王莉平，郭金明，付永濤*，張娜，張紅霞，許冰

1.邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

2.石家莊市第四醫(yī)院，河北 石家莊 050000

3.邯鄲市邯鋼醫(yī)院，河北 邯鄲 056001

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種較常見的慢性自身免疫性疾病，男女患者比例約1∶9，以20～40 歲育齡期女性較為多見[1]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡呈反復發(fā)作、遷延難愈的特點，可導致多臟器損傷，有文獻報道超過70%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者并發(fā)不同程度腎損傷，其中約20%的患者最終發(fā)展為終末期腎病，是導致系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者死亡的主要因素[2]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡病理機制復雜，其中炎癥反應是系統(tǒng)性紅斑狼瘡所致多臟器并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。研究證實，腎炎是系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎損傷發(fā)展為終末期腎病的重要病理通路[3-4]。Toll 樣受體9/髓樣分化因子88/核因子-κB（TLR9/MyD88/NF-κB）是機體炎癥反應機制中重要的信號傳導通路，有文獻報道通過抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路及其介導的炎癥反應，可有效減輕系統(tǒng)性紅斑狼瘡所致腎損傷[5-7]。

羥氯喹化學結(jié)構(gòu)屬于4-氨基喹啉衍生物，臨床上常用于類風濕關(guān)節(jié)炎以及潛在不良反應較小藥物療效不佳的盤狀紅斑狼瘡、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療。研究證實，羥氯喹具有抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡所致視網(wǎng)膜病變、動脈粥樣硬化等并發(fā)癥的作用[8-9]，并且羥氯喹能夠通過抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路相關(guān)蛋白表達對小鼠腸炎和肝缺血再灌注損傷起到保護作用[10-11]。但羥氯喹是否能通過TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路對系統(tǒng)性紅斑狼瘡所致腎損傷起到治療作用尚未見文獻報道，本研究通過制備系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型，探討羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷的影響，并基于TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路探索其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45 只清潔級雌性BALB/c 小鼠，7～8 周齡，體質(zhì)量19～22 g，購自河北伊維沃生物科技有限公司[SCXK（冀）2020-002]。在12 h/12 h 光暗交替、室溫23～25 ℃、相對濕度45%～65%的條件下飼養(yǎng)，自由進食飲水。實驗過程遵循減少、替換、優(yōu)化的原則給予實驗動物人道主義關(guān)懷。實驗方案獲得邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員通過，倫理批件號HDZXLL（K）2022-013。

1.2 藥物和試劑

硫酸羥氯喹片（上海上藥中西制藥有限公司，規(guī)格0.1 g，批號2021S03018）；TLR9 抑制劑ODN2088（美國CST 公司，批號21A004F27）；降植烷（美國Sigma 公司，批號07162S）；ELISA 法抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體檢測試劑盒（北京華英生物技術(shù)研究所，貨號HY-2458）；磺基水楊酸法尿蛋白（UTP）、分光光度法血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）試劑盒（北京索萊寶公司，貨號BC8141、BC4910、BC1530、SEKM-0031、SEKM-0034、SEKM-0004、SEKM-0007）；蘇木精-伊紅染色法（HE）試劑盒（上海碧云天生物科技公司，貨號C0105M）；Masson染色試劑盒、IgG 二抗、ECL 顯色液（北京博奧森生物技術(shù)公司，貨號S0075、bs-0293P、C05-07004）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR 擴增試劑盒、TRIzol 試劑、RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量試劑盒（北京索萊寶公司，貨號RP1100、RP1105、R1100、R0010、PC0020）；TLR9、MyD88、NF-κB p65、β-actin 抗體（美國Santa Cruz 公司，貨號sc-52966、sc-37016、sc-54135、sc-13074）。

1.3 主要儀器

AU-480 型全自動生化分析儀（美國Beckman公司）；1510 型酶標儀（美國Thermo Fisher 公司）；RM2245 型石蠟組織切片機（德國Leica 公司）；MIKRO 220R 型高速冷凍離心機（德國Hettich 公司）；QuantStudio 5 型PCR 儀（美國ABI 公司）；552BR 型電泳儀（美國Bio-Rad 公司）；DYY-7C 型轉(zhuǎn)模儀（北京六一生物技術(shù)公司）；5200 型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模、分組與給藥 隨機取45 只BALB/c 小鼠中的8 只設(shè)為對照組，剩余37 只則參照馬松鶴等[12]報道的方法，通過ip 降植烷0.5 mL 構(gòu)建系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型，6 個月后血清ds-DNA 抗體水平顯著升高且尿蛋白呈強陽性（＋＋＋＋），則可判定系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型構(gòu)建成功[12]。共成模33 只，去除ds-DNA 抗體水平最低的1 只后，將剩余的32 只成模小鼠隨機分為模型組、羥氯喹組、ODN2088 組、硫酸羥氯喹片＋ODN2088 組，每組8 只。羥氯喹組ig 80 mg/kg（根據(jù)人與小鼠劑量換算公式計算所得），ODN2088 組ip 給藥4 mg/kg[13]，羥氯喹＋ODN2088 組ig 硫酸羥氯喹片80 mg/kg 和ODN2088 4 mg/kg，對照組和模型組ig 給予生理鹽水，各組均1 次/d 給藥連續(xù)治療5 周。

1.4.2 標本采集 末次給藥2 h后稱量大鼠體質(zhì)量，每隔2 h 通過按壓腹腔收集尿液，共收集24 h 的尿液備檢。通過摘眼球取血1 mL 后離心（2 000 r/min，5 min）取血清，-20 ℃保存?zhèn)錂z。頸椎脫臼處死后，開腹取雙側(cè)腎臟，4 ℃生理鹽水沖洗干凈后稱量雙側(cè)腎質(zhì)量，然后左側(cè)腎臟-20 ℃保存?zhèn)錂z，右側(cè)腎臟置于10%中性甲醛溶液實施固定。

1.4.3 腎臟指數(shù)（RI）按照以下公式計算RI。

RI＝雙側(cè)腎質(zhì)量/體質(zhì)量

1.4.4 24 h-UTP 及血清Scr、BUN 水平檢測 取收集的24 h 尿液，遵照試劑盒說明處理后，采用磺基水楊酸法檢測24 h-UTP 含量。取血清，遵照試劑盒說明進行處理后，采用分光光度法檢測血清Scr、BUN 水平。

1.4.5 腎組織病理學檢查及纖維化狀況觀察 取經(jīng)10%中性甲醛溶液固定72 h 后的右側(cè)腎臟，梯度乙醇溶液脫水處理后浸蠟包埋，4 μm 厚度連續(xù)切片、貼附于涂有多聚賴氨酸的防脫載玻片上，經(jīng)梯度乙醇溶液脫蠟水化后按照試劑盒操作說明行HE染色，顯微鏡觀察腎組織病理學改變，參照王雙[14]報道的方法進行病理評分，即（1）腎小球病理評分：未見異常，記0 分；出現(xiàn)系膜增生、炎性細胞浸潤，為輕度，記1 分；在輕度基礎(chǔ)上出現(xiàn)內(nèi)皮細胞增生，為中度，記2 分；在中度基礎(chǔ)上出現(xiàn)新月體樣病變，為重度，記3 分。（2）腎小管病理評分：未見異常，記0 分；受損腎小管數(shù)量占腎小管總數(shù)＜25%、25%～50%、＞50%～75%、＞75%分別記1、2、3、4 分。

按照試劑盒操作說明行Masson 染色，顯微鏡下觀察腎組織纖維化狀況，Masson 染色圖片中藍色為膠原纖維著色計算膠原容積分數(shù)（CVF）。

CVF＝藍染面積/總面積

1.4.6 腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4 檢測 取部分左側(cè)腎組織，加入適量生理鹽水后研磨勻漿，離心（3 500 r/min，10 min）取上清液，遵照試劑盒說明進行處理后，采用ELISA 法檢測腎組織IFNγ、TNF-α、IL-2、IL-4 水平。

1.4.7 腎組織TLR9、MyD88、NF-κBp65 mRNA 表達檢測 取部分左側(cè)腎組織剪碎后，加入4 ℃TRIzol試劑提取腎組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA 為模板通過PCR 儀行基因擴增反應，反應條件設(shè)置：95 ℃預變性2 min，然后95 ℃變性15 s、55 ℃退火15 s，共進行40 個循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參以公式2-ΔΔCt計算TLR9、MyD88、NF-κB p65mRNA 相對表達量。PCR 引物由生工生物工程（上海）公司提供，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4.8 腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白表達檢測 取左側(cè)腎組織100 mg，加入1 mL 4 ℃ RIPA裂解液研磨勻漿提取總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，均取30 μg 蛋白量上樣，通過10% SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)PVDF 膜、室溫5%脫脂奶粉封閉1.5 h 后，加TLR9（1∶1 000）、MyD88（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶800）、β-actin（1∶2 000）抗體稀釋液4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗（1∶2 000）稀釋液室溫孵育1 h，洗膜后ECL 顯影，蛋白相對表達量以其與內(nèi)參蛋白（β-actin）灰度值比值表示。

1.5 統(tǒng)計學處理

運用統(tǒng)計學軟件SPSS 20.0 進行處理。計量資料符合正態(tài)分布以表示，多組間均數(shù)行單因素方差分析，兩組間比較行LSD-t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 羥氯喹對小鼠體質(zhì)量和RI 的影響

與對照組比較，模型組體質(zhì)量顯著降低，RI 顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組體質(zhì)量顯著升高，RI 顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組和ODN2088組比較，羥氯喹＋ODN2088 組體質(zhì)量顯著升高，RI顯著降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 羥氯喹對小鼠體質(zhì)量和RI 的影響（，n=8）Fig.1 Effects of hydroxychloroquine on body mass and RI in mice (,n=8)

2.2 羥氯喹對小鼠24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平的影響

與對照組比較，模型組24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組、ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088組24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平顯著降低（P＜0.05），見圖2。

圖2 羥氯喹對小鼠24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平的影響（，n=8）Fig.2 Effects of hydroxychloroquine on 24 h-UTP and the level of Scr,BUN in serum in mice (,n=8)

2.3 羥氯喹對小鼠腎組織病變的影響

對照組小鼠腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)未見病理性改變。模型組小鼠腎組織呈現(xiàn)明顯的病理性改變，包括腎小球系膜增生、炎性細胞浸潤、內(nèi)皮細胞增生以及新月體樣病變；腎小管上皮細胞空泡樣變、壞死呈顆粒狀；腎間質(zhì)炎性細胞浸潤。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎組織病理性改變均明顯改善，其中羥氯喹＋ODN2088組效果優(yōu)于羥氯喹組和ODN2088 組。

與對照組比較，模型組腎小球和腎小管病理評分顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎小球和腎小管病理評分顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組和ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088 組腎小球和腎小管病理評分顯著降低（P＜0.05），見圖3、4。

圖3 羥氯喹對小鼠腎組織病變的影響（HE 染色，×400）Fig.3 Effects of hydroxychloroquine on renal histopathological changes in mice (HE staining,×400)

圖4 羥氯喹對小鼠腎組織腎小球和腎小管病理評分的影響（，n=8）Fig.4 Effects of hydroxychloroquine on the pathological scores of glomeruli,renal tubules in mice (,n=8)

2.4 羥氯喹對小鼠腎組織纖維化的影響

對照組小鼠腎組織腎小球系膜區(qū)和腎小管周圍間質(zhì)區(qū)可見少量散在分布的膠原纖維。與對照組比較，模型組小鼠腎組織膠原纖維明顯增多，以腎小管周圍間質(zhì)區(qū)膠原纖維沉積最多。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組膠原纖維明顯減少，其中羥氯喹＋ODN2088 組效果優(yōu)于羥氯喹組和ODN2088 組。

與對照組比較，模型組腎組織CVF 顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組CVF 顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹和ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088組CVF 顯著降低（P＜0.05），見圖5、6。

圖5 羥氯喹對小鼠腎組織纖維化的影響（Masson 染色，×400）Fig.5 Effects of hydroxychloroquine on renal fibrosis in mice (Masson staining,×400)

圖6 羥氯喹對小鼠腎組織CVF 的影響（，n=8）Fig.6 Effects of hydroxychloroquine on renal CVF in mice(,n=8)

2.5 羥氯喹對小鼠腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4 水平的影響

與對照組比較，模型組腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平顯著升高，IL-2 水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平顯著降低，IL-2 水平顯著升高（P＜0.05）。與羥氯喹組和ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088 組腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平顯著降低，IL-2 水平顯著升高（P＜0.05），見圖7。

圖7 羥氯喹對小鼠腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4 水平的影響（，n=8）Fig.7 Effects of hydroxychloroquine on the level of IFN-γ,TNF-α,IL-2,IL-4 in renal tissue in mice (,n=8)

2.6 羥氯喹對小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 mRNA 表達的影響

與對照組比較，模型組腎組織TLR9、MyD88、NF-κBp65mRNA 相對表達量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎組織TLR9、MyD88、NF-κBp65mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組或ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088 組腎組織TLR9、MyD88、NF-κBp65mRNA 相對表達量顯著降低（P＜0.05），見圖8。

2.7 羥氯喹對小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白相對表達量顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，羥氯喹組、ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05）。與羥氯喹組和ODN2088 組比較，羥氯喹＋ODN2088 組腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 蛋白相對表達量顯著降低（P＜0.05），見圖9、10。

圖9 羥氯喹對小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65蛋白表達的影響Fig.9 Effects of hydroxychloroquine on the expression of TLR9,MyD88,NF-κB p65 proteins in renal tissue in mice

圖10 羥氯喹對小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65蛋白相對表達量的影響（，n=8）Fig.10 Effect of hydroxychloroquine on the relative expression of TLR9,MyD88,NF-κB p65 proteins in renal tissue in mice (,n=8)

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡動物模型主要有自發(fā)型、誘發(fā)型、基因調(diào)控型3 類，其中誘發(fā)型具有操作簡單易行、成模周期短、經(jīng)濟適用且與人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡病理特征接近的優(yōu)勢，是系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)動物實驗研究常用且普遍認可的造模方法，降植烷是最常用的誘發(fā)劑[15]。本研究結(jié)果顯示，系統(tǒng)性紅斑狼瘡模型小鼠體質(zhì)量降低，RI、24 h-UTP、血清Scr、BUN 水平升高，腎組織呈現(xiàn)腎小球系膜和內(nèi)皮細胞增生、新月體樣變、炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞空泡樣變、壞死呈顆粒狀，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤、膠原纖維沉積，與馬松鶴等[12]和談欣怡等[16]報道一致。經(jīng)羥氯喹治療可顯著提高系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠體質(zhì)量，降低RI、24 h-UTP 和血清Scr、BUN 水平，明顯改善系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織病變和纖維化狀況，降低腎小球、腎小管病理評分和CVF，該結(jié)果與王蕊等[17]研究結(jié)果相似。表明羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷具有保護作用，對腎功能具有改善作用。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是與環(huán)境、遺傳、免疫、激素等多因素相關(guān)的一種自身免疫性疾病，研究證實，T 細胞和B 淋巴細胞異常活化導致免疫功能紊亂及免疫復合物沉淀，進而引發(fā)IFN-γ、TNF-α、IL-4 等炎癥因子大量分泌是系統(tǒng)性紅斑狼瘡及其并發(fā)癥進行性加重的重要機制[18]。TNF-α 具有炎性趨化屬性，可誘導炎癥因子進一步釋放而加重炎癥反應，并促進炎性浸潤。此外，IFN-γ 被視為系統(tǒng)性紅斑狼瘡病理機制的中樞介質(zhì)，De Ceuninck 等[19]報道靶向抑制IFN-γ 對自身免疫性疾病具有一定的治療作用；IL-4 可促進B 細胞活化，Gao 等[20]報道系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性與IL-4 水平升高相關(guān)；IL-2 對系統(tǒng)性紅斑狼瘡進展表現(xiàn)為逆向調(diào)控作用，Miao 等[21]報道給予少量IL-2 對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者具有一定的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)羥氯喹治療可顯著降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織IFN-γ、TNF-α、IL-4 水平，并提高IL-2 水平，這可能是羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷起到保護作用的重要機制。

Toll 樣受體（TLRs）是一類跨膜識別受體，其中TLR9 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者B 淋巴細胞中高表達，有文獻報道TLR9 高表達為系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病進展的危險因素[22]。NF-κB 為TLRs 下游靶蛋白，TLR9 可通過做為信號傳導介質(zhì)的MyD88 誘導NFκB 表達與活化，活化型NF-κB 核轉(zhuǎn)位后NF-κB p65亞基通過與DNA 特定位點結(jié)合而誘導IFN-γ、TNFα、IL-4 等因子轉(zhuǎn)錄表達，進而誘導炎癥反應[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)羥氯喹治療可顯著降低系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎組織TLR9、MyD88、NF-κB p65 mRNA 和蛋白表達量，提示羥氯喹抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎臟炎癥反應可能與抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路有關(guān)。該結(jié)果與吳瓊等[6,24]研究結(jié)果相似。為了證實上述推論，本研究設(shè)置了TLR9 抑制劑ODN2088 組和羥氯喹＋ODN2088 組，結(jié)果顯示，ODN2088 組對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎功能、腎組織病變、炎癥反應相關(guān)指標以及TLR9/MyD88/NF-κB信號通路的調(diào)控方向與羥氯喹組相同，且羥氯喹＋ODN2088 組對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠各檢測指標的調(diào)控作用顯著優(yōu)于羥氯喹組和ODN2088 組，從而進一步證實羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷的保護作用與抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路有關(guān)。

綜上所述，羥氯喹對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠腎損傷具有保護作用，對其腎功能具有改善作用，其機制可能與抑制TLR9/MyD88/NF-κB 信號通路，減輕炎癥反應有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突