亢燕，王耀輝，牛天慧，滕哲，祁智，楊佳

（內(nèi)蒙古大學(xué)牧草與特色作物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070）

羊草（Leymus chinensis）屬于小麥族（Triticeae）賴草屬（Leymus），是多年生禾草。羊草是我國(guó)重要的鄉(xiāng)土植物，廣泛分布在我國(guó)北方草原，具有較高的飼用價(jià)值、生態(tài)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。以羊草為主的草場(chǎng)是優(yōu)質(zhì)天然放牧場(chǎng)和割草場(chǎng)。羊草的研究始于1974 年，主要集中在種質(zhì)資源、栽培和生物學(xué)特性等方面[1］。牧草礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)直接影響牧草和草原家畜的產(chǎn)量和質(zhì)量，進(jìn)而影響草原的生產(chǎn)力。然而關(guān)于羊草礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收的分子調(diào)控機(jī)理研究較少。影響植物礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收主要有兩個(gè)因素，一是外在因素，即土壤的礦質(zhì)元素含量。已有研究發(fā)現(xiàn)外源施加微肥即鋅、銅、硼、鉬等可以顯著提高羊草干草的質(zhì)量和產(chǎn)量，增產(chǎn)高達(dá)近50%[2］；氮結(jié)合鉀、硫、鋅、銅可以促進(jìn)羊草生長(zhǎng)[3］；二是內(nèi)在因素，即植物體內(nèi)的礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和相關(guān)調(diào)控因子[4-5］。在羊草中已發(fā)現(xiàn)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LcZNE1，具有鋅結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)功能，參與響應(yīng)高鋅和低鐵條件[4］。

鋅鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（zinc-regulated transporter/iron-regulated transporter-like proteins，ZIP）在古菌、細(xì)菌、真菌、植物和哺乳動(dòng)物中廣泛存在，負(fù)責(zé)金屬二價(jià)陽(yáng)離子如Zn2+、Fe2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+和Cd2+等的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[5］。其中Fe、Zn、Cu、Mn 和Ni 是必需微量元素，其作為酶結(jié)構(gòu)的一部分或輔因子介導(dǎo)植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝[6］。Fe 具有氧化還原作用，在光合作用和呼吸作用的電子傳遞鏈中起著重要作用，參與氮同化、激素合成、活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除以及生物脅迫響應(yīng)等[6-7］。Zn 是多種酶的組成部分和輔因子，與維持生物膜的結(jié)構(gòu)完整、蛋白質(zhì)合成以及種子發(fā)育等相關(guān)[6］。預(yù)計(jì)有1200 多種蛋白質(zhì)內(nèi)包含Zn2+、結(jié)合Zn2+或運(yùn)輸Zn2+，這些蛋白包括鋅指蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、氧化還原酶和水解酶等。

目前，ZIP 家族在模式植物和農(nóng)作物中受到越來(lái)越多的關(guān)注，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）[8-9］、煙草（Nicotiana tabacum）[10］、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）[11］、野生二粒小麥（Triticum turgidumssp. dicoccoides）[12］、大麥（Hordeum vulgare）[13］、谷子（Setaria italica）[14］、水 稻（Oryza sativa）[15-16］、玉米（Zea mays）[17］、大豆（Glycine max）[18］、菜豆（Phaseolus vulgaris）[19］、葡萄（Vitis vinifera）[20］和臍橙（Citrus sinensis）[21］。目前Zn2+和Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能鑒定的主要手段是通過(guò)離子轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷酵母突變體功能互補(bǔ)驗(yàn)證，常使用的突變體為Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷突變體（?zrt1/?zrt2、?zrc1/?cot1）和Fe2+吸收缺陷突變體（?fet3/?fet4）。在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)，AtZIP1、AtZIP2、AtZIP3、AtZIP7、AtZIP11 和AtZIP12 能夠使酵母的Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺陷突變體（?zrt1/?zrt2）恢復(fù)Zn2+吸收功能，AtZIP7 也能使酵母的Fe2+吸收缺陷突變體（?fet3/?fet4）恢復(fù)Fe2+吸收功能。這些結(jié)果證明了AtZIP 的Zn2+或Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能[8-9］。此外還發(fā)現(xiàn)，水稻OsZIP1 能使酵母鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白缺失突變體?zrc1在高鋅條件下正常生長(zhǎng)，從而證明OsZIP1 具有鋅轉(zhuǎn)運(yùn)功能。已有研究表明，OsZIP1在過(guò)量的鋅、銅和鎘的條件下被誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜上，阻止水稻中過(guò)量的鋅、銅和鎘積累[16］。

目前關(guān)于羊草ZIP 家族成員的表達(dá)、定位和功能的研究鮮有報(bào)道。羊草ZIP 家族成員的挖掘可為了解羊草微量元素吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)理以及對(duì)日后禾本科作物遺傳改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料和培養(yǎng)

將野生羊草種子（于2018 年采集自內(nèi)蒙古和林格爾縣）置于無(wú)菌水中，4 ℃處理3 d 后，收集飽滿種子進(jìn)行表面消毒（浸入5% NaClO+0.1% Triton X-100 中，置于搖床150 r·min-1震蕩2 h 后用無(wú)菌水洗3~5 次）。此后將無(wú)菌的羊草種子點(diǎn)播于MQA-CK 培養(yǎng)基（5 mmol·L-1KNO3、1 mmol·L-1CaCl2、1 mmol·L-1MgSO4、1 mmol·L-1H3PO4、1/2 MS Fe 鹽、1/2 MS 微量、5 mmol·L-14-嗎啉乙磺酸、1%蔗糖、1%瓊脂糖，pH 5.7[22］）。將培養(yǎng)基置于生長(zhǎng)室，黑暗中培養(yǎng)5 d 后進(jìn)行光照培養(yǎng)（光強(qiáng)度：100 μmol·m-2·s-1；光周期：12 h 光照/12 h 黑暗；溫度：22~25 ℃）。

1.2 生物信息學(xué)分析

用“zinc”“zinc transporter”或“Zn2+”在野生羊草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定）中篩選注釋為鋅相關(guān)的基因，最后篩選到Lc206852。通過(guò)植物基因組網(wǎng)站（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）中BLAST 查找Lc206852的同源蛋白，基于Lc206852 及同源蛋白利用https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw 進(jìn)行多重比較并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹。利用TMHMM（http：//www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進(jìn)行跨膜域預(yù)測(cè)。

1.3 亞細(xì)胞定位

將光照培養(yǎng)7 d 的羊草幼苗速凍研磨，利用TransZol Up Plus RNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取RNA，使用Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus） （上海翊圣生物科技有限公司）合成cDNA 并去除基因組DNA。利用引物L(fēng)cZIP1-GFP_F-5′-CGGGGTACCATGGCAGCAGCCA GTCTCAAG-3′和LcZIP1-GFP_R-5′-CCGCTCGAGGGTGCCCATACGGCAAGCATTGAC-3′（加粗字母為限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，分別為KpnⅠ和XhoⅠ），使用大連寶生物工程有限公司的PrimeSTAR HS DNA 聚合酶從羊草cDNA 中擴(kuò)增不含終止密碼子的Lc206852全長(zhǎng)編碼序列。通過(guò)TA 克隆將PCR 產(chǎn)物連接到pEASYBlunt Simple Cloning Vector（北京全式金生物技術(shù)有限公司）后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的Lc206852連接到pENTR 3C（Thermo Fisher）的KpnⅠ和XhoⅠ位點(diǎn)，通過(guò)Gateway 克隆將不含終止子的Lc206852連接到植物雙元表達(dá)載體pGWB605[23］的花椰菜花葉病毒（cauliflower mosaic virus，CaMV）35S 啟動(dòng)子下游，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）編碼基因上游，最后將pGWB605-Lc206852轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。將轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌和含內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白ER mcherry CD3-959 的農(nóng)桿菌（購(gòu)自擬南芥生物資源中心）共同注射到本氏煙草葉片下表皮[4，24］。同時(shí)采用聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）介導(dǎo)法將重組質(zhì)粒pGWB605-Lc206852轉(zhuǎn)入羊草葉原生質(zhì)體[4，25］。

采用蔡司LSM 710 共聚焦顯微鏡（德國(guó)）和LSM880 超高分辨率共聚焦顯微鏡（德國(guó)）觀察GFP 和mCherry熒光。

1.4 熒光定量PCR

將光照培養(yǎng)7 d 的羊草幼苗移入MQA-CK 液體培養(yǎng)液中，生長(zhǎng)14 d 后置于含不同濃度鋅和鐵的MQA-CK 液體培養(yǎng)液中處理2 d。處理液分別為：對(duì)照（MQA-CK）、缺鋅（不含Zn2+的MQA，即MQA-Zn2+）、高鋅（MQA+150 μmol·L-1Zn2+）、缺鐵（不含F(xiàn)e2+的MQA，即MQA-Fe2+）和高鐵（MQA+500 μmol·L-1Fe2+）。參照1.3 分別提取羊草葉和根的總RNA 并合成cDNA。以cDNA 為模板，使用上海翊圣生物科技有限公司的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒Hieff UNICON Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix 和TOWER 2.2 熒光定量梯度PCR 儀（德國(guó)）進(jìn)行qRT-PCR 分析，重復(fù)3 次。qRT-PCR 擴(kuò)增引物為L(zhǎng)cZIP1-RT_F-5′-CGTCGACACCATCGCCACGG-3′，LcZIP1-RT_R-5′-CACCGAGTGCACTATGATCCCCAGC-3′。以LcACTIN2作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt算法[4］分析該基因的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增體系：總體積為20.0 μL，其中Hieff UNICON? Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（1×）：10.0 μL；上游引物（0.2 μmol·L-1）：0.4 μL；下游引物（0.2 μmol·L-1）：0.4 μL；cDNA（200 ng·μL-1）：1 μL；ddH2O：8.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性10 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序?yàn)?0~95 ℃，每15 s 升溫1 ℃。

1.5 酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)

使用引物L(fēng)cZIP1-pYUL2_F-5′-GCTCTAGAATGGCAGCAGCCAGTCTCAAGC-3′；LcZIP1-pYUL2_R-5′-CCCAAGCTTTCATGCCCATACGGCAAGCATTGAC-3′（加粗字母分別為XbaⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)）和PrimeSTAR HS DNA 聚 合 酶（Takara，大 連）將Lc206852克隆入酵母表達(dá)載體pYUL2，利 用Yeast Transformation System 2（CLONTECH）轉(zhuǎn)化高鋅敏感酵母突變體?zrc1/?cot1（BY4741，MATa zrc1：：Ura1 cot1HIS，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)林會(huì)副教授惠贈(zèng)）。利用引物L(fēng)cZIP1-pFL61_F-5′-ATTTGCGGCCGCGGTACC ATGGCAGCAGCCAGTCTCAAG-3′和LcZIP1-pFL61_R-5′-ATTTGCGGCCGCTCATGCCCATACGGC AAGCATTG-3′（加粗字母分別為KpnⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增Lc206852，將Lc206852克隆入酵母表達(dá)載體pFL61。利用上述方法轉(zhuǎn)化低鋅敏感酵母突變體?zrt1/?zrt2（ZHY3；MATα ade6 can1 his3 leu2 trp1 ura3 zrt1：：LEU2 zrt2：：HIS3）和低鐵敏感酵母突變體?fet3/?fet4（DEY1453；MATa can1his3leu2trp1 ura3?fet3：：HIS3?fet4：：LEU2）（由美國(guó)Missouri 大學(xué)David Eide 教授惠贈(zèng)）。將轉(zhuǎn)基因酵母的OD600值調(diào)至1.0，然后進(jìn)行梯度稀釋，分別為10-1、10-2、10-3、10-4。取10 μL 不同濃度的菌液點(diǎn)樣于含高鋅[（YPD 培養(yǎng)基：蛋白胨2 g，酵母提取物1 g，加水定容至95 mL，瓊脂粉2 g，121 ℃滅菌20 min，待溶液冷卻后加入40 %無(wú)菌葡萄糖5 mL）+7 mmol·L-1ZnCl2，pH 6.5］、低鋅（YPD 培養(yǎng)基+1 mmol·L-1乙二胺四乙酸+50 μmol·L-1ZnCl2，pH 6.5）和低鐵[（SD-Ura 培養(yǎng)基：Minimal SD Base 2.67 g，-Ura DO Supplement 0.077 g 于蒸餾水中充分溶解，定容至100 mL，瓊脂粉2 g，121 ℃滅 菌20 min）+50 mmol·L-1MES+50 μmol·L-1紅 菲 繞 啉 二 磺 酸 （Bathophenanthrolinedisulfonic acid disodium salt hydrate，BPDS），pH 為5.5］的酵母培養(yǎng)基上。30 °C 暗培養(yǎng)3~4 d 后觀察并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lc206852 同源蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析和跨膜域分析

通過(guò)Phytozome 中的BLAST 分析，發(fā)現(xiàn)Lc206852 與擬南芥AtZIP1 同源，因此將其命名為L(zhǎng)cZIP1。選取親緣關(guān)系較近的禾本科5 屬8 種植物的ZIP1 同源蛋白進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，發(fā)現(xiàn)LcZIP1 與禾本科短柄草屬（Brachypodiumspp.）的Brachypodium stacei和二穗短柄草（Brachypodium distachyon）親緣關(guān)系最近（圖1A）?？缒び蚍治霭l(fā)現(xiàn)羊草LcZIP1 含347 個(gè)氨基酸，有9 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain，TM），其中膜內(nèi)和膜外各有5 個(gè)非跨膜域短肽（圖1B）。高粱（Sorghum bicolor）、柳枝稷（Panicum virgatum）、狗尾草（Setaria viridis）、谷子、二穗短柄草和B. stacei含9 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，羊草LcZIP1 與其結(jié)構(gòu)類似；而哈氏黍（Panicum hallii）與LcZIP1 不同，其只含7 個(gè)跨膜域，其中第5 和6 個(gè)跨膜域缺失，第4 個(gè)跨膜域之后的非細(xì)胞質(zhì)面非跨膜域短肽長(zhǎng)度長(zhǎng)于LcZIP1（圖1C）。ZIP1 在不同的植物中存在一定程度的變異。

圖1 LcZIP1 同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生分析和跨膜域Fig.1 Phylogenetic analysis and transmembrane domains of LcZIP1 homologues

2.2 LcZIP1 亞細(xì)胞定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

觀察煙草下表皮細(xì)胞異源共表達(dá)LcZIP1-GFP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白發(fā)現(xiàn)，LcZIP1 的綠色熒光呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白的紅色熒光同樣呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并且綠色熒光和紅色熒光融合，呈黃色熒光，表明在煙草細(xì)胞中LcZIP1 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖2A）。觀察LcZIP1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白在羊草葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體中的共表達(dá)也發(fā)現(xiàn)，LcZIP1 的綠色熒光也和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)記蛋白的紅色熒光融合（圖2B），表明LcZIP1 定位于羊草葉肉細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。

圖2 LcZIP1 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Fig. 2 LcZIP1 was located in endoplasmic reticulum

2.3 LcZIP1 響應(yīng)高鋅、低鐵和高鐵條件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明，LcZIP1在羊草根和葉中均有表達(dá)。在缺鋅條件下，LcZIP1在根和葉中的表達(dá)量無(wú)顯著差異。在高鋅、缺鐵和高鐵條件下，葉中LcZIP1的表達(dá)量無(wú)顯著變化，但根中LcZIP1的表達(dá)量均顯著上調(diào)（圖3）。在高鐵條件下，根中的表達(dá)量雖然上調(diào)但顯著低于缺鐵條件。結(jié)果表明，羊草根細(xì)胞中的LcZIP1參與對(duì)高鋅、低鐵和高鐵條件的響應(yīng)。

圖3 不同Zn2+和Fe2+濃度條件下LcZIP1 的相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expression of LcZIP1 under different Zn2+and Fe2+ concentration

2.4 LcZIP1 具有Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能

在低鐵條件下，LcZIP1能夠恢復(fù)低鐵敏感酵母突變體?fet3/?fet4的生長(zhǎng)表型，與已報(bào)道的陽(yáng)性對(duì)照AtZIP7表型一致（圖4A）。據(jù)報(bào)道，AtZIP7可以使?fet3/?fet4在低鐵條件下恢復(fù)生長(zhǎng)[8］，表明其具有鐵轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

圖4 LcZIP1 在酵母突變體?fet3/?fet4、?zrt1/?zrt2 和?zrc1/?cot1 中的功能互補(bǔ)驗(yàn)證Fig. 4 Complementation analysis of Saccharomyces cerevisiae mutants （?zrt1/?zrt2， ?fet3/?fet4 and ?zrc1/?cot1） with LcZIP1

在低鋅條件下，LcZIP1不能恢復(fù)低鋅敏感酵母突變體?zrt1/?zrt2（鋅吸收缺陷酵母突變體）的生長(zhǎng)表型（圖4B），與已報(bào)道的陽(yáng)性對(duì)照AtZIP7（該基因具有鋅轉(zhuǎn)運(yùn)功能）不同，因?yàn)锳tZIP7可以使?zrt1/?zrt2在低鋅條件下恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

在高鋅條件下，LcZIP1不能增強(qiáng)?zrc1/?cot1對(duì)高鋅的抗性，所以不能在高鋅培養(yǎng)基上生長(zhǎng)（圖4C），與已報(bào)道的陽(yáng)性對(duì)照MtMTP3（該基因具有鋅轉(zhuǎn)運(yùn)功能）不同。MtMTP3能夠增強(qiáng)?zrc1/?cot1對(duì)高鋅的抗性，在高鋅培養(yǎng)基上可正常生長(zhǎng)[26］。

以上酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)表明，LcZIP1具有Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能，無(wú)Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)功能。

3 討論

前期研究表明植物ZIP 家族成員由309~476 個(gè)氨基酸組成，含8 個(gè)跨膜域，氨基端和羧基端位于質(zhì)膜外，第3 和4 跨膜域之間的短肽長(zhǎng)度變異度大，命名為變異區(qū)（variable region），該區(qū)富含組氨酸，被認(rèn)為是潛在的金屬結(jié)合域[27］。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，水稻OsZIP1 有9 個(gè)跨膜域，氨基端位于膜內(nèi)，羧基端位于膜外[16］，但OsZIP1 的鋅結(jié)合域尚未明確；蒺藜苜蓿6 個(gè)ZIP 家族成員（MtZIP1， 3， 4~7）由350~372 個(gè)氨基酸組成，有8 個(gè)跨膜域，第3 和4 跨膜域之間也為富含組氨酸的短肽[11］。本研究發(fā)現(xiàn)羊草LcZIP1 由347 個(gè)氨基酸組成，含9 個(gè)跨膜域，氨基端位于膜內(nèi)，羧基端位于膜外，與OsZIP1 相似。在高粱、柳枝稷、狗尾草、谷子、哈氏黍、二穗短柄草和B. stacei的ZIP 中除哈氏黍ZIP 有7 個(gè)跨膜域，其余都具有9 個(gè)跨膜域。另外這些ZIP 的第4和5 跨膜域之間短肽長(zhǎng)度變異度大，為54~108 個(gè)氨基酸（圖1C）。羊草LcZIP1 第4 和5 跨膜域之間短肽長(zhǎng)44 個(gè)氨基酸，序列為QRAAHAKKAAAVVGADV EATPAHHAHGVSAAIASSSDAQLIRHR，含5 個(gè)組氨酸，其他非跨膜域不含組氨酸。表明這段短肽可能代表金屬結(jié)合域，但需進(jìn)一步證明。此外還發(fā)現(xiàn)，以上8 種禾本科植物（包括羊草在內(nèi)）中，除哈氏黍外，其余植物的ZIP1 都具有9 個(gè)跨膜域。另外，8 種植物ZIP1 的氨基端和羧基端都分別位于膜內(nèi)和膜外（圖1）。

目前已發(fā)現(xiàn)植物ZIP 家族可以轉(zhuǎn)運(yùn)Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+或Cd2+。這些元素都屬于重金屬，其中絕大多數(shù)（Fe2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+和Mn2+）還屬植物生長(zhǎng)必需微量元素，因此對(duì)該家族成員的挖掘有助于了解Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+和Cd2+對(duì)促進(jìn)農(nóng)作物生長(zhǎng)或富集土壤重金屬的分子機(jī)制，也可為農(nóng)作物的改良和土壤重金屬污染防治提供依據(jù)。羊草是內(nèi)蒙古草原的重要建群種，抗逆性強(qiáng)，不僅是優(yōu)質(zhì)的天然牧草還是重要的生態(tài)草。羊草ZIP 家族成員的挖掘和功能鑒定，對(duì)于了解羊草對(duì)必需重金屬（Fe2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Ni2+）和非必需重金屬（Cd2+）吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子調(diào)控機(jī)理具有重要的理論意義，也為牧草和其他農(nóng)作物的改良和被重金屬污染的土壤生態(tài)修復(fù)提供參考。已有研究表明將擬南芥AtZIP1在非洲重要主食木薯（Manihot esculenta）中過(guò)表達(dá)可顯著提高木薯塊根的鋅含量[28］。將擬南芥ZIP 家族成員IRT1和編碼鐵蛋白（ferritin）的基因FER1在木薯中共表達(dá)，田間試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明轉(zhuǎn)基因木薯產(chǎn)量不受影響，但Fe 的積累水平提高了7~18 倍，Zn 提高了3~10 倍。該研究為改善全球人口的營(yíng)養(yǎng)提供了助力[29］。有些ZIP 成員具有金屬解毒的功能，如OsZIP1 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜上，在過(guò)量的鋅、銅和鎘的條件下，OsZIP1被誘導(dǎo)表達(dá)，因此可阻止Zn、Cu 和Cd 在水稻中過(guò)量積累[16］。

本研究發(fā)現(xiàn)LcZIP1 定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高鋅、高鐵和缺鐵條件下，根中的LcZIP1表達(dá)上調(diào)；酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LcZIP1 參與Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)，但其是將Fe2+轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行貯存還是排出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)尚需進(jìn)行深入研究。另外，現(xiàn)已報(bào)道ZIP 家族成員在擬南芥、水稻、小麥、大麥和菜豆中分別有15、17、14、12 和23 個(gè)[15］，羊草ZIP 家族中有多少成員還需進(jìn)一步的研究。