王乙橙,晏 鵬,陳猷鵬

厭氧氨氧化細(xì)菌梯烷脂的研究進(jìn)展

王乙橙,晏 鵬,陳猷鵬*

(重慶大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院,重慶 400045)

厭氧氨氧化細(xì)菌(AnAOB)在地球氮循環(huán)和環(huán)境污染治理中扮演著重要角色.AnAOB含有獨(dú)特的梯烷脂,其核心結(jié)構(gòu)是3或5個(gè)線性串聯(lián)的環(huán)丁烷基團(tuán).至今尚未發(fā)現(xiàn)梯烷脂存在于其他細(xì)菌中,而且其生物合成通路和生理功能仍然未知.本文對(duì)AnAOB梯烷脂的發(fā)現(xiàn)、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、種類、合成及其應(yīng)用進(jìn)行了系統(tǒng)綜述,并對(duì)梯烷脂的前沿問(wèn)題和未來(lái)研究方向進(jìn)行了討論與展望.

厭氧氨氧化細(xì)菌；磷脂；梯烷脂；環(huán)丁烷；生物合成；生物標(biāo)記物

厭氧氨氧化細(xì)菌(AnAOB)是屬于浮霉菌門(Planctomycetes)的一類獨(dú)特細(xì)菌,能夠進(jìn)行厭氧氨氧化(Anammox)并產(chǎn)生氮?dú)?從中獲取能量生長(zhǎng)繁殖[1-4].AnAOB是介導(dǎo)地球氮循環(huán)的重要微生物類群[2-3],而且其在缺氧條件下無(wú)需外加有機(jī)碳源就可以實(shí)現(xiàn)脫氮,對(duì)于污水處理具有重要意義[2-3,5-7]. Anammox反應(yīng)被證明發(fā)生在AnAOB特殊的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)厭氧氨氧化體(Anammoxosome)中[8].厭氧氨氧化體占據(jù)細(xì)胞總體積的40%～70%,而且厭氧氨氧化體膜具有致密、相對(duì)不滲透性的特點(diǎn),含有大量特殊的磷脂——梯烷脂(Ladderane lipids);AnAOB所有的細(xì)胞膜均含有梯烷脂[8-10].Damste等[9]通過(guò)理論計(jì)算表明以單一梯烷脂構(gòu)成的磷脂雙分子層膜的密度達(dá)到了1.5kg/dm3,明顯高于其他一般細(xì)胞膜的密度(大多為1.2kg/dm3).梯烷脂含有3個(gè)或5個(gè)線性順式連接的環(huán)丁烷基團(tuán),該基團(tuán)擁有獨(dú)特的CCC鍵角度和扭轉(zhuǎn)應(yīng)變,純化后的梯烷脂能夠形成脂質(zhì)堆積密度較高的液膜[9,11-13].至今為止,僅在AnAOB中發(fā)現(xiàn)了梯烷脂,因此它也被用作指示AnAOB和Anammox活動(dòng)的生物標(biāo)記物[14-25].

鑒于梯烷脂組成的厭氧氨氧化體膜通透性較低,梯烷脂的作用可能是避免Anammox過(guò)程中的有毒中間產(chǎn)物(例如肼或其他更大的有毒分子)從厭氧氨氧化體中擴(kuò)散出來(lái),從而保護(hù)細(xì)胞核酸和周質(zhì)內(nèi)容物免受損傷,維持正常代謝功能[9,26].除了避免有毒中間產(chǎn)物泄露外,梯烷脂的功能還可能是阻礙質(zhì)子從厭氧氨氧化體中被動(dòng)擴(kuò)散出去.因?yàn)锳nammox代謝緩慢,AnAOB需要致密的梯烷脂膜來(lái)維持合成ATP所需的質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)[27].但是,對(duì)化學(xué)合成的天然梯烷脂的最新研究結(jié)果則表明,梯烷脂的功能極有可能是阻止質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的崩潰,而不是阻止肼在AnAOB中的跨膜擴(kuò)散[28].綜上,基于現(xiàn)有的研究結(jié)果對(duì)于梯烷脂的生物功能假說(shuō)主要分為兩類:(1)作為Anammox有毒中間產(chǎn)物的屏障;(2)維持質(zhì)子動(dòng)力勢(shì).然而,由于目前尚未實(shí)現(xiàn)AnAOB的純培養(yǎng),其基礎(chǔ)代謝研究較為困難,梯烷脂的生物功能和在Anammox反應(yīng)中發(fā)揮的作用依然是一個(gè)謎.

厭氧氨氧化體是Anammox反應(yīng)發(fā)生的主要場(chǎng)所[29-30],其膜的重要組成成分梯烷脂對(duì)于Anammox和AnAOB具有關(guān)鍵作用,而且梯烷脂可以成為可再生、高能量密度的航空燃料[11-12,31],因此梯烷脂的功能和可控人工合成研究具有重要的科學(xué)意義和工程應(yīng)用前景[1].本文通過(guò)對(duì)AnAOB梯烷脂的結(jié)構(gòu)、種類、功能、合成及其應(yīng)用進(jìn)行系統(tǒng)綜述,并指出梯烷脂研究的可能發(fā)展方向,旨在為深入研究梯烷脂的功能、生物合成和工程應(yīng)用提供有價(jià)值的參考.

1 梯烷脂的結(jié)構(gòu)與種類

Damste等[9]于2002年首次報(bào)道了AnAOB梯烷脂,這類物質(zhì)是特殊的由甘油分子和含有環(huán)丁烷基團(tuán)的烷烴支鏈結(jié)合而成的磷脂,由于線性連接的環(huán)丁烷基團(tuán)的投影呈梯子狀,因此被稱為“梯烷” (Ladderane)(圖1).AnAOB菌體中的天然梯烷目前共發(fā)現(xiàn)有兩種分子結(jié)構(gòu),分別稱為X結(jié)構(gòu)和Y結(jié)構(gòu)(圖1)[9].甘油分子作為梯烷脂的骨架,其具有3個(gè)連接位點(diǎn),分別是sn-1、sn-2、sn-3(圖1).sn-1位點(diǎn)可以連接氫、普通烷烴或梯烷支鏈(通過(guò)醚鍵或酯鍵連接烷基)等多種不同基團(tuán),sn-2位點(diǎn)通過(guò)醚鍵連接含有X結(jié)構(gòu)的梯烷支鏈,而sn-3位點(diǎn)則可以與一個(gè)極性首基(Polar headgroup)相結(jié)合;如果sn-3位點(diǎn)連接有首基,被稱為完整梯烷脂(Intact ladderane lipids),失去首基但含有梯烷基團(tuán)則被稱為核心梯烷脂(Core ladderane lipids)(圖2,Ⅰ和a-d)[9,14,29,32].由于細(xì)胞死亡后,磷脂會(huì)迅速分解,因此完整梯烷脂只來(lái)自AnAOB細(xì)菌活體,其適合用于指示正在進(jìn)行的Anammox活動(dòng)[19,33-34].核心梯烷脂相對(duì)穩(wěn)定,可能來(lái)自AnAOB細(xì)菌活體,也可能來(lái)自凋亡的細(xì)菌,更適合用于重建古環(huán)境的Anammox活動(dòng)[35].

完整梯烷脂的極性首基目前共發(fā)現(xiàn)3類,分別是磷酸膽堿(PC)、磷酸乙醇胺(PE)和磷酸甘油(PG)(圖1).Boumann等[32]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的富集培養(yǎng)物含有的完整梯烷脂的極性首基主要為PC和PE.Rattray等[14]則在4個(gè)不同屬(、、和)的AnAOB(表1)中都檢測(cè)到了PC和PE首基完整梯烷脂,并發(fā)現(xiàn)了PG首基.該研究還表明不同屬的AnAOB梯烷脂的組成有較大差異,這可能是由于物種或培養(yǎng)條件的差異所造成[14].此外, Rattray等[14]發(fā)現(xiàn)4個(gè)屬的AnAOB均含有C20梯烷脂和C18梯烷脂,而且C20梯烷脂是主要的梯烷脂.AnAOB的梯烷脂結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜且種類較多:首基和甘油骨架的組成結(jié)構(gòu)共有10種,分別用羅馬數(shù)字I-X表示,而sn-1位點(diǎn)連接的尾部烷烴支鏈共有10種,分別用小寫英文字母a-j表示(圖2).

(A)線性串聯(lián)的環(huán)丁烷基團(tuán);(B)甘油骨架;(C)完整梯烷脂

表1 含有梯烷脂的AnAOB

目前對(duì)于梯烷脂的檢測(cè)和鑒定,主要局限在4個(gè)屬的AnAOB富集培養(yǎng)物,但是其他新發(fā)現(xiàn)的屬或科(例如[40-41]、[42]、[43]和[43])的AnAOB的梯烷脂的結(jié)構(gòu)、種類或含量則未見(jiàn)報(bào)道.此外,浮霉菌門的細(xì)菌具有細(xì)胞器膜化和細(xì)胞壁缺少肽聚糖的獨(dú)特特征[44],因此除了AnAOB以外的其他浮霉菌門細(xì)菌(特別是可純培養(yǎng)的浮霉菌)的膜磷脂結(jié)構(gòu)和種類值得進(jìn)一步探究.

圖2 AnAOB富集培養(yǎng)物核心脂類和完整梯烷脂的類型[14]

2 梯烷脂在環(huán)境研究中的應(yīng)用

如前所述,梯烷脂是AnAOB特有的磷脂,因此可以用作指示AnAOB和Anammox活動(dòng)的生物標(biāo)記物.截至目前,已有大量研究基于梯烷脂探究某一特定區(qū)域的AnAOB的分布或Anammox對(duì)氮循環(huán)的貢獻(xiàn)(表2).Kuypers等[20]首次利用梯烷脂作為生物標(biāo)記物來(lái)指示海洋中的Anammox活動(dòng),結(jié)合氮同位素標(biāo)記和熒光原位雜交技術(shù)(FISH),證明了AnAOB在海洋氮循環(huán)中發(fā)揮了重要作用.此外,許多海洋區(qū)域的沉積物中也檢測(cè)出梯烷脂,再次證明Anammox是海洋氮循環(huán)中的重要途徑[15,17,33,35]. Jaseschke等[35]利用海洋沉積物柱中的核心梯烷脂結(jié)合年代地層學(xué)技術(shù)重建了阿拉伯北部海域古環(huán)境的Anammox活動(dòng),結(jié)果表明Anammox活動(dòng)在該海洋區(qū)域至少存在了14萬(wàn)年.Zhao等[15]利用沉積物柱和懸浮微粒物質(zhì)中的梯烷脂重建中國(guó)東海過(guò)去百年尺度的Anammox活動(dòng),并分析了梯烷脂對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化和缺氧的響應(yīng),認(rèn)為梯烷脂可以作為中國(guó)東海過(guò)去缺氧變化的有效指示物質(zhì),同時(shí)能夠間接地用于沿海海洋區(qū)域富營(yíng)養(yǎng)化記錄的重建.

目前利用梯烷脂作為生物標(biāo)記物的研究對(duì)象主要是海洋環(huán)境,鮮見(jiàn)對(duì)其他環(huán)境(如湖泊、土壤等)的調(diào)查研究報(bào)道.此外,雖然先前的研究表明梯烷脂是研究海洋氮循環(huán)或缺氧的有效指示物,但是未來(lái)仍需進(jìn)一步探究環(huán)境影響因素(如溶解氧、營(yíng)養(yǎng)鹽濃度、溫度、水深等)和梯烷脂種類或含量之間的聯(lián)系.

表2 利用梯烷脂作為生物標(biāo)記物探究自然環(huán)境中的厭氧氨氧化的研究

3 梯烷脂的合成

鑒于AnAOB梯烷脂的獨(dú)特性質(zhì)、良好的環(huán)境研究和工業(yè)應(yīng)用前景,因此揭示梯烷脂的生物合成通路和高效化學(xué)合成梯烷脂具有重要意義.總的來(lái)說(shuō),天然梯烷脂的生物合成通路至今仍然未知,需要進(jìn)一步挖掘AnAOB膜磷脂的合成基因簇和相關(guān)通路,但是在化學(xué)合成天然或非天然梯烷(脂)方面目前已經(jīng)取得了重要突破——現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出多種化學(xué)合成梯烷(脂)的方法.

3.1 生物合成

Damste等[51]首次提出了梯烷脂的生物合成假說(shuō):AnAOB首先合成C20多不飽和脂肪酸,然后C20多不飽和脂肪酸在C9和C20處環(huán)合形成C12大環(huán),隨后形成CC單鍵,最終形成線性連接的環(huán)丁烷基團(tuán);由于梯烷脂基團(tuán)的結(jié)構(gòu)相似,可以通過(guò)增加或減少環(huán)化步驟的數(shù)量來(lái)合成含有3或5個(gè)環(huán)丁烷基團(tuán).Mascitti等[52]則認(rèn)為梯烷生物合成可能通過(guò)級(jí)聯(lián)型多環(huán)化發(fā)生,該反應(yīng)可能利用的底物是丙二烯系C20脂肪酸9,10,12,16,18,19-二十二碳六烯酸.此外,Nouri等[11]也提出了3種可能的需要六步多環(huán)化反應(yīng)的梯烷脂生物合成機(jī)制.

細(xì)菌一般通過(guò)Ⅱ型脂肪酸合成(FASⅡ)通路進(jìn)行飽和/不飽和脂肪酸的合成[53],梯烷脂有可能通過(guò)該通路合成.Strous等[54]發(fā)現(xiàn)在基因組中,脂肪酸生物合成功能基因分布在4個(gè)基因簇上,其中兩個(gè)基因簇由已知的FASⅡ和S-腺苷-甲硫氨酸(SAM)自由基酶編碼基因的同源基因組成.由于SAM自由基酶編碼基因在細(xì)菌基因組中較為少見(jiàn),而且這些酶通常負(fù)責(zé)催化困難的化學(xué)反應(yīng),所以他們認(rèn)為這些基因簇最有可能負(fù)責(zé)梯烷脂的合成[54].

隨后,Rattray等[55]以模式細(xì)菌的基因組為參考通過(guò)比較基因組學(xué)的方法進(jìn)一步鑒定了的脂肪酸合成基因,發(fā)現(xiàn)擁有除了、、和以外大部分的FASⅡ功能基因,同時(shí)它的FASⅡ基因簇中有6個(gè)基因編碼SAM自由基酶或甲基化酶(Methylase enzymes),有2個(gè)基因的產(chǎn)物和八氫番茄紅素脫氫酶(Phytoene dehydrogenases)有一定的同源性.此外,Rattray等[55]通過(guò)序列比對(duì)鑒定了其他137個(gè)物種是否擁有類似的FASⅡ基因簇,發(fā)現(xiàn)的這些基因簇稀少但并不唯一,屬于δ-變形菌綱的兩種細(xì)菌(和)具有類似的基因簇,并且除了擁有SAM自由基酶和八氫番茄紅素脫氫酶的同源編碼基因外,還有1個(gè)功能未知的膜蛋白和1個(gè)苯乙酰CoA連接酶(Phenylacetyl-CoA ligase)的編碼基因.然而,在細(xì)胞中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)梯烷脂,但是檢測(cè)到不常見(jiàn)的多不飽和碳?xì)浠衔?該化合物在細(xì)胞中并未檢測(cè)到[55].基于上述的研究結(jié)果,Rattray等[55]提出了兩種C20-[5]-梯烷脂肪酸的生物合成通路(圖3):通路a,首先合成多不飽和碳?xì)浠衔?然后經(jīng)過(guò)SAM自由基酶的作用形成梯烷脂肪酸;通路b,梯烷基團(tuán)通過(guò)未知的合成通路形成,然后進(jìn)入到FASⅡ通路,最終形成梯烷脂肪酸.然而,對(duì)的碳同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,其梯烷脂的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)環(huán)丁烷和環(huán)己烷的碳原子不是通過(guò)已知的FASⅡ通路合成,因此梯烷基團(tuán)更可能是通過(guò)未知的新通路合成[56].Chen等[57]通過(guò)量子化學(xué)計(jì)算探究了利用低聚環(huán)丙烷(Oligocyclopropane)作為前體生物合成梯烷的反應(yīng)可行性,并認(rèn)為一種涉及到混合機(jī)制的合成通路從自由能變的角度來(lái)看是較為合理的.

圖3 C20-[5]-梯烷脂肪酸的兩種生物合成通路[55]

2016年,Javidpour等[31]首次通過(guò)異源表達(dá)和鳥槍蛋白組學(xué)研究了先前在基因組中鑒定出的27個(gè)可能涉及到梯烷脂合成的基因的功能,盡管他們最終并沒(méi)有確定梯烷脂的合成基因(失敗的原因可能是部分候選基因未能有效表達(dá)、表達(dá)蛋白不能正確折疊或者選擇的宿主可能并非AnAOB基因最佳的異源表達(dá)宿主),但是在這項(xiàng)研究中他們建立起了有效的AnAOB基因異源表達(dá)載體構(gòu)建方法.此外,Javidpour等[31]的研究結(jié)果表明先前被認(rèn)為在梯烷脂合成中可能起到重要作用的去飽和酶(由基因kuste3336和kuste3607編碼,和八氫番茄紅素去飽和酶CrtI有大約30%的序列相似性)并不能將八氫番茄紅素去飽和產(chǎn)生番茄紅素.

當(dāng)前,對(duì)于梯烷脂的生物合成功能基因的推測(cè)主要基于的比較基因組學(xué)研究結(jié)果,然而梯烷脂合成的碳同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)對(duì)象是AnAOB另一個(gè)屬的,物種本身的差異可能導(dǎo)致合成通路的差異.因此,基于的實(shí)驗(yàn)推論可能不適用于.后續(xù)可采用的富集培養(yǎng)物開(kāi)展類似的碳同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn),以檢驗(yàn)Rattray等[55-56]提出的推論.此外,鑒于目前已有多個(gè)AnAOB(屬于確認(rèn)含有梯烷脂的4個(gè)屬)的全基因組序列公布,可考慮對(duì)這些基因組進(jìn)行比較基因組分析——鑒定它們所共有的核心脂肪酸合成基因簇,在Rattray等[55]的研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步鑒定可能的梯烷脂生物合成通路.Javidpour等[31]的結(jié)果為通過(guò)異源表達(dá)技術(shù)研究的梯烷脂合成基因建立了基礎(chǔ),未來(lái)可考慮在此基礎(chǔ)之上優(yōu)化啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)序列,利用與AnAOB較為近緣的浮霉菌門細(xì)菌作為表達(dá)宿主.

3.2 化學(xué)合成

圖4 化學(xué)合成的梯烷(脂)

2004年,Mascitti等[58]首次報(bào)道了天然梯烷脂的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)之一(±)-[5]-梯烷酸(Ladderanoic acid)(圖4)的外消旋合成(Racemic synthesis)方法,關(guān)鍵步驟利用了光化學(xué)[2+2]-環(huán)加成和Wolff重排環(huán)收縮反應(yīng).而后,Mascitti等[52]繼續(xù)優(yōu)化了合成策略于2006年報(bào)道了(±)-[5]-梯烷酸的拆分合成(Enantioselective synthesis)方法,即逐級(jí)連接環(huán)丁烷形成線性串聯(lián)的環(huán)丁烷基團(tuán).Mercer等[59]通過(guò)拆分合成方法化學(xué)合成了(-)-[5]-梯烷酸,同時(shí)第一次合成了天然梯烷脂的另一個(gè)關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[3]-梯烷醇(Ladderanol),而且首次通過(guò)化學(xué)合成和自組裝獲得了一種常見(jiàn)的天然梯烷脂——PC首基[5]-[3]-梯烷(圖4);他們提出的策略利用了基于Ramberg– B?cklund反應(yīng)的環(huán)收縮和Zweifel烯基化反應(yīng),可以合成高純度和產(chǎn)量相對(duì)較多的天然梯烷脂,這將有助于梯烷脂的生物物理研究.Line等[60]通過(guò)拆分合成方法分為14個(gè)步驟合成了對(duì)映-[3]-梯烷醇.Moss等[28]則在先前Mercer等[59]的拆分合成方法基礎(chǔ)上,又合成了PC首基[3]-[3]-梯烷(最常見(jiàn)天然梯烷脂之一)和非天然結(jié)構(gòu)的PC首基[5]-[5]-梯烷(圖4).最近,Hancock等[61]和Ray等[62]分別報(bào)道了改進(jìn)的(+)-[5]-梯烷酸和[3]-梯烷醇的拆分合成策略.此外,還有一些關(guān)于非天然梯烷的化學(xué)合成研究報(bào)道[11,63-65].

盡管光化學(xué)[2+2]-環(huán)加成、基于Wolff重排和Ramberg–B?cklund反應(yīng)的環(huán)收縮以及Zweifel烯基化反應(yīng)已經(jīng)被證明是切實(shí)可行的梯烷(脂)合成策略,但是由于應(yīng)變引起的變形和迭代環(huán)丁烷組裝導(dǎo)致合成難度較高[64],未來(lái)仍然需要開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)單可行的合成方法.梯烷脂的化學(xué)合成促進(jìn)了一些新的合成方法和策略的開(kāi)發(fā),同時(shí)化學(xué)合成梯烷脂則在一定程度上提示了生物合成梯烷脂的可能前體和組裝過(guò)程,并且可以提供高純度的標(biāo)準(zhǔn)梯烷(脂),這將有助于梯烷脂的生物合成和功能研究.

4 影響梯烷脂生物合成的因素

梯烷脂是AnAOB磷脂膜的主要成分,其和AnAOB的生長(zhǎng)狀態(tài)密切相關(guān).已有相關(guān)研究表明,溫度是影響梯烷脂生物合成的重要因素,但其他可能的影響因素如鹽度、基質(zhì)濃度、氧氣濃度等則鮮見(jiàn)報(bào)道.

從污水處理系統(tǒng)中富集得到的AnAOB大多是嗜中溫菌,生長(zhǎng)溫度為20～43℃[66-67].但是在自然環(huán)境中,AnAOB生長(zhǎng)溫度的范圍更廣.目前已經(jīng)在北極海冰(溫度為-2.5℃)[45]、熱泉(溫度高達(dá)65℃)[48,68]、石油儲(chǔ)層(溫度高達(dá)75℃)[69]、深海熱液噴口區(qū)域(溫度高達(dá)85℃)[47]檢測(cè)到AnAOB或Anammox活動(dòng).此外,從海洋沉積物中富集的Scalindua屬的AnAOB可以在15～20℃生長(zhǎng)[70].值得注意的是,從上述高溫環(huán)境中檢測(cè)到一些從污水系統(tǒng)中富集得到的嗜中溫AnAOB,說(shuō)明這些AnAOB存在某些生理機(jī)制以適應(yīng)環(huán)境溫度的變化.

其他含有脂肪酸的細(xì)菌會(huì)通過(guò)調(diào)整磷脂膜的組成維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性,以適應(yīng)環(huán)境溫度的變化[71-74].AnAOB同樣表現(xiàn)出類似的溫度適應(yīng)機(jī)制. Rattray等[37]研究了溫度對(duì)4種不同屬的AnAOB富集培養(yǎng)物梯烷脂的影響,發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高C20-[5]-梯烷脂肪酸相對(duì)于C18-[5]-梯烷脂肪酸的含量升高,而隨著溫度的降低,C18-[5]-梯烷脂肪酸相對(duì)于C20-[5]-梯烷脂肪酸的含量升高.基于該實(shí)驗(yàn)結(jié)果,Rattray等[37]提出了NL5指數(shù)(式(1))來(lái)定量描述梯烷碳鏈長(zhǎng)度的變化趨勢(shì).

此外,他們還測(cè)定了其他處于不同溫度下的自然環(huán)境樣品的梯烷脂肪酸含量,發(fā)現(xiàn)NL5指數(shù)和樣品原位環(huán)境溫度具有強(qiáng)相關(guān)性,因此利用NL5指數(shù)有可能確定沉積物中梯烷脂的來(lái)源(原位或非原位產(chǎn)生)[37].對(duì)的冷適應(yīng)策略研究發(fā)現(xiàn),低溫對(duì)該物種梯烷脂的影響主要體現(xiàn)在3個(gè)方面:[5]-梯烷烷基的碳鏈長(zhǎng)度減少、sn-1位點(diǎn)連接碳鏈更短的C14和C16非梯烷烷基以及PE首基的相對(duì)含量增加[38].Kouba等[39]對(duì)14種不同溫度下(10～37℃)的Anammox富集培養(yǎng)物梯烷脂的研究結(jié)果也表明隨著溫度降低AnAOB會(huì)減少[5]-梯烷烷基的碳鏈長(zhǎng)度,而且還發(fā)現(xiàn)在低溫下AnAOB主要的無(wú)首基梯烷和完整梯烷脂并不匹配,這些無(wú)首基梯烷可能是與低溫適應(yīng)有關(guān)的常規(guī)膜組分.上述研究的關(guān)注點(diǎn)主要為梯烷脂在溫度改變時(shí)的變化,后續(xù)可基于梯烷脂生物合成通路的研究結(jié)果探究不同溫度下候選梯烷脂合成基因/蛋白的表達(dá)量和梯烷脂含量及種類的變化,為揭示其合成通路提供重要依據(jù).

5 總結(jié)與展望

梯烷脂是AnAOB獨(dú)有的膜磷脂且相對(duì)含量較高,在4種不同屬的AnAOB富集培養(yǎng)物中都可以檢測(cè)到,能夠作為指示AnAOB和Anammox活動(dòng)的生物標(biāo)記物,還可以作為可再生、高能量密度的航空燃料.從發(fā)現(xiàn)梯烷脂以來(lái),已取得許多重要的研究進(jìn)展,這些加深了人們對(duì)AnAOB、Anammox及地球氮循環(huán)的認(rèn)識(shí),然而關(guān)于AnAOB梯烷脂仍然存在很多問(wèn)題亟待解決,未來(lái)可開(kāi)展如下研究:

5.1 可利用梯烷脂結(jié)合基因分子標(biāo)記物探明AnAOB的種類和分布環(huán)境,研究特定環(huán)境中的氮循環(huán)過(guò)程以及評(píng)估Anammox對(duì)氮循環(huán)的貢獻(xiàn),還可以結(jié)合年代地層學(xué)和其他指標(biāo),重建古環(huán)境的地球化學(xué)演化規(guī)律.

5.2 梯烷脂是反映海洋缺氧事件的有效指示物,然而梯烷脂如何定量反映特定環(huán)境過(guò)去及現(xiàn)在的缺氧和富營(yíng)養(yǎng)化事件,以及人類活動(dòng)對(duì)水體環(huán)境的影響是值得深入探討的問(wèn)題.這可為未來(lái)生態(tài)環(huán)境變化預(yù)測(cè)提供有價(jià)值的理論依據(jù).

5.3 目前僅在AnAOB中檢測(cè)到梯烷脂,但是其他細(xì)菌類群或是古菌是否含有梯烷脂仍然是后續(xù)研究中應(yīng)該關(guān)注的問(wèn)題.

5.4 一些AnAOB新的種、屬以及科陸續(xù)被發(fā)現(xiàn),因此值得探究這些新的AnAOB是否也含有梯烷脂;如果檢測(cè)到梯烷脂,則需要關(guān)注它們的梯烷脂含量、結(jié)構(gòu)及種類,這將有助于揭示梯烷脂在Anammox過(guò)程中發(fā)揮的作用.

5.5 雖然化學(xué)合成的天然梯烷脂的通透性研究表明梯烷脂的功能很可能是阻止厭氧氨氧化體內(nèi)部質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)的崩潰,但是這僅僅是基于兩種天然梯烷脂的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的推論,今后需要對(duì)其他的天然梯烷脂進(jìn)行生物物理學(xué)表征以進(jìn)一步檢驗(yàn)該推論的正確性.此外,基于該推論,如何通過(guò)厭氧氨氧化體膜形成質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)則是待解答的另一個(gè)問(wèn)題.

5.6 當(dāng)前對(duì)于梯烷脂生物功能的假說(shuō)之一是主要由梯烷脂構(gòu)成的厭氧氨氧化體膜可以作為Anammox有毒中間產(chǎn)物肼的屏障.厭氧氨氧化體膜的組成較為復(fù)雜,而且AnAOB菌體內(nèi)的其他細(xì)胞膜也含有梯烷脂,因此當(dāng)前基于兩種單一梯烷脂的體外膜滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍不足以推翻上述假說(shuō).相比之下,活體的功能研究更具有說(shuō)服力.可以考慮采用密度梯度離心技術(shù)獲得高純度的AnAOB菌體,進(jìn)而分離出厭氧氨氧化體及其他細(xì)胞組分,檢測(cè)各個(gè)組分中肼和其他Anammox中間產(chǎn)物的含量,相關(guān)結(jié)果將有助于檢驗(yàn)上述假說(shuō)的正確性.

5.7 比較基因組學(xué)和碳同位素標(biāo)記分析初步揭示了梯烷脂的生物合成通路,但是梯烷脂(特別是關(guān)鍵結(jié)構(gòu)串聯(lián)的環(huán)丁烷基團(tuán))的生物合成通路仍然有待闡明.因此,可以采用合適的技術(shù)方法如新的標(biāo)記底物或標(biāo)記方法、宏蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)、異源表達(dá)等深入挖掘梯烷脂的合成通路.而后,在梯烷脂的生物合成通路得到闡明的基礎(chǔ)上,利用合成生物學(xué)技術(shù)和工程菌規(guī)?；a(chǎn)梯烷脂,進(jìn)而將其應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域.

[1] Kuenen J G. Anammox and beyond [J]. Environmental Microbiology, 2020,22(2):525-536.

[2] Kartal B, de Almeida N M, Maalcke W J, et al. How to make a living from anaerobic ammonium oxidation [J]. FEMS Microbiology Reviews, 2013,37(3):428-461.

[3] Peeters S H, van Niftrik L. Trending topics and open questions in anaerobic ammonium oxidation [J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2019,49:45-52.

[4] Strous M, Fuerst J A, Kramer E H M, et al. Missing lithotroph identified as new planctomycete [J]. Nature, 1999,400(6743):446-449.

[5] Kartal B, Kuenen J G, van Loosdrecht M C M. Sewage treatment with anammox [J]. Science, 2010,328(5979):702-703.

[6] Wang Y, Ji X M, Jin R C. How anammox responds to the emerging contaminants: Status and mechanisms [J]. Journal of Environmental Management, 2021,293:112906.

[7] 韓雪恪,王崢嶸,彭永臻,等.幾種重要因素對(duì)厭氧氨氧化過(guò)程的影響綜述 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2023,43(5):2220-2227. Han X K, Wang Z R, Peng Y Z, et al. A review of several important factors influencing the anammox process [J]. China Environmental Science, 2023,43(5):2220-2227.

[8] Neumann S, Wessels H, Rijpstra W I C, et al. Isolation and characterization of a prokaryotic cell organelle from the anammox bacterium[J]. Molecular Microbiology, 2014,94(4):794-802.

[9] Damste J S S, Strous M, Rijpstra W I C, et al. Linearly concatenated cyclobutane lipids form a dense bacterial membrane [J]. Nature, 2002,419(6908):708-712.

[10] Peng M W, Guan Y, Liu J H, et al. Quantitative three-dimensional nondestructive imaging of whole anaerobic ammonium-oxidizing bacteria [J]. Journal of Synchrotron Radiation, 2020,27(3):753-761.

[11] Nouri D H, Tantillo D J. They came from the deep: Syntheses, applications, and biology of ladderanes [J]. Current Organic Chemistry, 2006,10(16):2055-2074.

[12] Novak I. Ring strain in [n] ladderanes [J]. Journal of Physical Chemistry A, 2008,112(40):10059-10063.

[13] Boumann H A, Longo M L, Stroeve P, et al. Biophysical properties of membrane lipids of anammox bacteria: I. Ladderane phospholipids form highly organized fluid membranes [J]. Biochimica Et Biophysica Acta-Biomembranes, 2009,1788(7):1444-1451.

[14] Rattray J E, van de Vossenberg J, Hopmans E C, et al. Ladderane lipid distribution in four genera of anammox bacteria [J]. Archives of Microbiology, 2008,190(1):51-66.

[15] Zhao Z, Cao Y, Fan Y, et al. Ladderane records over the last century in the East China sea: Proxies for anammox and eutrophication changes [J]. Water Research, 2019,156:297-304.

[16] Hamersley M R, Lavik G, Woebken D, et al. Anaerobic ammonium oxidation in the Peruvian oxygen minimum zone [J]. Limnology and Oceanography, 2007,52(3):923-933.

[17] Brandsma J, van de Vossenberg J, Risgaard-Petersen N, et al. A multi-proxy study of anaerobic ammonium oxidation in marine sediments of the Gullmar Fjord, Sweden [J]. Environmental Microbiology Reports, 2011,3(3):360-366.

[18] Jaeschke A, Hopmans E C, Wakeham S G, et al. The presence of ladderane lipids in the oxygen minimum zone of the Arabian Sea indicates nitrogen loss through anammox [J]. Limnology and Oceanography, 2007,52(2):780-786.

[19] Jaeschke A, Abbas B, Zabel M, et al. Molecular evidence for anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) bacteria in continental shelf and slope sediments off northwest Africa [J]. Limnology and Oceanography, 2010,55(1):365-376.

[20] Kuypers M M M, Sliekers A O, Lavik G, et al. Anaerobic ammonium oxidation by anammox bacteria in the Black Sea [J]. Nature, 2003,422(6932):608-611.

[21] Kuypers M M M, Lavik G, Woebken D, et al. Massive nitrogen loss from the Benguela upwelling system through anaerobic ammonium oxidation [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005,102(18):6478-6483.

[22] Pitcher A, Villanueva L, Hopmans E C, et al. Niche segregation of ammonia-oxidizing archaea and anammox bacteria in the Arabian Sea oxygen minimum zone [J]. ISME Journal, 2011,5(12):1896-1904.

[23] Rush D, Wakeham S G, Hopmans E C, et al. Biomarker evidence for anammox in the oxygen minimum zone of the Eastern Tropical North Pacific [J]. Organic Geochemistry, 2012,53:80-87.

[24] Wakeham S G, Amann R, Freeman K H, et al. Microbial ecology of the stratified water column of the Black Sea as revealed by a comprehensive biomarker study [J]. Organic Geochemistry, 2007, 38(12):2070-2097.

[25] Zhao Z S, Cao Y L, Li L, et al. Sedimentary ladderane core lipids as potential indicators of hypoxia in the East China Sea [J]. Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 2013,31(1):237-244.

[26] Chaban V V, Nielsen M B, Kopec W, et al. Insights into the role of cyclic ladderane lipids in bacteria from computer simulations [J]. Chemistry and Physics of Lipids, 2014,181:76-82.

[27] van Niftrik L A, Fuerst J A, Damste J S S, et al. The anammoxosome: an intracytoplasmic compartment in anammox bacteria [J]. FEMS Microbiology Letters, 2004,233(1):7-13.

[28] Moss F R, Shuken S R, Mercer J A M, et al. Ladderane phospholipids form a densely packed membrane with normal hydrazine and anomalously low proton/hydroxide permeability [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2018,115(37):9098-9103.

[29] Jetten M S M, van Niftrik L, Strous M, et al. Biochemistry and molecular biology of anammox bacteria [J]. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 2009,44(2/3):65-84.

[30] van Niftrik L, Geerts W J C, van Donselaar E G, et al. Linking ultrastructure and function in four genera of anaerobic ammonium- oxidizing bacteria: Cell plan, glycogen storage, and localization of cytochrome c proteins [J]. Journal of Bacteriology, 2008,190(2): 708-717.

[31] Javidpour P, Deutsch S, Mutalik V K, et al. Investigation of proposed ladderane biosynthetic genes from Anammox bacteria by heterologous expression in[J]. PLoS ONE, 2016,11(3):e0151087.

[32] Boumann H A, Hopmans E C, van de Leemput I, et al. Ladderane phospholipids in anammox bacteria comprise phosphocholine and phosphoethanolamine headgroups [J]. FEMS Microbiology Letters, 2006,258(2):297-304.

[33] Jaeschke A, Rooks C, Trimmer M, et al. Comparison of ladderane phospholipid and core lipids as indicators for anaerobic ammonium oxidation (anammox) in marine sediments [J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 2009,73(7):2077-2088.

[34] Lanekoff I, Karlsson R. Analysis of intact ladderane phospholipids, originating from viable anammox bacteria, using RP-LC-ESI-MS [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010,397(8):3543-3551.

[35] Jaeschke A, Ziegler M, Hopmans E C, et al. Molecular fossil evidence for anaerobic ammonium oxidation in the Arabian Sea over the last glacial cycle [J]. Paleoceanography, 2009,24:PA2202.

[36] Kartal B, Rattray J, van Niftrik L A, et al.“Anammoxoglobus propionicus” a new propionate oxidizing species of anaerobic ammonium oxidizing bacteria [J]. Systematic and Applied Microbiology, 2007,30(1):39-49.

[37] Rattray J E, van de Vossenberg J, Jaeschke A, et al. Impact of temperature on ladderane lipid distribution in anammox bacteria [J]. Applied and Environmental Microbiology, 2010,76(5):1596-1603.

[38] Kouba V, Vejmelkova D, Zwolsman E, et al. Adaptation of anammox bacteria to low temperature via gradual acclimation and cold shocks: Distinctions in protein expression, membrane composition and activities [J]. Water Research, 2022,209:117822.

[39] Kouba V, Hurkova K, Navratilova K, et al. Effect of temperature on the compositions of ladderane lipids in globally surveyed anammox populations [J]. Science of the Total Environment, 2022,830:154715.

[40] Quan Z X, Rhee S K, Zuo J E, et al. Diversity of ammonium- oxidizing bacteria in a granular sludge anaerobic ammonium- oxidizing (anammox) reactor [J]. Environmental Microbiology, 2008, 10(11):3130-3139.

[41] Mardanov A V, Beletsky A V, Ravin N V, et al. Genome of a novel bacterium “Jettenia ecosi” reconstructed from the metagenome of an anammox bioreactor [J]. Frontiers in Microbiology, 2019,10:2442.

[42] Yang Y, Lu Z, Azari M, et al. Discovery of a new genus of anaerobic ammonium oxidizing bacteria with a mechanism for oxygen tolerance [J]. Water Research, 2022,226:119165.

[43] Suarez C, Dalcin Martins P, Jetten M S M, et al. Metagenomic evidence of a novel family of anammox bacteria in a subsea environment [J]. Environmental Microbiology, 2022,24(5):2348-2360.

[44] Fuerst J A, Sagulenko E. Beyond the bacterium: planctomycetes challenge our concepts of microbial structure and function [J]. Nature Reviews Microbiology, 2011,9(6):403-413.

[45] Rysgaard S, Glud R N. Anaerobic N2production in Arctic sea ice [J]. Limnology and Oceanography, 2004,49(1):86-94.

[46] Hopmans E C, Kienhuis M V M, Rattray J E, et al. Improved analysis of ladderane lipids in biomass and sediments using high-performance liquid chromatography/atmospheric pressure chemical ionization tandem mass spectrometry [J]. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2006,20(14):2099-2103.

[47] Byrne N, Strous M, Crepeau V, et al. Presence and activity of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria at deep-sea hydrothermal vents [J]. ISME Journal, 2009,3(1):117-123.

[48] Jaeschke A, den Camp H, Harhangi H, et al. 16S rRNA gene and lipid biomarker evidence for anaerobic ammonium-oxidizing bacteria (anammox) in California and Nevada hot springs [J]. FEMS Microbiology Ecology, 2009,67(3):343-350.

[49] Hu J W, Zhang H L, Li L, et al. Seasonal changes of organic matter origins and anammox activity in the Changjiang Estuary deduced from multi-biomarkers in suspended particulates [J]. Science China-Earth Sciences, 2016,59(7):1339-1352.

[50] Lai X S, Li X G, Song J M, et al. Nitrogen loss from the coastal shelf of the East China Sea: Implications of the organic matter [J]. Science of the Total Environment, 2023,854:158805.

[51] Damste J S S, Rijpstra W I C, Geenevasen J A J, et al. Structural identification of ladderane and other membrane lipids of planctomycetes capable of anaerobic ammonium oxidation (anammox) [J]. FEBS Journal, 2005,272(16):4270-4283.

[52] Mascitti V, Corey E J. Enantioselective synthesis of pentacycloanammoxic acid [J]. Journal of the American Chemical Society, 2006,128(10): 3118-3119.

[53] White S W, Zheng J, Zhang Y M, et al. The structural biology of type II fatty acid biosynthesis [M]. Annual Review of Biochemistry, 2005:791-831.

[54] Strous M, Pelletier E, Mangenot S, et al. Deciphering the evolution and metabolism of an anammox bacterium from a community genome [J]. Nature, 2006,440(7085):790-794.

[55] Rattray J E, Strous M, den Camp H, et al. A comparative genomics study of genetic products potentially encoding ladderane lipid biosynthesis [J]. Biology Direct, 2009,4:8.

[56] Rattray J E, Geenevasen J A J, Van Niftrik L, et al. Carbon isotope- labelling experiments indicate that ladderane lipids of anammox bacteria are synthesized by a previously undescribed, novel pathway [J]. FEMS Microbiology Letters, 2009,292(1):115-122.

[57] Chen S S, Tantillo D J. Potential for ladderane (bio)synthesis from oligo-cyclopropane precursors [J]. ACS Omega, 2020,5(40):26134- 26140.

[58] Mascitti V, Corey E J. Total synthesis of (+/-)-pentacycloanammoxic acid [J]. Journal of the American Chemical Society, 2004,126(48): 15664-15665.

[59] Mercer J A M, Cohen C M, Shuken S R, et al. Chemical synthesis and self-assembly of a ladderane phospholipid [J]. Journal of the American Chemical Society, 2016,138(49):15845-15848.

[60] Line N J, Witherspoon B P, Hancock E N, et al. Synthesis of ent-3-ladderanol: Development and application of intramolecular chirality transfer 2+2cycloadditions of allenic ketones and alkenes [J]. Journal of the American Chemical Society, 2017,139(41):14392- 14395.

[61] Hancock E N, Kuker E L, Tantillo D J, et al. Lessons in strain and stability: enantioselective synthesis of (+)-5-ladderanoic acid [J]. Angewandte Chemie-International Edition, 2020,59(1):436-441.

[62] Ray S, Mondal S, Mukherjee S. Enantioselective total synthesis of [3]-ladderanol through late-stage organocatalytic desymmetrization [J]. Angewandte Chemie, 2022,134:e202201584.

[63] Hopf H. Step by step - From nonnatural to biological molecular ladders [J]. Angewandte Chemie-International Edition, 2003,42(25): 2822-2825.

[64] Hancock E N, Brown M K. Ladderane natural products: From the ground up [J]. Chemistry-a European Journal, 2021,27(2):565-576.

[65] Epplin R C, Paul S, Herter L, et al. [2]-Ladderanes as isosteres for meta-substituted aromatic rings and rigidified cyclohexanes [J]. Nature Communications, 2022,13(1):6056.

[66] Kartal B, van Niftrik L, Keltjens J T, et al. Anammox-growth physiology, cell Biology, and metabolism [M]. Advances in Microbial Physiology, 2012,60:211-262.

[67] Strous M, Kuenen J G, Jetten M S M. Key physiology of anaerobic ammonium oxidation [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(7):3248-3250.

[68] Liu L, Lv A-P, Narsing Rao M P, et al. Diversity and distribution of anaerobic ammonium oxidation bacteria in hot springs of Conghua, China [J]. Frontiers in Microbiology, 2022,12:739234.

[69] Li H, Chen S, Mu B Z, et al. Molecular detection of anaerobic ammonium-oxidizing (anammox) bacteria in high-temperature petroleum reservoirs [J]. Microbial Ecology, 2010,60(4):771-783.

[70] van de Vossenberg J, Rattray J E, Geerts W, et al. Enrichment and characterization of marine anammox bacteria associated with global nitrogen gas production [J]. Environmental Microbiology, 2008, 10(11):3120-3129.

[71] Russell N J. Mechanisms of thermal adaptation in bacteria - blueprints for survival [J]. Trends in Biochemical Sciences, 1984,9(3):108-112.

[72] Sandercock S P, Russell N J. The elongation of exogenous fatty-acids and the control of phospholipid acyl chain-length in[J]. Biochemical Journal, 1980,188(3):585-592.

[73] Sinensky M. Homeoviscous adaptation - homeostatic process that regulates viscosity of membrane lipids in[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1974,71(2):522-525.

[74] Suutari M, Laakso S. Microbial fatty-acids and thermal adaptation [J]. Critical Reviews in Microbiology, 1994,20(4):285-328.

Research advances in ladderane lipids of anammox bacteria.

WANGYi-cheng, YAN Peng, CHEN You-peng*

(College of Environment and Ecology, Chongqing University, Chongqing 400045, China)., 2023,43(9)：4886～4895

Anaerobic ammonium-oxidizing bacteria (AnAOB) play an important role in the global nitrogen cycle and environmental pollution control. AnAOB contain unique ladderane lipids, whose key structure is three or five linearly concatenated cyclobutane moieties. Ladderane lipids have not been found in other bacteria so far, and their biosynthetic pathway and physiological function remain unknown. In this work, the advances in the discovery, structure, properties, types, applications, and synthesis of AnAOB ladderane lipids were comprehensively reviewed, and the current issues and prospected future research directions were discussed.

anaerobic ammonium-oxidizing bacteria；phospholipids；ladderane lipids；cyclobutane；biosynthesis；biomarker

X172

A

1000-6923(2023)09-4886-10

王乙橙(1996-),男,重慶涪陵人,博士研究生,研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物技術(shù).發(fā)表論文3篇.bitmatrix@yeah.net.

王乙橙,晏 鵬,陳猷鵬.厭氧氨氧化細(xì)菌梯烷脂的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2023,43(9):4886-4895.

WangY C, Yan P, Chen Y P.Research advances in ladderane lipids of anammox bacteria [J]. China Environmental Science, 2023,43(9):4886-4895.

2023-02-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21876016,52070031)

* 責(zé)任作者, 教授, ypchen@cqu.edu.cn