張自強(qiáng),謝 輝,張倩文,孫瑩瑩,李夢云,劉玉梅

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,河南 洛陽 471000)

家兔腹瀉是兔業(yè)養(yǎng)殖中常見的疾病之一,臨床上主要由病毒、細(xì)菌和寄生蟲引起,當(dāng)兔舍環(huán)境衛(wèi)生不達(dá)標(biāo),飼養(yǎng)管理不當(dāng)時(shí),也會引起本病的發(fā)生[1]。在家兔日常生產(chǎn)中,能引起家兔腹瀉的的疾病有許多,臨床上主要有兔大腸桿菌病、兔球蟲病、兔魏氏梭菌病、兔沙門氏菌病和兔綠膿假單胞菌病等。不同日齡的家兔均可發(fā)生腹瀉,但其中對斷奶前后的幼仔兔危害最為嚴(yán)重。有研究表明,腹瀉造成的幼兔死亡可達(dá)幼兔死亡率的70%以上,往往給養(yǎng)殖戶帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

兔大腸桿菌病又稱黏液性腸炎,是由致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)和其毒素引起的一種以腹瀉為主要臨床特征的急性、爆發(fā)性和高死亡率的幼兔腸道傳染病[3]。不同年齡段的家兔對大腸桿菌均易感,其中1～4月齡的幼仔兔易感性最強(qiáng),并且伴有較高的死亡率,同時(shí)也是造成幼兔腹瀉最普遍的病因之一[4]。兔大腸桿菌病沒有明顯的季節(jié)性,一年四季均可發(fā)生。飼養(yǎng)管理不達(dá)標(biāo),衛(wèi)生條件差,氣候突變等均是本病的誘發(fā)因素[5]。目前,臨床上用來治療家兔大腸桿菌感染的措施主要依賴于抗生素,但養(yǎng)殖戶頻繁和不規(guī)范的大量使用抗生素往往會導(dǎo)致菌株多重耐藥性的出現(xiàn),到最后甚至?xí)霈F(xiàn)無藥可用的困境[6-7]。大腸桿菌之間通過菌毛傳遞耐藥質(zhì)粒的特性[8],更是給家兔大腸桿菌病的防治帶來極大的挑戰(zhàn)。本研究從河南地區(qū)不同規(guī)?；脠霾杉?04份腹瀉病料,并對致病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。通過菌落形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)、PCR鑒定來確定致病菌的種類,通過小鼠試驗(yàn)來確定大腸桿菌分離株的致病性。同時(shí)對分離出的72株大腸桿菌采用K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn),以確定不同兔場大腸桿菌分離株的藥物敏感性,以期為河南地區(qū)腹瀉家兔大腸桿菌的感染情況和用藥風(fēng)險(xiǎn)評估提供科學(xué)參考。

1 材料方法

1.1 病料來源

選取來自河南嵩縣、濟(jì)源、新鄉(xiāng)、南陽、登封等地區(qū)的26家規(guī)?；脠龅?04例家兔腹瀉病例,使用接菌環(huán)無菌采取病兔的腸系膜、肝臟、脾臟等組織進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

藥敏紙片、普通瓊脂培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯購自北京索萊寶科技有限公司,麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂購自海博生物技術(shù)有限公司。Proteinase K、細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒、DL2000 DNA Maker購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司,Premix TaqTM(E×TaqTM Version 2.0 plus dye)購自大連TaKaRa公司,溴化乙錠溶液購自蘇州天可貿(mào)易有限公司。

1.3 試驗(yàn)器材

電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈無菌工作臺、氣浴恒溫振蕩器、高壓蒸汽滅菌鍋、臺式冷凍高速離心機(jī)、普通PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀。

1.4 致病菌的分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察

無菌采取腹瀉病料的腸系膜、肝臟、脾臟等組織劃線接種于普通瓊脂培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落的生長狀況。挑取疑似大腸桿菌的優(yōu)勢菌落置于營養(yǎng)肉湯中37 ℃培養(yǎng)24 h,將純化后的菌液分別劃線接種于麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美藍(lán)瓊脂中培養(yǎng),觀察菌落的形態(tài),并進(jìn)行革蘭染色、鏡檢。將純化培養(yǎng)的細(xì)菌分別接入微量生化管中,37 ℃培養(yǎng)24～72 h,觀察記錄結(jié)果。

1.5 PCR鑒定和序列比對分析

根據(jù)GenBank大腸桿菌eae基因序列,經(jīng)DNAStar軟件對比分析后,利用 Primier 5.0 軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的大腸桿菌引物,實(shí)驗(yàn)引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。預(yù)擴(kuò)增目的片段大小可見表1,長度為833 bp。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物送至通用生物(安徽)股份有限公司進(jìn)行測序,測序結(jié)果與GenBank中登錄的菌株進(jìn)行同源性比對,并使用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

挑取分離的大腸桿菌純培養(yǎng)物,接種于營養(yǎng)肉湯中37 ℃搖菌培養(yǎng)16～24 h,用生理鹽水將菌液濃度稀釋至1×108cfu/mL。將菌液分別接種于12只質(zhì)量約在 20 g的健康小鼠,隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)組,試驗(yàn)組小鼠腹腔注射劑量為0.2 mL/只的菌液,對照組注射相同劑量滅菌PBS。觀察小鼠的致病情況,并采集病料進(jìn)行致病菌的分離鑒定。

1.7 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片法對紅霉素、慶大霉素、新霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、多粘菌素B、復(fù)方新諾明、卡那霉素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星、氨芐西林、頭孢哌酮、諾氟沙星、痢特靈、氟苯尼考、恩諾沙星16種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果依據(jù)美國臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)制定的標(biāo)準(zhǔn)判斷(2016年版)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌形態(tài)觀察和生化鑒定結(jié)果

分離菌株經(jīng)37 ℃恒溫培養(yǎng)后在普通瓊脂培養(yǎng)基上形成光滑、濕潤、隆起且邊緣整齊的中等大菌落(圖1A);在麥康凱培養(yǎng)基上形成粉紅色、不透明濕潤且邊緣整齊的菌落(圖1B);在伊紅美藍(lán)瓊脂中長出紫黑色,帶金屬光澤的菌落(圖1C)。革蘭染色后可在光鏡下觀察到兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌(圖1D)。分離菌的生化鑒定結(jié)果如表2所示,根據(jù)分離菌株的形態(tài)觀察和理化特性,可以初步判斷分離菌株為大腸桿菌。

圖1 分離菌形態(tài)學(xué)觀察A. 分離菌在普通瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài); B.分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上的菌落形態(tài) C. 分離菌在伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基上的菌落形態(tài);D. 分離菌在光鏡下的形態(tài)觀察Fig.1 Morphological observation of isolated bacteriaA. Colony morphology of isolated bacteria on ordinary agar medium;B. Colony morphology of isolated bacteria on McConkey medium;C. The colony morphology of the isolated bacteria on eosin methylene blue medium;D. Morphological observation of isolated bacteria under light microscope

表2 分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Biochemical test results of isolated strains

2.2 PCR鑒定結(jié)果和基因序列分析

采用eae引物對從分離后菌株中提取到的細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。使用濃度為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后,獲得833 bp基因片段,與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。擴(kuò)增產(chǎn)物測序后經(jīng)BLAST進(jìn)行對比分析,結(jié)果顯示分離菌和大腸桿菌的同源性最高,采用MEGA 7．0軟件構(gòu)建其遺傳進(jìn)化樹,分離菌與大腸桿菌登錄號為MH111534.1,同源性為98.81%(圖3)。

圖2 分離菌PCR鑒定結(jié)果M.DL2000 Marker 1.分離菌株Fig. 2 PCR identification of isolated bacteriaM. DL2000 marker 1. isolated bacteria

圖3 分離菌基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of isolation bacteria

2.3 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

動(dòng)物致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示,對照組小鼠沒有發(fā)生腹瀉和死亡,試驗(yàn)組小鼠在48 h內(nèi)死亡率達(dá)到80%以上。采集死亡小鼠的肝臟、脾臟等組織病料進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng),經(jīng)革蘭染色鏡檢和分子生物學(xué)鑒定后發(fā)現(xiàn)能夠得到與分離菌株一樣的致病菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

利用16種抗生素對分離的72株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知,分離菌株對16種藥物均具有不同程度的耐藥性,其中分離菌株對多粘菌素B最為敏感,耐藥率僅為2.8%;對復(fù)方新諾明耐藥性最強(qiáng),耐藥率為100%;分離菌株對其他14種抗生素耐藥性為22.2%～94.4%,其中對丁胺卡那、頭孢哌酮較為敏感,對紅霉素、新霉素等耐藥性較強(qiáng)。

表3 72株兔腹瀉源性大腸桿菌對16種抗生素的耐藥性Table 3 Drug resistance of 72 strains of Escherichia coli from rabbit diarrhea to 16 antibiotics

3 討 論

兔大腸桿菌病作為家兔養(yǎng)殖業(yè)中最常見的消化系統(tǒng)疾病,感染后不僅使幼仔兔有極高的死亡率,同時(shí)也對幼兔康復(fù)后的生長帶來了極大的影響,嚴(yán)重威脅著家兔健康和家兔養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展[10]。為了探究河南地區(qū)腹瀉家兔大腸桿菌的感染情況,本試驗(yàn)通過細(xì)菌的分離培養(yǎng)、染色鏡檢和PCR鑒定等方式對從河南不同規(guī)模化兔場的104個(gè)腹瀉病料進(jìn)行致病菌的分離鑒定,共分離出了72株大腸桿菌。結(jié)果與王國艷等[11]的研究相似,分離出的大腸桿菌是造成所調(diào)查兔場家兔腹瀉的優(yōu)勢菌株。

長期以來,抗菌藥物的使用一直是畜牧生產(chǎn)中對大腸桿菌病的主要防治措施。有研究顯示,獸用抗菌藥物的70%都被添加到飼料中用作飼料添加劑[12],抗菌藥物的大量使用導(dǎo)致了耐藥菌株的不斷出現(xiàn),耐藥性越來越強(qiáng),給大腸桿菌病的防治帶來了極大的困難。在本試驗(yàn)中,通過對從河南地區(qū)不同規(guī)?；脠鲋蟹蛛x的大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)分離株對測試的藥敏片均有不同程度的耐藥性。其中分離的大腸桿菌對多粘菌素B最為敏感,耐藥率僅為2.8%,而對復(fù)方新諾明、紅霉素、新霉素、四環(huán)素、痢特靈、恩諾沙星等藥物具有較強(qiáng)的耐藥性。根據(jù)李雙雙等[13]的報(bào)道,從河南4個(gè)地區(qū)的兔場分離出的大腸桿菌對多粘菌素最為敏感,敏感率達(dá)到96.3%,而對其他獸用常見抗生素如氟苯尼考、阿米卡星等均具有不同程度的耐藥性,其結(jié)果與本試驗(yàn)研究結(jié)果相似。同一地區(qū)相同源性的大腸桿菌耐藥性也可能存在差異。王佳佳等[14]通過對從河南某兔場中分離的大腸桿菌進(jìn)行藥物敏感性測試,發(fā)現(xiàn)對慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮、氨芐西林等藥物敏感,對紅霉素、卡那霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、丁胺卡那有較強(qiáng)抗性。在本試驗(yàn)中,通過耐藥性測試發(fā)現(xiàn)大腸桿菌對丁胺卡那、頭孢哌酮耐藥率相對較低,對慶大霉素、環(huán)丙沙星和氨芐西林耐藥性較高,其結(jié)論與王佳佳等的研究有所差異,原因可能和用藥情況等因素的不同有關(guān)。大腸桿菌可因地區(qū)的不同而呈現(xiàn)出耐藥性的差異,王國艷等[11]從山西地區(qū)分離的兔腹瀉源性大腸桿菌對阿米卡星不耐藥,對多粘菌素B、頭孢哌酮、痢特靈等藥物耐藥性達(dá)到了80%以上。李科等[15]報(bào)道的大腸桿菌分離株對復(fù)方新諾明、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等藥物高度敏感。其耐藥性結(jié)果均和本試驗(yàn)的研究結(jié)果存在較大差異。而坤清芳等[16]對從四川地區(qū)家兔養(yǎng)殖場中分離到的97株大腸桿菌進(jìn)行了喹諾酮類藥物的藥敏試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)分離的大腸桿菌對左氧氟沙星、依諾沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星和諾氟沙星具有多重耐藥性,而在本試驗(yàn)中,同樣發(fā)現(xiàn)分離的大腸桿菌對3種喹諾酮類藥物諾氟沙星、恩諾沙星和環(huán)丙沙星具有較強(qiáng)的耐藥性。喹諾酮類藥物是治療大腸桿菌感染的主要抗菌藥物之一[17],在畜牧生產(chǎn)中被大量使用,不同地區(qū)大腸桿菌對喹諾酮藥物耐藥性的增強(qiáng)可能和喹諾酮類藥物的過量和長期使用有關(guān)[18]。這也說明了對一種藥物的大量使用會同時(shí)導(dǎo)致不同地區(qū)菌株的耐藥性增強(qiáng)。

大腸桿菌廣泛存在于自然界中,同時(shí)也是動(dòng)物腸道內(nèi)正常存在的寄生菌,一旦家兔的飼養(yǎng)環(huán)境改變導(dǎo)致家兔發(fā)生應(yīng)激時(shí),往往導(dǎo)致家兔大腸桿菌病的發(fā)生。從以上結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的耐藥性已較為嚴(yán)重,從多個(gè)地方分離的菌株都具有不同程度的多重耐藥性。同時(shí),從不同地域、不同源性身上分離的大腸桿菌耐藥性的不同[19-22],更是給本病的防治增加了難度。細(xì)菌的耐藥現(xiàn)象可通過質(zhì)粒結(jié)合等方式在菌群中水平傳播[23-25],因此應(yīng)該避免盲目用藥,而應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果采用聯(lián)合用藥和輪換用藥相結(jié)合的方式,盡量減少耐藥菌株的產(chǎn)生。本次研究通過對河南地區(qū)腹瀉家兔大腸桿菌的分離培養(yǎng)、鑒定和耐藥分析,為河南地區(qū)兔大腸桿菌的感染狀況和臨床用藥提供科學(xué)參考,同時(shí)也為不同地區(qū)大腸桿菌的耐藥情況分布提供了理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

所調(diào)查兔場中,發(fā)生腹瀉病的家兔具有較高的大腸桿菌感染率,且菌株具有普遍的耐藥性,但對多粘菌素B、復(fù)方新諾明等藥物最為敏感,該研究結(jié)果為河南地區(qū)家兔大腸桿菌病的耐藥情況、防治和臨床用藥提供了理論參考。