陳翠平, 徐紅霞, 董 帥, 文正瑩, 賓良芫, 閆 婕, 裴 瑾

(西南特色中藥資源國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 成都 611137)

中藥種質(zhì)資源是中藥種業(yè)的“芯片”,是新品種選育的物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥種質(zhì)資源的保護(hù)和高效利用可以大力促進(jìn)中藥的質(zhì)量提升和推動(dòng)產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展[1]。低溫種子庫貯藏是目前中藥種質(zhì)資源貯藏的主要方式,低溫種質(zhì)的安全保存是低溫種子庫最重要的基礎(chǔ)任務(wù)。如何延長壽命、維持遺傳完整性和防止生活力意外喪失一直是種質(zhì)安全保存的研究難點(diǎn)和熱點(diǎn)[2]。種質(zhì)資源的安全保存受諸多因素的影響,包括貯藏前的種子質(zhì)量(如種子的成熟度、健康度、生活力等);貯藏方法(如種子貯藏前處理方法、種子出入庫溫度變化情況等);種子貯藏條件(如種子含水量、貯藏溫度等);種子儲(chǔ)藏時(shí)間(如種子衰老拐點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)間、種子生活力喪失時(shí)間等)。

低溫種質(zhì)資源庫按貯藏條件分類,主要有長期庫、中期庫、短期庫及超低溫庫,技術(shù)參數(shù)分別為溫度-18 ℃、RH<50%,溫度-4 ℃、RH<65%,溫度4～15 ℃、RH<65%,-80 ℃以下條件,通常是液氮的液相(-196 ℃)、霧相(-150 ℃)或超低溫冰箱[3-4]。出入庫溫度變化對(duì)種質(zhì)生活力等指標(biāo)的影響主要集中在液氮超低溫貯藏,超低溫保存出入庫溫度變化依據(jù)保存原理主要有快速和梯度兩種?？焖贉囟茸兓饕诓ＡЩ?在低含水量和低溫條件下,減小細(xì)胞內(nèi)自由水,達(dá)到玻璃化狀態(tài),能抑制細(xì)胞內(nèi)有害化學(xué)反應(yīng)的發(fā)生[5-6],如快速投入液氮冷凍、40 ℃水浴快速解凍,含水量27.5%的肉豆蔻種子生活力最高,含水量10%的人參裂開種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、成苗率均最高[7-8];梯度溫度變化即采用逐步降溫方法,可使細(xì)胞內(nèi)水分流到細(xì)胞外結(jié)冰,降低細(xì)胞內(nèi)水分含量,避免胞內(nèi)冰晶傷害[9],如使用梯度降溫入庫、40 ℃水浴快速解凍出庫,含水量7%的九里香種子保存效果最佳[10],使用室溫緩慢解凍較42 ℃水浴快遞解凍,馬尾松種子的發(fā)芽率更高[11]。目前,未見出入庫溫度變化對(duì)長期庫、中期庫、超低溫冰箱貯藏種子的生活力及耐儲(chǔ)性影響的報(bào)道。

菊科植物紅花(CarthamustinctoriusL.)是一種多用途的經(jīng)濟(jì)作物[12],其花入藥,是常用的活血化瘀中藥;種子及紅花籽油可藥用或油用,含不飽和脂肪酸,營養(yǎng)價(jià)值高[13-14]。目前全世界有超過60個(gè)國家和地區(qū)開展紅花的種植。本研究以正常型紅花種子為研究對(duì)象,以生活力、可溶性糖、可溶性蛋白、電導(dǎo)率及酶活性等生理生化指標(biāo)為檢測(cè)指標(biāo),探索長期庫、中期庫、超低溫冰箱保存紅花種子時(shí),出入庫溫度變化對(duì)種子的生活力及耐儲(chǔ)性的影響,為紅花種子的低溫貯藏篩選適宜的出入庫方法,為正常型種子出入庫保存提供參考。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料收購于新疆裕民縣振東道地紅花開發(fā)有限公司,經(jīng)課題組鑒定為菊科植物紅花的種子,含水量為8%、初始發(fā)芽率為89.0%。試驗(yàn)前種子置于陰涼通風(fēng)處。

1.2 試驗(yàn)儀器

電導(dǎo)率儀(DDS-11A型,雷磁),酶標(biāo)儀(FLASH,Thermo),臺(tái)式離心機(jī)(HITACHI CT15RE,日立),冷凍干燥機(jī)(寧波市雙嘉儀器有限公司),0.01 mg感量電子天平(Sartoius,SQP SECURA2250-1CN),IKA研磨機(jī)(A11,廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司),光照培養(yǎng)箱(GTOP系列,浙江托普儀器有限公司)等。

1.3 試劑試藥

植物可溶性糖含量檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白法含量測(cè)試盒、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)等,試劑盒均購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 樣品制備

2.1.1種子的包裝與貯藏

將紅花種子密封,貯藏于不同溫度下:中期庫(-4±2)℃、長期庫(-18±2)℃和超低溫冰箱(-75±5)℃,凍存1個(gè)月后取出,對(duì)樣品進(jìn)行發(fā)芽指標(biāo)、可溶性糖及可溶性蛋白等生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

2.1.2出入庫溫度變化情況

參照馬千全等[9]的方法,結(jié)合國家中藥種質(zhì)資源庫的實(shí)際情況,設(shè)定紅花種子貯藏的出入庫溫度變化條件,如表1。

表1 紅花種子貯藏條件Table 1 Storage conditions of Carthamus tinctorius L.

2.2 發(fā)芽和成苗指標(biāo)的測(cè)定

參照GB/T 3543—1995《國家種子檢驗(yàn)規(guī)程》[15]技術(shù)規(guī)定的發(fā)芽方法進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。隨機(jī)選取50粒種子,置于鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中,放置在光照培養(yǎng)箱中,發(fā)芽條件:(25±2)℃,16 h光照,8 h黑暗。4次重復(fù),第7天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率[16]。計(jì)算公式如下:

發(fā)芽率/%=(發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%;

發(fā)芽勢(shì)/%=(2 d發(fā)芽種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%;

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt),其中:Gt為t天后的發(fā)芽數(shù),Dt為發(fā)芽天數(shù);

成苗率/%=(成苗種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù))×100%。

以根系和葉片發(fā)育正常的幼苗為成苗計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3 種子浸出液電導(dǎo)率的測(cè)定

電導(dǎo)率參照尹燕枰和董學(xué)會(huì)[17]的方法測(cè)定,隨機(jī)稱取凈種子20粒,稱重,用去離子水沖洗2次,定性濾紙吸干浮水,然后放入100 mL錐形瓶中,加入50 mL去離子水,用電導(dǎo)率儀測(cè)定初始電導(dǎo)值(d1);20 ℃ 條件下浸泡24 h,測(cè)定浸出液電導(dǎo)值(d2);然后連同種子的浸泡液在沸水中煮35～40 min,冷卻至20 ℃后,加去離子水定容至煮沸前的體積,測(cè)定煮沸后種子浸出液的絕對(duì)電導(dǎo)值(d3),4 次重復(fù)。計(jì)算公式如下:

相對(duì)電導(dǎo)率/%=[(d2-d1)/(d3-d1)]×100%

2.4 種子可溶性糖、可溶性蛋白含量及抗氧化酶系統(tǒng)活性測(cè)定

分別按照試劑盒說明書進(jìn)行操作,測(cè)定紅花種子中可溶性糖、可溶性蛋白含量以及SOD、POD、CAT的活性,每個(gè)指標(biāo)檢測(cè)重復(fù)4次。

2.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS20.0軟件分析處理數(shù)據(jù),使用Origin軟件作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 出入庫溫度變化對(duì)紅花種子發(fā)芽率的影響

如表2所示,中期庫貯藏紅花種子的發(fā)芽率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,長期庫、超低溫冰箱貯藏紅花種子發(fā)芽率有顯著性差異,在快速降溫入庫和快遞升溫出庫條件下,種子發(fā)芽率最高。

表2 不同出入庫溫度變化紅花種子生活力及生理生化指標(biāo)變化Table 2 Changes of seed viability and physiological and biochemical indexes of Carthamus tinctorius L. with different temperature variation in and out of storage

3.2 出入庫溫度變化對(duì)紅花種子相對(duì)電導(dǎo)率的影響

如表2所示,貯藏于中期庫和長期庫的紅花種子,各組間的相對(duì)電導(dǎo)率變化無明顯差異;貯藏于超低溫的紅花種子,出入庫溫度變化造成種子相對(duì)電導(dǎo)率具有顯著性差異,快速降溫入庫和快速升溫出庫種子的相對(duì)電導(dǎo)率最低。

3.3 出入庫溫度變化對(duì)紅花種子可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

如表2所示,貯藏于中期庫的紅花種子可溶性糖和可溶性蛋白含量無明顯差異;貯藏于長期庫的紅花種子可溶性糖含量無明顯差異,可溶性蛋白含量在入庫時(shí)梯度降溫和出庫時(shí)梯度升溫含量最高,具有顯著性差異;貯藏于超低溫的紅花種子在入庫時(shí)快速降溫、出庫時(shí)快速升溫其可溶性糖和可溶性蛋白含量最高。

3.4 出入庫溫度變化對(duì)紅花種子抗氧化酶活性的影響

如表2所示,貯藏于中期庫和長期庫的紅花種子,其抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性在各處理?xiàng)l件下無明顯差異。貯藏于超低溫的紅花種子各處理組間則有顯著性差異,SOD活性在入庫時(shí)快速降溫和出庫時(shí)快速升溫處理下較低,POD和CAT活性則較高,對(duì)處于超低溫的紅花種子來說,入庫時(shí)快速降溫和出庫時(shí)快速升溫方式較為安全。

3.5 不同出入庫溫度對(duì)紅花種子各生理指標(biāo)的影響

SPSS20.0軟件處理不同出入庫溫度變化下,貯藏1個(gè)月后紅花種子的10個(gè)檢測(cè)指標(biāo)相關(guān)系數(shù)矩陣,Origin軟件作圖,結(jié)果如圖1所示?？梢?種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、POD活性、可溶性蛋白呈顯著正相關(guān),與電導(dǎo)率呈顯著負(fù)相關(guān);成苗率與發(fā)芽勢(shì)呈顯著正相關(guān);可溶性糖與可溶性蛋白、POD活性呈顯著正相關(guān),與SOD活性呈顯著負(fù)相關(guān);CAT活性與可溶性蛋白及POD活性呈顯著正相關(guān)。

圖1 各監(jiān)測(cè)指標(biāo)的Pearson相關(guān)分析 Fig.1 Pearson correlation of each monitoring index

將不同出入庫溫度變化下,貯藏1個(gè)月后紅花種子的10個(gè)檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行PCA分析,結(jié)果見圖2。可知,長期庫及中期庫貯藏紅花種子組間差異較小;而超低溫冰箱貯藏紅花種子組間差異極大,其中,入庫時(shí)快速降溫及出庫時(shí)快速升溫是最適宜紅花種子的出入庫溫度處理方法,在此方法下紅花種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)、成苗率、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、POD活性、CAT活性最高,相對(duì)電導(dǎo)率及SOD活性最低。

圖2 主成分二維圖Fig.2 Principal component two-dimensional diagram

4 討 論

目前長期庫貯藏種子在出入庫時(shí),常采用梯度降溫和梯度升溫的方式,如國家作物種質(zhì)資源庫、中國西南野生生物種質(zhì)資源庫、國家中藥種質(zhì)資源庫使用短期庫(溫度4 ℃、RH<65%)4 ℃或雙十五干燥間(溫度15 ℃、RH=15%)作為緩沖,入庫時(shí)將種子置于干燥間干燥后貯藏長期庫、中期庫,出庫時(shí)置于短期庫或干燥間放置24 h后取出。

本研究檢測(cè)了中期庫(-4±2)℃、長期庫(-18±2)℃及超低溫冰箱(-75±5)℃不同出入庫溫度變化下,紅花種子的生活力指標(biāo)、耐儲(chǔ)性指標(biāo)及生理生化指標(biāo),結(jié)果表明,中期庫貯藏種子各指標(biāo)無顯著性差異、長期庫貯藏種子的發(fā)芽率和可溶性蛋白含量開始出現(xiàn)顯著差異,而超低溫冰箱貯藏種子各指標(biāo)均出現(xiàn)顯著差異性?？扇苄缘鞍?、可溶性糖含量等細(xì)胞內(nèi)含物能提高植物的脫水耐性,降低過冷卻點(diǎn),增強(qiáng)玻璃化能力[22],本研究發(fā)現(xiàn),使用速凍速解超低溫保存紅花種子的可溶性糖、可溶性蛋白含量最高,長期庫梯度冷凍和梯度解凍的紅花種子可溶性蛋白含量最高,與其他出入庫方法相比具有顯著性差異?？梢?隨著貯藏溫度的降低,種子生活力及耐儲(chǔ)性指標(biāo)受出入庫溫度變化的影響越大。

超低溫貯藏種子時(shí),不同物種適宜的出入庫溫度變化情況存在較大差異,如肉豆蔻[7]、人參[8]、東北紅豆杉[18]、馬尾松[11]、益智[19]、海南龍血樹[20]等種子適合快速冷凍,夏枯草及皺果莧[21]、樟[22]、九里香[10]、豬屎豆[23]等種子適合梯度或緩慢冷凍,肉豆蔻[7]、人參[8]、海南龍血樹[20]、石香竹[24]、胡楊[25]、韭菜、大蔥、韭蔥及洋蔥[26]等種子適合快速解凍方法,樟[22]、九里香[10]、玉蟬花[27]等種子適合梯度或緩慢解凍。因此,不同物種種子在長期庫、超低溫貯藏時(shí),應(yīng)當(dāng)考察出入庫溫度變化對(duì)種子生活力的影響。

此外,超低溫保存對(duì)部分種子發(fā)芽率有“刺激”作用,經(jīng)超低溫凍存后種子發(fā)芽率有所提高,如馬尾松[11]及毛竹[28]等。本研究中除超低溫冰箱使用速凍梯解或梯凍梯解方法外,其他出入庫溫度變化情況下,紅花種子在中期庫、長期庫及超低溫冰箱中保存1個(gè)月均有促進(jìn)紅花種子萌發(fā)的作用,發(fā)芽率均高于初始發(fā)芽率(89%),但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。