畢艷艷 ，劉健 ，聶宗恒 ，王立友，周娜，郭田甜，蔣金星，郝大偉*

1.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006

2.經(jīng)方與現(xiàn)代中藥融合創(chuàng)新全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006

3.臨沂大學(xué)，山東 臨沂 276005

銀杏葉提取物中成分復(fù)雜，含總黃酮醇苷類、萜類內(nèi)酯、總銀杏酸和多糖等[1]，具有舒張血管、降低血糖血脂、防止血栓形成、抗氧化等作用[2-3]。但總銀杏酸含量過高會引起人體不良反應(yīng)，有致敏性、致突變、神經(jīng)毒性、細(xì)胞毒性等不良反應(yīng)[4-5]。因此，銀杏葉提取物的安全性已引起人們的高度重視。《中國藥典》2020 年版一部中銀杏葉提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定總銀杏酸必須小于5 mg/kg[6]，但按照藥典規(guī)定采用稀乙醇進(jìn)行提取，易引起總銀杏酸過量。因此需要對銀杏葉提取物進(jìn)行脫酸處理。常用脫酸的方法有微波輔助提取法[7]、超聲-溶劑萃取法[8]、配位法[9]、大孔樹脂吸附法[10]和超臨界二氧化碳脫除法[11]，其中大孔樹脂吸附脫酸具有易放大生產(chǎn)、生產(chǎn)成本小、對環(huán)境污染小、安全等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用更為廣泛。本研究采用單因素、響應(yīng)面法對銀杏葉提取物中總銀杏酸進(jìn)行大孔樹脂吸附脫酸工藝優(yōu)化，為銀杏葉提取物綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與材料

e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；R-300 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（瑞士Buchi 公司）；Alpha 2-4 LSCbasic 型冷凍干燥機(jī)（德國Christ 公司）；XS204型電子分析天平（Mettler Toledo）；100 mL 恒流反應(yīng)器泵＋DAC50 動態(tài)軸向壓縮柱（上海賽梵科分離技術(shù)有限公司）。

銀杏葉產(chǎn)地為山東臨沂郯城，批號200301，經(jīng)魯南厚普制藥有限公司范建偉高級工程師鑒定為銀杏科植物銀杏GinkgobilobaL.的干燥葉。總銀杏酸（其中總銀杏酸A 批號111594-201605，總銀杏酸B 批號111690-201905）、白果新酸（批號111594- 201605；質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.70%）、槲皮素（批號100081- 201610；質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.10%）對照品均購自于中國食品藥品檢定研究院。LXD-200、D101 大孔樹脂（西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司）；LK-02 大孔樹脂（山東魯抗立科藥業(yè)有限公司）；HPD5000 大孔樹脂（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司）；乙醇（費(fèi)縣大成酒業(yè)有限公司）；高效液相色譜儀用試劑均為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏葉粗提物的制備

稱取銀杏葉藥材，加入適量稀乙醇提取回流，濃縮回流液，加水冷沉，取上清液，經(jīng)預(yù)處理LX-158 大孔樹脂吸附，70%乙醇洗脫，收集適量洗脫液，干燥，得銀杏葉粗提物。其中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33.45%，總銀杏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1948%。

2.2 脫酸工藝

銀杏葉粗提物用70%乙醇溶解，以適當(dāng)體積流量通過預(yù)處理大孔樹脂柱（柱體積1 500 mL 為1 BV，徑高比1∶15）進(jìn)行上樣吸附，吸附完全后用適當(dāng)體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液以適當(dāng)體積流量洗脫，收集適量體積洗脫液，濃縮，凍干，即得銀杏葉提取物。

2.3 總銀杏酸去除率、總黃酮轉(zhuǎn)移率和提取物收率的測定

2.3.1 總銀杏酸測定 參考《中國藥典》2020 年版一部銀杏葉提取物中總銀杏酸的HPLC 法測定[6]。

色譜條件：Sepax-HP-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%三氟乙酸的乙腈-0.1%三氟乙酸的水，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長310 nm；進(jìn)樣量50 μL。理論塔板數(shù)按照白果新酸峰計算大于4 000。

按照《中國藥典》2020 年版一部規(guī)定配制供試品溶液、白果新酸和總銀杏酸對照品溶液。精密吸取供試品溶液、白果新酸和總銀杏酸對照品溶液各50 μL 注入高效液相色譜儀，計算供試品溶液與總銀杏酸對照品相應(yīng)色譜峰的總峰面積，以白果新酸對照品外標(biāo)法計算總銀杏酸，即得。

2.3.2 總黃酮測定 參考《中國藥典》2020 年版一部銀杏葉提取物中總黃酮醇苷的HPLC 法測定[6]。

色譜條件：Agilent 20RBAX EXtend-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.4%磷酸（50∶50）；體積流量0.8 mL/min；柱溫45 ℃；檢測波長360 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按照槲皮素峰計算大于5 000。

按照《中國藥典》2020 年版一部配制供試品溶液、槲皮素對照品溶液。精密吸取供試品溶液和槲皮素對照品溶液各10 μL 進(jìn)樣測定。以槲皮素對照品峰面積作為對照，按照《中國藥典》2020 年版一部中校正因子計算槲皮素、異鼠李素和山柰酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，按照總黃酮＝（槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)＋異鼠李素質(zhì)量分?jǐn)?shù)＋山柰酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)）×2.51 計算總黃酮。

2.3.3 總銀杏酸去除率、總黃酮轉(zhuǎn)移率和提取物收率的計算 按照以下公式計算3 個指標(biāo)。

R1＝（Ca×Ma－Cb×Mb）/（Ca×Ma）

R2=（Cd×Mb）/（Ce×Ma）

R3＝Mb/Ma

R1為總銀杏酸去除率，R2為總黃酮轉(zhuǎn)移率，R3為提取物收率，Ca為銀杏葉粗提物中總銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Ma為銀杏葉粗提物質(zhì)量，Cb為銀杏葉提取物中總銀杏酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Mb為銀杏葉提取物質(zhì)量，Cd為銀杏葉提取物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，Ce為銀杏葉粗提物中總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.4 脫酸大孔樹脂的篩選

參考文獻(xiàn)報道[12-13]，選取經(jīng)過預(yù)處理HDP5000、LK-02、LXD-200、D101 大孔樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附和解吸實(shí)驗(yàn)。考慮在實(shí)際生產(chǎn)中，在脫除總銀杏酸的同時應(yīng)盡可能降低有效成分銀杏總黃酮的損失，本研究從4 種大孔樹脂對總銀杏酸、總黃酮吸附率以及95%乙醇對總銀杏酸解吸率綜合考察篩選脫酸大孔樹脂的類型。

2.4.1 靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 稱取HPD5000、LK-02、LXD-200、D101 4 種大孔樹脂各10.00 g，置于100 mL 錐形瓶中，分別加入20.0 mL 銀杏葉粗提物乙醇溶液，室溫震蕩吸附24 h，使大孔樹脂吸附完全，濾過，取出大孔樹脂備用，取未吸附濾液測定總銀杏酸、總黃酮，計算不同類型大孔樹脂的吸附率，結(jié)果見表1。

表1 不同大孔樹脂的吸附率和解吸率Table 1 Adsorption and desorption rate of different resins

I＝（C1×V1－C2×V2）/（C1×V1）

I為吸附率，C1為上樣液中總銀杏酸或總黃酮質(zhì)量濃度，V1為上樣液體積，C2為未吸附濾液中總銀杏酸或總黃酮質(zhì)量濃度，V2為濾液體積

2.4.2 靜態(tài)解吸實(shí)驗(yàn) 將濾過后的大孔樹脂置于100 mL 錐形瓶內(nèi)，用蒸餾水沖洗除雜，加入95%乙醇50.0 mL，室溫震蕩洗脫24 h 后，濾過，得洗脫液，測定總銀杏酸，計算不同類型大孔樹脂的解吸率，結(jié)果見表1。

J＝（C3×V3）/（C1×V1－C2×V2）

J為解吸率，C1為上樣液中總銀杏酸質(zhì)量濃度，V1為上樣液體積，C2為未吸附濾液中總銀杏酸質(zhì)量濃度，V2為濾液體積，C3為洗脫液中總銀杏酸含質(zhì)量濃度，V3為洗脫液體積

可見LXD-200 對總銀杏酸的吸附率較高，HPD5000 對總黃酮的吸附率較低，總黃酮損失少；而LXD-200 對總銀杏酸的解吸率較高，說明大孔樹脂再生能力強(qiáng)，效果較好。綜合考慮，選取大孔樹脂LXD-200 用于后續(xù)脫酸工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

2.5.1 層次分析法確定權(quán)重系數(shù) 根據(jù)《中國藥典》2020 年版一部的規(guī)定，將總銀杏酸去除率、總黃酮轉(zhuǎn)移率、提取物收率作為響應(yīng)面法綜合考察指標(biāo)，分為3 個層次，優(yōu)先順序?yàn)榭傘y杏酸去除率＞總黃酮轉(zhuǎn)移率＞提取物收率，構(gòu)建指標(biāo)成對比較的優(yōu)先矩陣，見表2。對表2 中數(shù)據(jù)采用AHP 法進(jìn)行計算，結(jié)果總銀杏酸去除率、總黃酮轉(zhuǎn)移率、提取物收率的權(quán)重系數(shù)分別為0.56、0.33、0.11，一致性比例因子小于0.1，故指標(biāo)優(yōu)先比較判斷矩陣具有滿意的一致性，權(quán)重系數(shù)有效，將用于后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)中，并計算綜合評分。

表2 指標(biāo)成對比較的優(yōu)先矩陣Table 2 Priority matrix for paired comparison of indicator

R綜＝（R1×0.56＋R2×0.33＋R3×0.11）×100

R綜為綜合評分，R1為銀杏酸去除率，R2為總黃酮轉(zhuǎn)移率，R3為提取物收率

2.5.2 體積流量的考察 按照2.2 項(xiàng)下的工藝，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，洗脫液接收體積為3 BV，考察體積流量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 BV/h 對柱色譜脫酸綜合評分的影響，結(jié)果見表3。隨著體積流量增加，綜合評分先增加后降低，當(dāng)體積流量為1 BV/h，綜合評分最高。綜合考慮確定體積流量0.5～1.5 BV/h 進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化脫酸實(shí)驗(yàn)。

表3 體積流量對綜合評分的影響Table 3 Effect of flow rate on comprehensive score

2.5.3 洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的考察 按照2.2 項(xiàng)下的工藝，體積流量為1.0 BV/h，洗脫液接收體積為3 BV，考察洗脫劑乙醇不同體積分?jǐn)?shù)為60%、65%、70%、75%、80%對柱色譜脫酸綜合評分的影響，結(jié)果見表4。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，綜合評分增加后降低，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，綜合評分最高95.45。綜合實(shí)際考慮，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%～75%進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化脫酸實(shí)驗(yàn)。

表4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對綜合評分的影響Table 4 Effect of ethanol concentration on comprehensive score

2.5.4 洗脫液接收體積考察 按照2.2 項(xiàng)下的工藝，體積流量為1.0 BV/h，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，考察洗脫液接收不同體積1、2、3、4、5 BV對柱色譜脫酸綜合評分的影響，結(jié)果見表5。隨著洗脫液接收體積增加，綜合評分先增加后降低，當(dāng)接收體積為3 BV 時，綜合評分最高95.87。綜合實(shí)際考慮，確定接收體積2～4 BV 進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化脫酸實(shí)驗(yàn)。

表5 接收體積對綜合評分的影響Table 5 Effect of received volume on comprehensive score

2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.6.1 因素與水平 根據(jù)響應(yīng)面法的設(shè)計原理，以體積流量（A）、洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、洗脫液接收體積（C）為考察因素，總銀杏酸去除率、總黃酮轉(zhuǎn)移率、提取物收率的綜合評分為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，篩選各因素的最優(yōu)條件[13-15]。脫酸工藝因素水平見表6。

表6 因素水平Table 6 Factors and levels

2.6.2 設(shè)計方案和結(jié)果 利用響應(yīng)面優(yōu)化法設(shè)計柱色譜脫酸工藝實(shí)驗(yàn)方案，方案和結(jié)果見表7，模型方差分析結(jié)果見表8。

表7 設(shè)計方案和結(jié)果Table 7 Design plan and results

表8 回歸模型方差分析Table 8 Variance analysis of quadratic regression equation

利用Design-Expert v8.0.6 軟件對表7 數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸分析，建立響應(yīng)值與各因素的回歸擬合方程Y＝-1 139.72＋12.72XA＋33.79XB＋ 38.43XC＋0.38XAXB－1.39XAXC－0.23XBXC－13.75XA2－0.24XB2－3.40XC2，R2＝0.988 5。

由表8 方差分析結(jié)果可得模型F＝67.07，P＜0.000 1，說明脫酸工藝模型回歸極其顯著；失擬項(xiàng)P＝0.558 7＞0.05，說明失擬性結(jié)果不顯著，非實(shí)驗(yàn)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大。以上數(shù)據(jù)說明回歸模型擬合度高，模型成立，可用于對脫酸工藝綜合評分的預(yù)測和分析。因素A、B、A2、B2、C2的P＜0.01，因素C、交互項(xiàng)BC 的P＜0.05，說明其對脫酸工藝綜合評分影響具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.6.3 等高線圖及響應(yīng)面圖分析 利用Design-Expert v8.0.6 軟件對表7 數(shù)據(jù)處理，繪制得到體積流量、洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)、洗脫液接收體積交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖，見圖1。

圖1 各因素對綜合評分的影響Fig.1 Effect of factors on comprehensive score

可見當(dāng)洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時，綜合評分隨著體積流量的增大先逐漸升高，當(dāng)體積流量超過1.25 BV/h 時，綜合評分逐漸降低；當(dāng)體積流量一定時，綜合評分隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過69.14%時，綜合評分逐漸降低。當(dāng)洗脫液接收體積一定時，綜合評分隨著體積流量的增大先逐漸升高，當(dāng)體積流量超過1.25 BV/h，綜合評分逐漸降低；當(dāng)體積流量一定時，綜合評分隨著洗脫液接收體積的增大先逐漸升高，當(dāng)接收體積超過3.09 BV 時，綜合評分逐漸降低。當(dāng)接收體積一定時，綜合評分隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大先逐漸升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過69.14%時，綜合評分逐漸降低；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時，綜合評分隨著接收體積的增大先逐漸升高，當(dāng)接收體積超過3.09 BV 時，綜合評分逐漸降低。

由響應(yīng)面圖可見，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的曲面坡度較陡峭，對綜合評分影響顯著，其次是體積流量和洗脫液接收體積。且交互項(xiàng)乙醇體積分?jǐn)?shù)與洗脫液接收體積的交互作用較強(qiáng)，對綜合評分的影響顯著。

利用Design-Expert 8.0.6 軟件優(yōu)化得到銀杏葉提取物最佳柱色譜脫酸工藝，即體積流量為1.25 BV/h，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為69.14%，洗脫液接收體積為3.09 BV。

2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

結(jié)合成本、實(shí)際生產(chǎn)需要，將工藝調(diào)整為體積流量為1.2 BV/h，洗脫劑乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，洗脫液接收體積為3 BV。按照上述調(diào)整的優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表9?？梢娫摴に嚪€(wěn)定、可行、重復(fù)性好，可作為銀杏葉提取物樹脂柱色譜脫酸工藝。

表9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 9 Validation experiment

3 討論

為盡可能去除銀杏葉提取物及其制劑中的總銀杏酸，減小其不良反應(yīng)，本研究考察發(fā)現(xiàn)大孔樹脂LXD-200 對總銀杏酸具有較好的吸附效果，能很好地脫除銀杏葉提取物中的總銀杏酸。通過單因素和響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到大孔樹脂LXD-200 吸附脫除總銀杏酸的最佳工藝。在此最佳工藝條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的工藝穩(wěn)定、可行。因此本研究可為后續(xù)脫酸工藝放大生產(chǎn)提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突