宋紅巖，王樹根*，李夢冉，楊曉暉，李然，馬曉迎

1.滄州市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，河北 滄州 061000

2.滄州師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河北 滄州 061000

3.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 實(shí)驗(yàn)中心，河北 滄州 061000

4.滄州市中心醫(yī)院 倫理委員會(huì)辦公室，河北 滄州 061000

5.滄州市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，河北 滄州 061000

高膽固醇血癥是指血漿膽固醇及低密度脂蛋白（LDL）水平升高，引發(fā)脂質(zhì)代謝異常和內(nèi)皮細(xì)胞損失的一種常見代謝性疾病，是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病等諸多心腦血管疾病主要危險(xiǎn)因素[1]。流行病學(xué)研究證實(shí)，高膽固醇是動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)，也是引起動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)病率上升的關(guān)鍵原因[2]。降低脂質(zhì)水平、改善脂質(zhì)堆積情況對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的發(fā)生發(fā)展具有一定的延緩作用[3]。膽固醇不溶于水，在血液中的運(yùn)輸主要以脂蛋白顆粒介導(dǎo)，LDL 是運(yùn)載膽固醇的主要載體，其在血管組織中過度積累，可造成一系列心腦血管問題[4]。研究證實(shí)，增加低密度脂蛋白受體（LDLR）的活性可降低LDL濃度，從而降低動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)[5]。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）與LDLR親和力較強(qiáng)，可與肝臟LDLR 結(jié)合，并誘導(dǎo)LDLR在溶酶體中降解，減少LDLR 的再循環(huán)，通過靶向調(diào)節(jié)PCSK9/LDLR 通路可有效改善膽固醇代謝和血脂異常[6]。

芒果苷是知母根莖中提取的活性成分，具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化活性和降糖、調(diào)脂功能，然而由于芒果苷水溶性差，生物利用度低，難以制備穩(wěn)定藥液，使其臨床應(yīng)用受限[7-8]。本研究前期參考鄧家剛等[9]方法合成芒果苷單鈉鹽，提高了其溶解性。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通過建立高膽固醇血癥大鼠模型，觀察芒果苷單鈉鹽對(duì)大鼠脂代謝和膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用，并探討其調(diào)控PCSK9/LDLR 信號(hào)通路發(fā)揮作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)SD 大鼠50 只，雄性，4 周齡，體質(zhì)量180～220 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（冀）2021-002]，實(shí)驗(yàn)開始前1 周于溫度（25±2）℃、相對(duì)濕度（45±5）%的SPF 級(jí)動(dòng)物房中適應(yīng)性喂養(yǎng)，保持12 h 光照與黑暗各半。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)滄州市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過，倫理審批號(hào)2022-102-01。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

AU480 全自動(dòng)生化分析儀（美國Beckman Coulter 公司），GENIOSPLOS 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司），RM 2235 石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司），DM750 光學(xué)顯微鏡（德國Leica 公司），DYY-Ⅲ-8B電泳儀（上海納識(shí)生物科技有限公司），Bio-Profil GDS 凝膠成像系統(tǒng)（法國URMAT 公司），ABI750熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）。

1.3 藥品和試劑

阿托伐他汀鈣片（規(guī)格20 mg/片，批號(hào)220221）購自齊魯制藥有限公司；芒果苷單鈉鹽為實(shí)驗(yàn)室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%；大鼠基礎(chǔ)飼料、高脂飼料（豬油4.5%、膽固醇2%，膽酸鹽0.3%）購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司；蘇木精-伊紅染色（HE）試劑盒（批號(hào)228107）購自上海生工生物工程有限公司；PCSK9、LDLR、β-actin 鼠單克隆抗體（批號(hào)058107、059653、052041）購自美國Santa Cruz 公司，；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)DR061A、D531A）購自日本TaKaRa 公司；基因上下游引物（貨號(hào)S0618）由上海捷瑞生物工程有限公司提供。

1.4 模型建立和分組治療

SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后稱體質(zhì)量標(biāo)記，按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、阿托伐他汀鈣片組、芒果苷單鈉鹽組，每組各10 只。對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余各組給予高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)4 周以復(fù)制高膽固醇血癥模型，以血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平顯著升高為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。模型制備成功后，阿托伐他汀鈣片組參照文獻(xiàn)報(bào)道[10]ig 給予阿托伐他汀鈣片生理鹽水混懸液5 mg/kg 干預(yù)，芒果苷單鈉鹽組根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果ig 給予80 mg/kg，1 次/d，給藥8 周；對(duì)照組、模型組ig 等體積生理鹽水。ig 期間，對(duì)照組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余大鼠繼續(xù)給予高脂飼料。

1.5 體質(zhì)量和肝臟指數(shù)觀察

各組于末次給藥后稱量大鼠體質(zhì)量，處死后稱取肝組織，去除包膜，稱取肝臟濕質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)：肝臟指數(shù)＝肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6 血脂及血清酶水平檢測

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12 h，麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈采血并處死，血液樣本置于無菌試管，3 000 r/min（離心半徑4 cm）離心15 min 后取血清，分裝放置于-20 ℃保存待測。臨測前于室溫下平衡1 h，3 000 r/min 離心15 min，采用自動(dòng)生化分析儀檢測血清中三酰甘油（TG）、TC、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、LDL-C 以及肌酐（CRE）、血清尿素（UREA）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）的水平。

1.7 肝組織游離膽固醇（FC）、總膽汁酸（TBA）檢測

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水12 h，麻醉取血后處死，取部分肝組織，加入預(yù)冷生理鹽水后，勻漿機(jī)制成10%肝組織勻漿，3 000 r/min 離心15 min 去除雜質(zhì)，取組織上清凍存于-20 ℃?zhèn)溆?。組織上清于室溫下平衡1 h，3 000 r/min 離心15 min，采用自動(dòng)生化分析儀檢測FC 和TBA 的含量。

1.8 肝組織病理學(xué)觀察

大鼠麻醉處死后取肝組織，切取部分邊緣齊整的組織置于10%福爾馬林溶液中浸泡，固定48 h 后經(jīng)各級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，于液體石蠟中包埋，切片機(jī)作5 μm 厚切片，經(jīng)蘇木精染色，1%鹽酸乙醇分化，伊紅染色后，再進(jìn)行脫水及封片，于正置光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)改變并攝像。

1.9 肝組織PCSK9、LDLR 蛋白表達(dá)檢測

大鼠麻醉處死后取肝組織100～200 mg 分裝保存于-80 ℃待測，檢測前將組織解凍，無菌剪剪碎成若干碎塊，加入RIPA 裂解液于冰上裂解，采用BCA 法測定裂解上清蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度加入RIPA 和Loading Buffer 稀釋。制膠后上樣10 μL 蛋白樣品，電泳分離，轉(zhuǎn)膜后加入5%封閉液封閉，滴加一抗（PCSK9、LDLR、β-actin 鼠單克隆抗體，1∶1 000 稀釋）于4 ℃過夜，滴加二抗（HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 抗體，1∶5 000 稀釋）于室溫孵育2 h，加入顯影劑后，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，Image J 軟件分析各蛋白條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算PCSK9、LDLR 的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10 肝組織白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、CD68、PCSK9、LDLR mRNA 表達(dá)檢測

大鼠麻醉處死后取肝組織50 mg 分裝保存于-80 ℃待測，檢測前將組織解凍，無菌剪剪碎成若干碎塊，Trizol 一步法提取肝組織總RNA，紫外分光光度法檢測總RNA 濃度，取2 μg 組織RNA 逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA，以cDNA 為模板，檢測IL-1β、CD68、PCSK9、LDLRmRNA 表達(dá)。IL-1β 上游引物：5’-TGGCAACTGTCCCTGAACTC-3’，下游引物：5’-GTCGAGATGCTGCTGTGAGA-3’；CD68 上游引物：5’-AATGTGTCCTTCCCACAAGC-3’，下游引 物：5’-GGCAGCAAGAGAGATTGGTC-3’ ；PCSK9 上游引物：5’-GGAACCTGGAGCGGATTA CC-3’，下游引物：5’-GTCACACTTGCTGGCCTGT C-3’；LDLR 上游引物：5’-ACGGCGTCTCTTCCTA TGAGA-3’，下游引物：5’-CCCTTGGTATCCGCAA CAGA-3’；β-actin 上游引物：5’-CACGATGGAGG GGCCGACCATC-3’，下游引物：5’-TAAAGACCTC TATGCCAACCAGT-3’。反應(yīng)條件為：95 ℃、2 min，變性、退火、延伸各為95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，72 ℃、15 s，交替重復(fù)40 個(gè)循環(huán)，以β-actin 為內(nèi)參，目的基因mRNA 相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件分析，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以表示。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量和肝臟指數(shù)變化

與對(duì)照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)增加明顯（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀鈣片組、芒果苷單鈉鹽組體質(zhì)量、肝臟指數(shù)均明顯下降（P＜0.05），見表1。

表1 各組體質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較（，n=10）Table 1 Comparison of weight and liver index in each group (,n=10)

表1 各組體質(zhì)量、肝臟指數(shù)比較（，n=10）Table 1 Comparison of weight and liver index in each group (,n=10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group

2.2 血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平

與對(duì)照組相比，模型組血清中的TC、LDL-C 水平明顯升高，HDL-C 水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，阿托伐他汀鈣片組、芒果苷單鈉鹽組的血清TC、LDL-C 的水平明顯下降，HDL-C水平明顯升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比較（，n=10）Table 2 Comparison of serum levels of TC,TG,HDL-C,and LDL-C in each group (,n=10)

表2 各組血清TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平比較（，n=10）Table 2 Comparison of serum levels of TC,TG,HDL-C,and LDL-C in each group (,n=10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group

2.3 肝臟FC、TBA 含量

與對(duì)照組相比，模型組肝組織中FC 含量明顯升高，TBA 含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組大鼠相比，阿托伐他汀鈣片組、芒果苷單鈉鹽組肝組織中FC 含量明顯下降，TBA 含量升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組肝組織FC、TBA 含量比較（，n=10）Table 3 Comparison of FC and TBA contents in liver tissues of each group (,n=10)

表3 各組肝組織FC、TBA 含量比較（，n=10）Table 3 Comparison of FC and TBA contents in liver tissues of each group (,n=10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group

2.4 血清CRE、UREA、CK、LDH 水平

與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中CRE、UREA、CK、LDH 水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀鈣片組、芒果苷單鈉鹽組血清CRE、UREA、CK、LDH 的水平明顯下降（P＜0.05），見表4。

表4 各組血清CRE、UREA、CK、LDH 水平比較（，n=10）Table 4 Comparison of serum levels of CRE,UREA,CK,and LDH in each groups (,n=10)

表4 各組血清CRE、UREA、CK、LDH 水平比較（，n=10）Table 4 Comparison of serum levels of CRE,UREA,CK,and LDH in each groups (,n=10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05*P <0.05 vs control group;#P <0.05 vs model group

2.5 肝組織病理形態(tài)學(xué)變化

HE 染色顯示，對(duì)照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)良好，肝小葉完整，輪廓清晰，肝細(xì)胞排列規(guī)整，未見脂肪變性；模型組大鼠肝細(xì)胞索紊亂，可見中性粒細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞腫脹，伴空泡樣脂肪變性；與模型組相比，阿托伐他汀鈣片組、芒果苷單鈉鹽組干預(yù)后均緩解了大鼠肝臟損傷，肝細(xì)胞索排列較模型組整齊，脂肪變性減輕，見圖1。

圖1 各組肝組織病理形態(tài)學(xué)變化（HE，×200）Fig.1 Histopathologic changes of liver tissue in each group(HE,×200)

2.6 肝組織IL-1β、CD68 mRNA 表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織中IL-1β、CD68mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀鈣片組、芒果苷單鈉鹽組肝組織中IL-1β、CD68mRNA 表達(dá)明顯減少（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組肝組織IL-1β、CD68 的mRNA 表達(dá)（，n=5）Fig.2 mRNA Expression of IL-1β and CD68 in liver tissues of each group (,n=5)

2.7 各組肝組織PCSK9、LDLR 的蛋白及mRNA表達(dá)

與對(duì)照組相比，模型組肝組織中PCSK9 的蛋白和mRNA 水平均顯著升高，LDLR 的蛋白和mRNA 水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，阿托伐他汀鈣片組、芒果苷單鈉鹽組肝組織中PCSK9 的蛋白和mRNA 水平明顯降低，LDLR 的蛋白和mRNA 水平明顯升高（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組肝組織PCSK9、LDLR 的蛋白及mRNA 表達(dá)（,n=5）Fig.3 Protein and mRNA expressions of PCSK9 and LDLR in liver tissues of each group (,n=5)

3 討論

長期高膽固醇可引起脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致LDL、極低密度脂蛋白（VLDL）過度積累，損傷內(nèi)皮細(xì)胞并刺激炎性細(xì)胞因子釋放，促使單核細(xì)胞分化形成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞將過度積累的脂質(zhì)吞噬，最終形成泡沫細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病病變的發(fā)展中起到重要作用[11]。因此，降低LDL-C 水平，減少脂質(zhì)積累已成為降低動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的中心目標(biāo)[12]。

LDLR 是分布于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及肝臟中的一種膜鑲嵌式糖蛋白，主要通過對(duì)LDL、VLDL 等脂蛋白的內(nèi)吞作用將血液中的LDLC 攝取入細(xì)胞，并直接分解代謝[13]。有報(bào)道表明，血液中約有70%的LDL-C 通過LDLR 介導(dǎo)的內(nèi)吞作用清除[14]。在機(jī)體LDLR 數(shù)量或功能出現(xiàn)異常時(shí)，可造成膽固醇水平異常，引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病等心血管疾病[15]。PCSK9 是一種具有脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)作用的基因，通過與細(xì)胞表面的LDLR結(jié)合形成PCSK9/LDLR 復(fù)合物，PCSK9/LDLR 隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體隔室，誘導(dǎo)LDLR 降解，減少LDLR再循環(huán)，從而降低血清LDL 的清除率，導(dǎo)致LDLC 水平升高[16]。目前PCSK9 已作為動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的新興治療靶點(diǎn)成為研究熱點(diǎn)。在高膽固醇血癥模型中，通過抑制PCSK9，上調(diào)LDLR的表達(dá)水平可達(dá)到降低血脂水平，改善膽固醇代謝的作用[17]。

芒果苷又名知母寧，是由知母根莖中提取分離的雙苯吡酮類黃酮類活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗炎、抗病毒、抗氧化活性及降糖、保肝、調(diào)節(jié)血脂等功能，在心血管、呼吸及中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中可發(fā)揮作用[18]。有研究將芒果苷進(jìn)行結(jié)果修飾轉(zhuǎn)化成鈉鹽，得到芒果苷單鈉鹽，改善了其溶解性[9]。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，芒果苷單鈉鹽可有效改善小鼠糖脂代謝，減輕胰島素抵抗[19]。本實(shí)驗(yàn)采用SD 大鼠制備高膽固醇血癥模型，連續(xù)ig 芒果苷單鈉鹽，結(jié)果顯示，芒果苷單鈉鹽能夠有效改善大鼠脂代謝異常，降低血液中TC、LDL-C 水平及肝組織中FC 含量，提升肝組織TBA 的含量；HE 染色結(jié)果可見，經(jīng)治療后大鼠肝臟脂肪變性明顯改善，證實(shí)了其調(diào)脂、改善肝臟脂質(zhì)堆積作用。同時(shí)，大鼠血清相關(guān)酶類CRE、UREA、CK、LDH 的水平均有較為顯著地降低，提示芒果苷單鈉鹽可改善高脂引起的腎臟功能和心肌血氧功能損害。

巨噬細(xì)胞激活后可分泌IL-1β 等炎性因子，造成肝臟炎性浸潤[20]。本研究中，經(jīng)芒果苷單鈉鹽干預(yù)后大鼠肝組織中IL-1β和巨噬細(xì)胞標(biāo)記物CD68的mRNA 水平均明顯降低，提示芒果苷單鈉鹽可通過抑制巨噬細(xì)胞活化減輕肝臟炎癥反應(yīng)，發(fā)揮調(diào)脂和保肝的雙重作用。進(jìn)一步探究其對(duì)PCSK9/LDLR途徑的作用發(fā)現(xiàn)，模型組肝組織中PCSK9 的蛋白和mRNA 表達(dá)較對(duì)照組顯著增多，LDLR 的蛋白和mRNA 表達(dá)明顯減少，芒果苷單鈉鹽干預(yù)后，明顯下調(diào)了PCSK9 表達(dá)水平的升高，同時(shí)上調(diào)了LDLR的水平。

綜上所述，芒果苷單鈉鹽可有效降低高脂飼料引起的脂質(zhì)代謝紊亂，改善肝臟脂質(zhì)堆積和炎癥，減輕心腎功能損害，其作用機(jī)制可能與調(diào)控肝臟PCSK9/LDLR 信號(hào)通路相關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突