR擴增的CAV全基因片段亞克隆到pTOPO-Blunt T 載體，再轉化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆送至武漢擎科生物技術有限公司進行測序，從而獲得分離毒株的全基因組序列。用MEGA 7軟件對CAV全基因組序列和VP1、VP2、VP3氨基酸序列進行比對和分析，并構建CAV分離株與GenBank中32個已發(fā)表同源性較高的CAV(見表1)全基因序列和VP1氨基酸序列的遺傳進化樹。

表1 參考株序列信息

1.5 動物回歸試驗

將陽性病料雞肝臟提取的DNA，通過PCR擴增對禽腺病毒(FADV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)、網(wǎng)狀內皮細胞增生病病毒(REV)與馬立克氏病病毒(MDV)分別進行檢驗[11]。選取其他病毒檢測為陰性，且含有符合強毒株特征的JZ2118毒株的雞肝用研磨儀進行研磨，研磨后的勻漿4 000g離心5 min，取上清液，用0.22 μm濾器除菌過濾，分離出病毒液。

將孵化的1日齡SPF雛雞分為2組，攻毒組(n=23)與對照組(n=10)。攻毒組每只胸肌注射100 μL(熒光定量檢測：1.15×109病毒拷貝數(shù))JZ2118毒株組織病毒液，對照組以同樣方式注射100 μL生理鹽水，每天觀察精神狀態(tài)及監(jiān)測肛溫體重。感染14 d后采集全血進行血常規(guī)檢測并全部剖檢，測定肝組織CAV的病毒載量及胸腺組織與法氏囊組織的病理切片。

1.6 病毒載量測定

參照北京艾德萊DNA提取試劑盒說明書提取肝臟組織DNA。采用實時熒光定量PCR中絕對定量法檢測組織病毒載量，根據(jù)與JZ2118毒株序列設計引物Prime 2 FP P6D(5′-ACCACCTCAAGCGACTTC-3′)/Prime 2 RP P6D(5′-GCAGCCTCACACTATACG-3′)，擴增CAV基因組序列中長度為123 bp的核苷酸序列，用于標準曲線制作及待檢樣品的檢測。

1.7 血常規(guī)檢測

使用10% EDTA-Na2溶液作為全血的抗凝劑，按照全血與抗凝劑25∶1的比例采集全血，進行血常規(guī)檢測。

1.8 病理組織切片

取胸腺與法氏囊，用4%的多聚甲醛固定液固定，進行石蠟包埋與蘇木精-伊紅染色(HE染色)，再進行顯微觀察。

2 結果與分析

2.1 CAV病原檢測

通過PCR檢測，從收集的224份雞肝樣品中，共檢出18份CAV陽性病料(見圖1)，CAV陽性率為8.04%。檢測的新CAV毒株使用格式PPYYXXX命名，其中PP是采樣位置，YYXXX是樣本來源的時間和順序，毒株命名依次為JZ2101～JZ2118。

注：M為標準分子量DNA Maker；1～18為CAV JZ2101-JZ2118基因條帶檢測；N為陰性對照；P為陽性對照。圖1 全長CAV基因組擴增結果Fig.1 CAV gene band test results

2.2 CAV全基因組序列分析

通過對18個CAV毒株全長基因序列的測序，基因片段的大小均為2 298 bp，與32個參考株的全基因組序列構建遺傳進化樹(見圖2)，遺傳進化樹可分為3個基因群，分別是JZ2101、JZ2103、JZ2104、JZ2106、JZ2107、JZ2109、JZ2116、JZ2118毒株與主要來自廣東、廣西的毒株被歸類于A組，JZ2102、JZ2108、JZ2110、JZ2112、JZ2113、JZ2114毒株與主要來自土耳其、天津的毒株被歸類于B組，JZ2105、JZ2111、JZ2115、JZ2117與主要來自山東、黑龍江的毒株被歸類于C組。國內強毒株GD-103、GD-104及日本強毒株C368全部被歸類于A組，A組中毒株JZ2118、JZ2107與JZ2109與3株強毒株親緣關系最近，與3株強毒株的核苷酸序列同源性為98.9%～99.4%。

圖2 CAV全基因組進化樹分析Fig.2 Phylogenic tree analysis of the CAV complete genome

2.3 CAV的VP1、VP2、VP3序列分析

根據(jù)GenBank獲得參考株與18個毒株的VP1、VP2、VP3核苷酸序列，18個毒株的VP1、VP2、VP3的核苷酸序列大小分別為1 350、651、366 bp，與參考序列相比未發(fā)現(xiàn)插入或缺失。18個毒株的VP1的同源性為96.1%～99.9%，VP2的同源性為98.9%～100%，VP3的同源性為99.7%～100%，VP2和VP3都非常保守，主要核苷酸突變發(fā)生在VP1蛋白的編碼區(qū)。

用MEGA 7軟件對VP1、VP2與VP3蛋白的核苷酸序列進行翻譯和比對，結果表明，18個毒株的VP1有36個氨基酸位點發(fā)生替換，VP2有4個氨基酸位點發(fā)生替換，VP3未發(fā)生氨基酸替換。VP1蛋白有15個位點的突變頻率較高，突變信息如表2所示，其他突變頻率較低的位點是F12L、P14A、V107E、G137V、A164S、W168C、L170V、M157L、D177H、N183S、G194V、K216R/T、G231E、D239A、V240I、Y242S、H246L、V436I、Y444S；VP2蛋白發(fā)生4個氨基酸替換，分別為E24G、N36D、F170Y、R205K，且均為JZ2101毒株的氨基酸替換。

表2 新分離株的VP1蛋白中的主要氨基酸差異

VP1氨基酸序列進化樹(見圖3)也分為3個組群，JZ2101、JZ2103、JZ2104、JZ2106、JZ2107、JZ2109、JZ2116、JZ2118與主要來自廣東、廣西的毒株被歸類于A組，JZ2105、JZ2111、JZ2115、JZ2117與主要來自山東、黑龍江的毒株被歸類于C組，JZ2102、JZ2108、JZ2110、JZ2112、JZ2113、JZ2114與主要來自土耳其毒株被歸類于B組，分組結果幾乎與全基因序列的進化樹相同，說明了CAV的遺傳進化主要與VP1蛋白的氨基酸突變有關。VP1氨基酸序列進化樹中的A組與C組分離毒株中氨基酸位點75V、89T、125L、139K、141Q、144E、394Q與國內強毒株GD-103、GD104株及日本強毒株C368全部一樣，表明A組和C組中的毒株均符合強毒株特征。尤其A組中的分離毒株可能與這3株強毒株具有相似的致病性。

圖3 CAV VP1氨基酸序列進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of CAV VP1 amino acid sequence

2.4 JZ2118毒株的致病性分析

1日齡SPF雛雞攻毒10 d后開始出現(xiàn)精神萎靡、羽毛蓬松、體重下降等臨床癥狀；在攻毒第11 d開始出現(xiàn)死亡，并出現(xiàn)肛溫先升高后下降的現(xiàn)象。在感染14 d后，攻毒組23只，死亡19只，僅4只存活，致死率高達82.6%，對照組全部存活(見圖4(a))。

注：*表示具有顯著性差異(P<0.05)，** 表示具有極顯著性差異(P<0.01)。圖4 對照組與攻毒組生存曲線、肛溫、體重、病毒載量的比較Fig.4 Comparation of the survival curve，temperature，body weight，viral load of liver tissueof the control group and the challenge group

根據(jù)每日肛溫監(jiān)測，剛孵化的1日齡SPF雛雞肛溫在(39.21±0.56)℃左右，隨著日齡的增長肛溫逐漸上升，逐漸穩(wěn)定在41.5 ℃左右(見圖4(b))，而攻毒組的雞在死亡的前2 d肛溫會出現(xiàn)升高，升到42 ℃以上，甚至43 ℃以上；剛孵化的1日齡雛雞體重一般在(38.03±2.21)g，對照組雞的體重在2周內不斷增加，2周后能達到100 g以上，而攻毒組雞的體重在感染10 d左右開始出現(xiàn)下降或增長緩慢(見圖4(c))，2周后體重降到70 g以下。

通過熒光定量PCR獲得的標準曲線方程為Ct=-3.327lgN+37.677，式中：Ct為閾值循環(huán)數(shù)，N為病毒拷貝數(shù)，相關系數(shù)R2=0.992，擴增效率為99.8%，計算得出對照組每毫克肝組織的病毒拷貝數(shù)約為102，攻毒組每毫克肝組織病毒拷貝數(shù)約為107，對攻毒組與對照組每毫克肝組織病毒拷貝數(shù)的對數(shù)值用獨立樣本t檢驗進行統(tǒng)計分析(見圖4(d))，即兩組具有極顯著性差異(P<0.01)。

由采集全血的血常規(guī)檢測結果(見表3)可知，對照組與攻毒組的白細胞(WBC)數(shù)目、紅細胞(RBC)數(shù)目、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細胞壓積(HCT)、平均紅細胞血紅蛋白濃度(MCHC)、淋巴細胞數(shù)目(Lym)、中性粒細胞(Neu)數(shù)目、中性粒細胞比例、淋巴細胞(Lym)比例、嗜酸性粒細胞(EOS)數(shù)目通過獨立樣本t檢驗分析均具有極顯著性差異(P<0.01)。其中RBC數(shù)目、HGB、HCT與MCHC下降表明攻毒組出現(xiàn)了嚴重的貧血，WBC數(shù)目與Neu比例下降表明雞受到了病毒感染，Lym比例下降說明雞感染后對其造成了免疫缺陷，EOS數(shù)目下降說明雞發(fā)生了再生障礙性貧血。

表3 血常規(guī)檢測結果

通過對胸腺組織與法氏囊組織的病理切片的結果來看，圖5(a)中對照組胸腺皮質與髓質界限分明，皮質有大量的淋巴細胞，而圖5(b)中攻毒組胸腺皮質與髓質的界限消失，皮質內淋巴細胞嚴重減少，且并伴有出血癥狀，胸腺結構破壞嚴重；圖5(c)中對照組的法氏囊濾泡與濾泡之間緊密相接，且濾泡內有較多的淋巴細胞，而圖5(d)中攻毒組的法氏囊發(fā)生濾泡萎縮，濾泡之間間隙增大，且淋巴細胞數(shù)量減少，表明雛雞感染CAV后免疫系統(tǒng)被嚴重破壞，從而發(fā)生免疫抑制。

圖5 感染14日雞的胸腺與法氏囊HE染色結果Fig.5 Results of thymus with bursal HE staining in chickens infected on 14 days

3 討論

有研究表明，VP1蛋白的第394位氨基酸是毒力的主要遺傳決定因素，谷氨酰胺(Q)和組氨酸(H)分別代表高和低致病性，以及毒力衰減的其他突變(75I、125I、139Q和144Q)[12]。其中18株CAV毒株的VP1蛋白的394位氨基酸均為谷氨酰胺(Q)，且JZ2101、JZ2103、JZ2104、JZ2105、JZ2106、JZ2107、JZ2109、JZ2111、JZ2115、JZ2116、JZ2117、JZ2118都具有75V、89T、125L、141Q和144E的組合，表明都不具有減毒特征，且與已經鑒定過為強毒株的AV1550株、GD-103株、GD-104株、C368株的第75、89、125、141、144氨基酸位點相同[13-14]。本研究中，荊州地區(qū)肉雞中CAV的感染率為8.04%，雖然低于近年來其他地區(qū)調查的感染率12.5%～25.69%，但在18株的CAV毒株中有12株符合強毒株特征，強毒株占66.7%，說明荊州地區(qū)流行CAV毒株多為強毒株。而且其中JZ2118毒株經過動物回歸試驗也證明具有較強的致病性，推測另外11株可能具有同樣較強的致病性。

TODD等[15]研究表明，如果VP1蛋白位點第75、89、125、141和144位同時發(fā)生氨基酸突變，即使在第394位氨基酸為谷氨酰胺(Q)，雞感染CAV后也不會導致貧血、白骨髓和胸腺萎縮。本研究中JZ2102、JZ2108、JZ2110、JZ2112、JZ2113、JZ2114毒株都發(fā)生75I、125I、139Q和144Q的突變。TODD等[16]將Cuxhaven-1 CAV在173次細胞培養(yǎng)傳代后獲得克隆的減毒CAV分離物，在幼雞傳代10次后恢復了致病性，其中VP1蛋白的第287位氨基酸從丙氨酸(A)變?yōu)樘於彼?D)。而JZ2102、JZ2108、JZ2110、JZ2112、JZ2113、JZ2114毒株的第287位氨基酸均為丙氨酸(A)，推測這6株毒株很可能為減毒毒株。

王林等[17]研究表明，1日齡與7日齡的SPF雞比21日齡更容易感染CAV，且肌肉注射比口服的致病性更強。本研究中，1日齡肌肉注射的攻毒方法致死率達到82.6%，在感染的10～14 d達到致病的關鍵期，從各項臨床癥狀及相關病理變化體現(xiàn)了分離株JZ2118的高致病性。本研究進一步了解了CAV的遺傳進化及分子特征與致病性之間的聯(lián)系，驗證符合強毒株特征的JZ2118毒株的確具有高致病性。后續(xù)研究需要對CAV作進一步的分子和病原特征分析，以找出它們之間的變異，這將有助于相關疫苗的研發(fā)以及制定適當?shù)目刂撇呗?，防止家禽業(yè)的損失。