王欣，史磊磊，張雨涵，李溪，張雪航，曾憲軍，劉繼平*

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046

2.西安天一秦昆制藥有限責(zé)任公司，陜西 西安 710077

小兒厭食癥是常見的脾胃系統(tǒng)疾病，其主要癥狀為長時間食欲不振，甚至厭惡進食，多發(fā)于1～6歲兒童，發(fā)病率為12%～34%，并有逐年增長的趨勢[1]。長期厭食會影響小兒生長發(fā)育，導(dǎo)致貧血、營養(yǎng)不良，并可造成機體免疫力下降，危害兒童身體健康[2]。小兒脾胃虛弱臟腑嬌嫩，若飲食不節(jié)，或喂養(yǎng)無度，極易引發(fā)厭食癥，其根本病位在于脾胃，脾胃不和為基本病機。小兒厭食癥證型多樣，包括脾失健運、脾胃氣虛、肝胃不和、胃陰不足、飲食積滯、脾胃濕熱、脾胃虛寒、及脾虛蟲積等[3]?！蹲C治匯補·卷二》載：“不能食有虛有實，實則心下痞滿，惡心口苦，宜消導(dǎo)；虛則倦怠，面色萎黃，必心下軟和，實則飲食積滯中焦，壅遏脾胃運化，虛則脾胃虛損，運化無力”，因此基于“補”“通”兩法論治，可暢通中焦氣機，促進氣血運行和生化和順并補益脾胃之虛損，恢復(fù)其正常的生理功能，化生精氣、濡養(yǎng)五臟。

補脾消積口服液由水紅花子、山楂、雞內(nèi)金等9 味中藥組成，為淡紅色至黃棕色液體，具有健脾燥濕、益氣消積的功效，用于小兒積滯、厭食，疳癥等屬脾虛夾有食積者。本品臨床療效確切，但缺乏實驗研究數(shù)據(jù)支撐，作用機制不明晰。因此本實驗采用冰水及豬油灌胃聯(lián)合飲食失節(jié)方法制備脾虛食積小鼠模型，給予補脾消積口服液進行干預(yù)，探究補脾消積口服液對脾虛食積癥胃腸功能及腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響，為該藥的臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

SPF 級昆明種小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自于成都達(dá)碩實驗動物有限公司，實驗動物許可證號為SCXK（川）2020-030。實驗動物飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實驗室，室溫控制在（23±3）℃，飼養(yǎng)動物期間給予正常飲水飲食。動物實驗經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（SUCMDL20220515001）。補脾消積口服液由西安天一秦昆制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，規(guī)格10 mL/支，產(chǎn)品批號220 422098；小兒健脾丸由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格3 g/丸，產(chǎn)品批號22010013。活性炭由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號Q/12HB 5029-2015。小鼠胃泌素（GAS）、胃動素（MTL）、血管活性腸肽（VIP）酶聯(lián)免疫法測定試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司。

BSA224S 型分析電子天平（北京賽多利）；UPHW-II-90T 型純水儀（成都超純科技）；1-15K 低溫高速離心機（美國Sigma）；Donatello 型脫水機（意大利Diapath）；JB-P5 型包埋機（武漢俊杰電子)；RM2016 型病理切片機、ICC50 W 型光學(xué)顯微鏡（德國徠卡儀器）；酶標(biāo)儀（美國Bio Tek Instruments）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 將50 只昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后，按隨機數(shù)字表法分為5 組，分別為空白組、脾虛食積模型組、補脾消積口服液低劑量組（臨床等效劑量）和高劑量組（臨床2 倍劑量）、小兒健脾丸陽性對照組，每組10 只。除空白組外，其余小鼠通過冰水及豬油ig 聯(lián)合飲食失節(jié)方法造成脾虛食積模型，第1 天小鼠自由進食，以10 mL/kg ig 4 次冰水混合物，第2 天小鼠禁食不禁水，以10 mL/kg ig 4 次冰水混合物；第3 天小鼠以4 ℃ ig 冰氫氧化鈉0.3 mol/L，每只0.1 mL，并每日以10 mL/kg ig 豬油1 次[4-5]，每3 天為1 個周期。造模40 d后，根據(jù)臨床給藥劑量以人體質(zhì)量60 kg 換算補脾消積口服液小鼠等效劑量即低劑量為6 mL/kg，并據(jù)此設(shè)置臨床2 倍劑量組即高劑量為12 mL/kg，并根據(jù)陽性藥臨床給藥劑量換算得出小兒健脾丸給藥劑量為2.7 g/kg，空白組和模型組每日ig 等體積生理鹽水1 次，連續(xù)給藥10 d。

1.2.2 各組小鼠腸推進及胃排空測定 給予禁食不禁水24 h 的小鼠新鮮配制的5%炭末混懸液0.2 mL/10 g。20 min 后處死小鼠，取胃，濾紙拭干后稱全質(zhì)量，沿胃大彎剪開胃體，預(yù)冷的生理鹽水洗去胃內(nèi)容物后擦干，稱凈質(zhì)量，計算胃內(nèi)殘留率。迅速取出小腸，剝離腸系膜后鋪平，測量小腸全長與炭末混懸液從幽門括約肌推至小腸末端的距離，計算小腸推進率。

胃內(nèi)殘留率=（胃全質(zhì)量－胃凈質(zhì)量）/灌服碳末混懸液質(zhì)量

小腸推進率＝幽門至碳末混懸液前沿的距離/幽門至回盲部全長

1.2.3 血清中胃泌素（GAS）、胃動素（MTL）、血管活性腸肽（VIP）的檢測 末次給藥后，各組小鼠禁食不禁水24 h，眼球取血后于4 ℃離心機，3 000 r/min 離心15 min，取上層血清。采用酶聯(lián)免疫試劑盒，按照說明書操作程序測定血清中胃腸激素水平。

1.2.4 胃腸組織形態(tài)的檢測 各組小鼠眼球取血后脫頸椎處死，取胃組織及距胃幽門1 cm 處的小腸1 cm，用生理鹽水沖洗胃腸組織表面后將其置入4%多聚甲醛固定液中固定。組織切片經(jīng)蘇木素-伊紅（HE）染色后，進行顯微鏡觀察及圖像采集分析。

1.2.5 高通量測序技術(shù)測定腸道菌群結(jié)構(gòu) 末次ig 24 h 后，收集空白組、模型組、補脾消積口服液低劑量組及陽性組小鼠盲腸內(nèi)容物，置于滅菌的EP 管中，-80 ℃凍存。采用SDS 方法對樣本的基因組DNA 進行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣本DNA 于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μL，以稀釋后的基因組DNA 為模板，根據(jù)16S V4 區(qū)引物（515F 和806R）進行擴增，使用帶Barcode 的特異引物，進行PCR。PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；對檢測合格的PCR 產(chǎn)物進行磁珠純化，采用酶標(biāo)定量，根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，對目的條帶使用qiagen 公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物，使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit 和Q-PCR 定量，文庫合格后，使用NovaSeq 6000進行上機測序。采用Tukey和Kruskal-Wallis 秩和檢驗，分析組間物種α 多樣性物種β 多樣性差異是否顯著。

α 多樣性可以反映物種的豐富度和均勻度，Simpson 指數(shù)表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度，Simpson 指數(shù)越大物種均勻度越好；Shannon 指數(shù)為樣品中的分類總數(shù)及其占比，Shannon 指數(shù)越大，群落多樣性越高，物種分布越均勻；Chao1 為估計群落樣品中包含的物種總數(shù)，ACE 為估計群落中OTU 數(shù)目。β 多樣性分析是對不同樣本的微生物群落構(gòu)成進行比較分析，基于weighted-unifrac算法得到各組小鼠UPGMA 聚類樹狀圖。NMDS 是基于Bray-Curtis 距離來進行分析的非線性模型，根據(jù)樣本中包含的物種信息，以點的形式反映在二維平面上。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 26.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以表示，方差齊使用ANOVA 分析，不齊使用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠腸推進及胃排空的影響

與空白組相比，模型組小腸推進率顯著降低（P＜0.05），胃內(nèi)殘留率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，補脾消積口服液低劑量組及小兒健脾丸組小腸推進率顯著升高（P＜0.01），胃內(nèi)殘留率顯著降低（P＜0.05、0.01），補脾消積口服液高劑量組小腸推進率升高，胃內(nèi)殘留率降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明補脾消積口服液可顯著增強脾虛食積小鼠胃腸蠕動能力，見表1。

表1 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠腸推進和胃內(nèi)殘留率的影響（,n=10）Table 1 Effect of Bupi Xiaoji Oral Liquid on intestine impelling and gastric residual rate in spleen deficient dyspepsia mice (,n=10)

表1 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠腸推進和胃內(nèi)殘留率的影響（,n=10）Table 1 Effect of Bupi Xiaoji Oral Liquid on intestine impelling and gastric residual rate in spleen deficient dyspepsia mice (,n=10)

與空白組比較：△P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01△P <0.05 vs blank group;*P <0.05 **P <0.01 vs model group

2.2 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠胃腸組織病理學(xué)變化的影響

由圖1 可見空白組小鼠胃黏膜組織結(jié)構(gòu)清楚，上皮細(xì)胞完整，腺體排列整齊；模型組胃黏膜基本完整，腺體排列紊亂，部分上皮細(xì)胞脫落破壞，胃腺體少量表層壞死，胃黏膜輕微充血；補脾消積口服液低劑量組胃黏膜較完整，腺體排列整齊，胃黏膜未見充血現(xiàn)象；補脾消積口服液高劑量組胃黏膜基本完整，腺體排列較紊亂，部分上皮細(xì)胞脫落破壞；小兒健脾丸組胃黏膜組織結(jié)構(gòu)清楚，上皮細(xì)胞完整，腺體排列較整齊。

圖1 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠胃組織形態(tài)的影響（HE 染色，×100）Fig.1 Effect of Bupi Xiaoji Oral Liquid on the morphology of gastric tissue in spleen deficient dyspepsia mice (HE,×100)

由圖2 可見空白組腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，黏膜肌層下層細(xì)胞排列整齊、層次清晰，腸絨毛排列整齊規(guī)則；模型組黏膜肌層變薄，腸絨毛變短且不規(guī)則、萎縮、缺失、脫落較嚴(yán)重并排列紊亂，絨毛數(shù)量減少，間距增寬；補脾消積口服液低劑量組腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，黏膜較厚，腸絨毛排列整齊；補脾消積口服液高劑量組黏膜肌層變薄，腸絨毛變短并排列紊亂，絨毛數(shù)量減少；小兒健脾丸組腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，層次清晰，黏膜較厚，腸絨毛排列整齊。

圖2 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠腸組織形態(tài)的影響（HE 染色，×40）Fig.2 Effect of Bupi Xiaoji Oral Liquid on the morphology of intestinal tissue in spleen deficient dyspepsia mice(HE,×40)

2.3 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠血清中GAS、MTL、VIP 的影響

與空白組相比，模型組小鼠血清中GAS與MTL水平顯著降低（P＜0.05），VIP 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，補脾消積口服液低劑量組及小兒健脾丸組小鼠血清中GAS 和MTL 水平顯著升高（P＜0.05、0.01），VIP 水平顯著降低（P＜0.05），補脾消積口服液高劑量組小鼠血清中GAS 與MTL水平升高，VIP 水平降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠胃腸激素的影響（,n=10）Table 2 Effect of Bupi Xiaoji Oral Liquid on gastrointestinal hormones in spleen deficient dyspepsia mice (,n=10)

表2 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠胃腸激素的影響（,n=10）Table 2 Effect of Bupi Xiaoji Oral Liquid on gastrointestinal hormones in spleen deficient dyspepsia mice (,n=10)

與空白組比較：△P＜0.05 △△P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01△P <0.05 △△P <0.01 vs blank group;*P <0.05 **P <0.01 vs model group

2.4 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠體內(nèi)腸道菌群的影響

2.4.1 補脾消積口服液對小鼠腸道菌群測序質(zhì)量評估結(jié)果 由圖3A 可知，各組小鼠稀釋曲線逐漸趨于平坦，提示測序數(shù)據(jù)量漸進合理。由圖3B 可知，各組小鼠在水平方向上曲線在橫軸上的跨度越大，豐富度越高。

圖3 各樣本稀釋曲線圖（A）和等級聚類曲線圖（B）Fig.3 Rarefaction curve (A) and rank abundance (B) of each sample

2.4.2 補脾消積口服液對小鼠腸道菌群多樣性及豐度影響

（1）α 多樣性分析：與空白組相比，模型組Simpson 指數(shù)、Shannon 指數(shù)顯著降低（P＜0.05），ACE 指數(shù)與Chao1 指數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，補脾消積口服液低劑量組與小兒健脾丸組Simpson 指數(shù)、Shannon 指數(shù)、ACE 指數(shù)和Chao1指數(shù)均升高（P＜0.05、0.01），說明補脾消積口服液可以改善脾虛食積小鼠腸道菌群的豐度和多樣性，見表3。

表3 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)的影響（,n=4）Table 3 Effect of Bupi Xiaoji Oral Liquid on Intestinal microbial population diversity index in spleen deficient dyspepsia mice (,n=4)

表3 補脾消積口服液對脾虛食積小鼠腸道菌群多樣性指數(shù)的影響（,n=4）Table 3 Effect of Bupi Xiaoji Oral Liquid on Intestinal microbial population diversity index in spleen deficient dyspepsia mice (,n=4)

與空白組比較：△P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01△P <0.05 vs blank group;*P <0.05 **P <0.01 vs model group

（2）β 多樣性分析：由圖4A 可知，模型組與補脾消積口服液低劑量組及小兒健脾丸組差異最大。由圖4B 可知，空白組、補脾消積口服液低劑量組與小兒健脾丸組大部分樣本點聚在一起，并與模型組區(qū)分開來，說明脾虛食積小鼠的腸道群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，經(jīng)補脾消積口服液治療后改善了腸道群落結(jié)構(gòu)。

圖4 各組小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的UPGMA 聚類樹狀圖（A）和NMDS 圖（B）Fig.4 UPGMA clustering tree (A) and NMDS (B) of intestinal microbes in mice from each group

2.4.3 補脾消積口服液對小鼠腸道菌群門水平的影響 各組小鼠在厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、變形桿菌門（Proteobacteria）為優(yōu)勢菌群，3 個門的總比例＞85%，各處理組菌群結(jié)構(gòu)相似，但菌群組成比例不同。與空白組相比，模型組小鼠腸道內(nèi)的有益菌擬桿菌門相對豐度下降，有害菌厚壁菌門相對豐度增加，但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組相比，補脾消積口服液低劑量組及小兒健脾丸組擬桿菌門相對豐度有所增加，厚壁菌門相對豐度有下降趨勢（P＜0.05），提示補脾消積口服液可通過改善腸道菌群達(dá)到治療效果，見圖5。

圖5 各組小鼠腸道菌群在門水平下的群落組成Fig.5 Intestinal microbes community composition in mice from each group at level of phylum

2.4.4 補脾消積口服液對小鼠腸道菌群屬水平的影響 屬水平上優(yōu)勢菌為葡萄球菌屬Staphylococcus、杜氏桿菌屬Dubosiella、乳桿菌屬Lactobacillus。與空白組相比，模型組葡萄球菌屬豐度升高（P＜0.05），杜氏桿菌屬、乳酸桿菌屬豐度降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與模型組比較，補脾消積口服液低劑量組葡萄球菌屬豐度降低（P＜0.01），杜氏桿菌屬及乳桿菌屬豐度升高；小兒健脾丸組葡萄球菌屬豐度降低（P＜0.05）、杜氏桿菌屬豐度降低，乳酸桿菌屬豐度升高，見圖6。

圖6 各組小鼠腸道菌群在屬水平下的群落組成Fig.6 The intestinal microbes community composition in mice from each group at level of genus

3 討論

根據(jù)小兒厭食癥的臨床特點，將之認(rèn)定在中醫(yī)學(xué)中的“疳證”“積滯”“不食”等范疇中[6]，中醫(yī)藥治療脾虛食積型小兒厭食癥有其獨特的優(yōu)勢，從病因病機的探討到施治均有理論指導(dǎo)，且中醫(yī)治法有較高的療效，不良反應(yīng)少[7]。補脾消積口服液中多味藥口味酸甜，相比中藥湯劑患兒更易接受，且方中諸藥已經(jīng)過長期中醫(yī)實踐的考察，安全性良好，對緩解脾虛食積型小兒厭食癥具有一定優(yōu)勢。

補脾消積口服液由水紅花子、山楂、雞內(nèi)金、六神曲、陳皮、檳榔、白術(shù)、白扁豆和大棗組成。方中各藥大多入脾胃經(jīng)發(fā)揮功效，為臨床治療脾胃虛弱常用藥物，各藥配伍可疏通氣機、消除氣滯、補氣健脾，全方補而不滯、滋而不膩，共奏益氣健脾和胃之功。本實驗將小腸推進率及胃內(nèi)殘留率作為補脾消積口服液的藥效評價指標(biāo)，結(jié)果表明補脾消積口服液低劑量組可顯著增強脾虛食積小鼠胃腸蠕動能力，改善胃腸動力，高劑量組療效與模型組無顯著性差異，提示藥效為臨床等效劑量時，治療效果最優(yōu)。

胃腸道可分泌消化酶和吸收營養(yǎng)物質(zhì)來消化機體攝入的物質(zhì)，胃腸道的正常功能對于維持生命至關(guān)重要，當(dāng)胃腸道受到外界刺激超出自身負(fù)荷時，胃腸道屏障功能的動態(tài)平衡會被打破，從而引發(fā)各種疾病[7]。腸道屏障由黏液層、上皮細(xì)胞以及黏膜免疫系統(tǒng)3 個部分組成，腸道屏障受損時，細(xì)菌、內(nèi)毒素會浸染機體，使胃腸道發(fā)生損傷，引起炎癥反應(yīng)等[8]。補脾消積口服液可明顯改善脾虛食積小鼠胃黏膜充血、腺體排列紊亂、小腸絨毛脫落、腸黏膜變短的現(xiàn)象，提示補脾消積口服液調(diào)節(jié)脾虛食積小鼠胃腸功能的機制可能與其改善胃腸組織形態(tài)相關(guān)。

胃腸激素是消化道內(nèi)分泌細(xì)胞和神經(jīng)元釋放的肽，目前已知30 多種激素基因在胃腸道中表達(dá)[9]。GAS 是胃腸道上皮發(fā)育和腫瘤轉(zhuǎn)化過程中的營養(yǎng)因子，可刺激胃底黏膜的酸分泌和生長，促進消化功能[10]；MTL 為上腸黏膜的內(nèi)分泌細(xì)胞，是胃腸運動的重要調(diào)節(jié)劑，MTL 與GAS 均為興奮性胃腸激素，可促進胃腸道運動，調(diào)節(jié)胃腸動力。VIP 為抑制性胃腸激素，會使食管下括約肌松弛，當(dāng)VIP 表達(dá)增強后，食管下括約肌在行使其運動功能時會受到阻礙[11]。本實驗表明補脾消積口服液可提高脾虛食積小鼠血清GAS、MTL 水平，降低VIP 水平，提示補脾消積口服液調(diào)節(jié)脾虛食積小鼠胃腸功能的機制可能與調(diào)節(jié)胃腸激素水平有關(guān)。

腸道是人體內(nèi)細(xì)菌存在的主要場所，這些復(fù)雜多樣的細(xì)菌形成了腸道菌群。人類腸道中有1 000多種細(xì)菌，腸道菌群的組成和比例與人體健康密切相關(guān)，擾亂腸道微生物平衡會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)引發(fā)各種胃腸或全身性疾病[12]。研究表明，腸道菌群可能是中醫(yī)“脾”的物質(zhì)基礎(chǔ)，而“脾”亦可能是維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)的重要前提，脾主運化功能健旺與腸道菌群維持穩(wěn)態(tài)共同保障機體吸收、代謝營養(yǎng)物質(zhì)，腸道菌群平衡是“脾氣健運”的重要體現(xiàn)，腸道菌群紊亂是“脾失健運”的病理體現(xiàn)。有研究證明，飲食結(jié)構(gòu)改變會影響腸道菌群結(jié)構(gòu)，如高脂肪高糖飲食小鼠腸道菌群中擬桿菌門的比例降低，厚壁菌門的比例增加，并降低了腸道菌群多樣性[13]。本實驗表明補脾消積口服液可提升脾虛食積小鼠腸道菌群多樣性，增加擬桿菌門比例，降低厚壁菌門比例，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，提示補脾消積口服液調(diào)節(jié)脾虛食積小鼠胃腸功能的機制可能與其恢復(fù)腸道菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)

本研究結(jié)果通過小鼠胃排空及腸推進實驗表明補脾消積口服液可顯著促進脾虛食積小鼠胃腸功能，其機制可能與補脾消積口服液改善脾虛食積小鼠胃腸組織形態(tài)、調(diào)節(jié)胃腸激素水平及恢復(fù)腸道菌群結(jié)構(gòu)等相關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突