李 強(qiáng) 黃文煒 彭蘇漢 周江偉 詹華偉 張鈺瑩 藍(lán)昭軍李文俊 桂 林*

（1廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006；2韶關(guān)市水產(chǎn)研究所，廣東韶關(guān) 512006）

光唇魚(yú)屬（Acrossocheilus）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae）鲃亞科（Barbinae）。光唇魚(yú)屬魚(yú)類廣泛分布于中國(guó)南部（包含臺(tái)灣和海南島）、越南和老撾[1]。對(duì)光唇魚(yú)屬各種或亞種的分類鑒定，傳統(tǒng)方法主要依據(jù)口唇結(jié)構(gòu)形態(tài)、體色和背鰭末根不分枝鰭條粗壯程度以及后緣有無(wú)鋸齒等差異進(jìn)行劃分。Kottelat[2]基于成體體色將光唇魚(yú)屬的種或亞種劃分為有垂直條紋類群（Barred group）和無(wú)垂直條紋類群（Nonbarred group）。然而，光唇魚(yú)屬的這些性狀除了種間差異顯著外，種內(nèi)差異可能同樣顯著。袁樂(lè)洋[1]通過(guò)分析窄條光唇魚(yú)（A. stenotaeniatus）和虹彩光唇魚(yú)（A. iridescens）的形態(tài)特征，認(rèn)為窄條光唇魚(yú)其實(shí)是虹彩光唇魚(yú)的幼體；《貴州魚(yú)類志》所記錄的厚唇光唇魚(yú)（A. labiatus）應(yīng)為吉首光唇魚(yú)（A. jishouensis）[3]。因此，在光唇魚(yú)屬魚(yú)類的系統(tǒng)分類上，單靠個(gè)體形態(tài)的差異判斷，部分物種難以準(zhǔn)確劃分。

DNA 條形碼通過(guò)利用有足夠變異的標(biāo)準(zhǔn)化短基因片段對(duì)物種進(jìn)行分子層面上的生物身份識(shí)別。越來(lái)越多的研究結(jié)果都表明DNA 條形碼技術(shù)能夠快速、簡(jiǎn)便、可信的對(duì)魚(yú)類物種進(jìn)行鑒定[4-7]。其中COI基因相較于其他基因片段，序列長(zhǎng)度比較適合，變異足夠多，相對(duì)保守，所以在物種鑒定上比較合適。本研究通過(guò)COI基因通用引物，對(duì)所采集的北江光唇魚(yú)（A. beijiangensis）、側(cè)條光唇魚(yú)（A. parallens）、帶半刺光唇魚(yú)（A. cinctus）、光唇魚(yú)（A. fasciatus）、虹彩光唇魚(yú)（A.iridescens）和吉首光唇魚(yú)（A. jishouensis）共26 尾個(gè)體進(jìn)行特異性PCR 擴(kuò)增，所得序列與Genbank 中已發(fā)表的光唇魚(yú)屬魚(yú)類COI基因進(jìn)行聯(lián)合分析，探討光唇魚(yú)屬魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，同時(shí)檢驗(yàn)COI基因序列對(duì)光唇魚(yú)屬魚(yú)類鑒別的有效性，以期為光唇魚(yú)屬魚(yú)類的系統(tǒng)發(fā)育及物種鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

本研究所使用的試驗(yàn)材料為光唇魚(yú)屬的6種魚(yú)類，共計(jì)26個(gè)個(gè)體，分別采自廣東省韶關(guān)市（北江光唇魚(yú)、側(cè)條光唇魚(yú)）、湖南省吉首市（吉首光唇魚(yú)）、浙江省寧波市（光唇魚(yú)）、廣西壯族自治區(qū)桂林市（帶半刺光唇魚(yú)）和廣西壯族自治區(qū)河池市（虹彩光唇魚(yú)）。DNA 提取采用上海生工生物公司的柱式試劑盒，提取方法參照試劑盒自帶方法進(jìn)行操作。

PCR引物為Ward等[8]設(shè)計(jì)的通用引物，具體序列如下：Fish1F（TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC）；Fish1R（TAGA 純CTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA）。引物由上海生工生物公司合成。PCR 反應(yīng)總體積25 μL，其中ddH2O 7.5 μL，2 X Tag PCR-Master Mix 12.5 μL，模板DNA 3 μL，上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件設(shè)置為94 ℃預(yù)變性3 min，進(jìn)入35 個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min）最后72 ℃延伸5 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)目標(biāo)條帶后送往上海生工生物公司完成測(cè)序工作。

1.2 序列處理及分析

測(cè)序結(jié)果首先在NCBI 在線數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)檢驗(yàn)，以初步確定試驗(yàn)所得序列是目標(biāo)片段。序列分析采用MEGA 6.0、DNAstar 5.0、BioEdit 7.2.5 等軟件進(jìn)行。用MEGA 6.0 軟件對(duì)所測(cè)序列和所下載序列進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算序列的堿基組成、各物種的種內(nèi)和種間遺傳距離；采用鄰接法（NJ），以雙參數(shù)法（Kimura 2-parameter）為替代模型，Bootstrap analysis 1 000次重復(fù)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

從Genbank 中下載其余已發(fā)表出來(lái)的光唇魚(yú)屬的COI基因序列，結(jié)合本研究所得的6 種光唇魚(yú)屬序列進(jìn)行比對(duì)分析。物種相關(guān)信息見(jiàn)表1。

表1 本研究所有13種光唇魚(yú)屬魚(yú)類的COI基因信息

2 結(jié)果與分析

2.1 光唇魚(yú)屬魚(yú)類COI基因堿基組成

本研究所用的引物位于COI基因的5'端，6 種光唇魚(yú)屬26 個(gè)個(gè)體均可以獲得線粒體COI基因部分序列，長(zhǎng)度約為650 bp。這表明所使用的通用引物適用于本研究的6 種光唇魚(yú)屬魚(yú)類，該引物在光唇魚(yú)屬中具有一定的通用性。

對(duì)26 尾個(gè)體的COI基因序列和10 條已發(fā)表的光唇魚(yú)屬魚(yú)類COI序列進(jìn)行比對(duì)分析，最終保留648 bp 的共有片段，共216 個(gè)密碼子，包括472 個(gè)保守位點(diǎn)、176 個(gè)變異位點(diǎn)、143 個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)和33 個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，不存在堿基插入和堿基缺失的情況。所有序列的平均堿基組成：28.1%（T）、28.2%（C）、25.7%（A）和18.1%（G）。

2.2 種間及種內(nèi)的遺傳距離

使用MAGE 6.0 軟件基于雙參數(shù)法模型，計(jì)算13種光唇屬魚(yú)類的種內(nèi)和種間遺傳距離（表2）。由表2可知，種內(nèi)遺傳距離都小于0.020 0，最大的為光唇魚(yú)。各物種種間平均遺傳距離，除了北江光唇魚(yú)與窄條光唇魚(yú)種間平均遺傳距離（0.015 7）外，其余都分布在0.030 2～0.177 4的范圍內(nèi)，其中半刺光唇魚(yú)與側(cè)條光唇魚(yú)種間遺傳距離最小，說(shuō)明它們是親緣關(guān)系很相近的2個(gè)物種，薄頜光唇魚(yú)與其他魚(yú)的種間遺傳距離都比較大，都超過(guò)0.130 0，最大為0.177 4，所以薄頜光唇魚(yú)與其他光唇魚(yú)屬的魚(yú)類親緣關(guān)系都較遠(yuǎn)。

表2 光唇魚(yú)屬魚(yú)類兩兩比對(duì)的種間平均遺傳距離

2.3 光唇魚(yú)屬魚(yú)類分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

采用NJ 法構(gòu)建13 種光唇魚(yú)屬魚(yú)類的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖1 所示。由圖1 可知，本研究光唇魚(yú)屬的每個(gè)物種不同個(gè)體都聚在同一分支上，所有6個(gè)物種的個(gè)體都可形成種的單系。側(cè)條光唇魚(yú)與半刺光唇魚(yú)形成一支，再與吉首光唇魚(yú)聚為姐妹分支，且節(jié)點(diǎn)支持率都比較高（高于94%）；北江光唇魚(yú)與窄條光唇魚(yú)結(jié)為一支，節(jié)點(diǎn)支持率達(dá)到100%，再與臺(tái)灣光唇魚(yú)結(jié)為一個(gè)分支；帶半刺光唇魚(yú)與溫州光唇魚(yú)連為一支，再與光唇魚(yú)聚為姐妹分支。虹彩光唇魚(yú)、薄頜光唇魚(yú)各自獨(dú)立形成一個(gè)分支；寬口光唇魚(yú)與云南光唇魚(yú)聚成2 個(gè)姐妹分支，再形成一個(gè)獨(dú)立分支。

圖1 NJ法構(gòu)建的光唇魚(yú)屬魚(yú)類分子系統(tǒng)樹(shù)

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)光唇魚(yú)屬魚(yú)類13 個(gè)物種的COI基因648 bp 共有片段進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同物種的COI基因序列之間具有顯著差異，即COI基因作為DNA條形碼序列具有一定物種代表性。

本研究中各物種種內(nèi)遺傳距離均小于0.020 0；而種間遺傳距離，除了北江光唇魚(yú)與窄條光唇魚(yú)種間平均遺傳距離為0.015 7 外，其余都大于0.020 0；種間遺傳距離平均值（0.090 1）是種內(nèi)遺傳距離平均值（0.004 9）的18 倍，這與Hebert 等[9]得到的種間與種內(nèi)遺傳距離的結(jié)論一致。

從分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上看，側(cè)條光唇魚(yú)、吉首光唇魚(yú)、北江光唇魚(yú)、光唇魚(yú)、帶半刺光唇魚(yú)、虹彩光唇魚(yú)各自的所有個(gè)體均形成單系。側(cè)條光唇魚(yú)與半刺光唇魚(yú)同在一個(gè)分支上，節(jié)點(diǎn)支持率也比較高，且兩者的種間遺傳距離也比較?。?.030 2），說(shuō)明這2 個(gè)物種互相的親緣關(guān)系與其他物種比更接近；兩者再與吉首光唇魚(yú)聚為一支，節(jié)點(diǎn)支持率也比較高。同樣，帶半刺光唇魚(yú)與溫州光唇魚(yú)聚為一支；北江光唇魚(yú)與窄條光唇魚(yú)在系統(tǒng)樹(shù)上也聚為一支，但兩者的種間遺傳距離只有0.015 7，因此這2 個(gè)物種是否劃分為2 個(gè)物種有待進(jìn)一步分析。薄頜光唇魚(yú)在系統(tǒng)樹(shù)的位置遠(yuǎn)離其他光唇魚(yú)屬物種獨(dú)立形成一個(gè)分支，與其他光唇魚(yú)屬魚(yú)類的種間遺傳距離都超過(guò)0.130 0，表明薄頜光唇魚(yú)與其他光唇魚(yú)屬的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

窄條光唇魚(yú)最開(kāi)始由褚新洛等[10]鑒定，并定義為光唇魚(yú)屬一個(gè)新物種，模式產(chǎn)地為云南剝隘。袁樂(lè)洋[1]通過(guò)形態(tài)學(xué)分析，認(rèn)為窄條光唇魚(yú)是虹彩光唇魚(yú)的幼體。本研究中，通過(guò)Genbank 中已發(fā)表窄條光唇魚(yú)的COI基因序列與其他光唇魚(yú)屬魚(yú)類的比較，結(jié)果表明窄條光唇魚(yú)與北江光唇魚(yú)結(jié)成一個(gè)分支，節(jié)點(diǎn)支持率為100%，且窄條光唇魚(yú)與北江光唇魚(yú)的種間遺傳距離（0.015 7）小于Hebert 等[9]得出的最小種間遺傳距離（0.020 0），窄條光唇魚(yú)可能與北江光唇魚(yú)是相同的物種。

吉首光唇魚(yú)是趙俊等[11]1997 年發(fā)表的一個(gè)新種，模式產(chǎn)地在湖南吉首，其主要分布于沅江上游及支流。本研究中，在分子系統(tǒng)樹(shù)上，吉首光唇魚(yú)和側(cè)條光唇魚(yú)與帶半刺光唇魚(yú)所結(jié)成的分支聚成姐妹分支，且吉首光唇魚(yú)與兩者的種間遺傳距離（0.050 9和0.052 6）都明顯大于0.020 0，表明吉首光唇魚(yú)應(yīng)為一個(gè)有效種。

伍獻(xiàn)文[12]根據(jù)福建和廣西標(biāo)本形態(tài)差異，將半刺光唇魚(yú)和帶半刺光唇魚(yú)定義為2 個(gè)亞種，即為A. hemispinus hemispinus和A. hemispinus cinctus。袁樂(lè)洋[1]通過(guò)比較兩者的形態(tài)特征，認(rèn)為應(yīng)將它們提升到種的水平，并將拉丁名分別改為A. hemispinus和A. cinctus。本研究的結(jié)果表明，半刺光唇魚(yú)與帶半刺光唇魚(yú)的種間遺傳距離（0.069 0）明顯大于0.020 0，在NJ 系統(tǒng)樹(shù)上，半刺光唇魚(yú)與側(cè)條光唇魚(yú)結(jié)成一個(gè)分支，與吉首光唇魚(yú)聚成姐妹群，而帶半刺光唇魚(yú)與溫州光唇魚(yú)結(jié)為一支，與光唇魚(yú)聚為姐妹分支，這與王莉等[13]得出的結(jié)論一致。因此，半刺光唇魚(yú)與帶半刺光唇魚(yú)應(yīng)為2個(gè)獨(dú)立的物種。

綜上所述，線粒體COI基因適合于光唇魚(yú)屬魚(yú)類系統(tǒng)發(fā)育分析，且可以作為DNA條形碼對(duì)該屬魚(yú)類進(jìn)行有效的分子鑒定。