王成章, 顏洋洋, 劉丹陽, 周 昊, 商士斌, 張華興

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所;江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;國家林業(yè)和草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;林木生物質(zhì)低碳高效利用國家工程研究中心;江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210042; 2.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037; 3.凱里小生物科技有限公司,貴州 凱里 556000)

天然靛藍(lán)源于馬藍(lán)、木藍(lán)、蓼藍(lán)或菘藍(lán)等含靛植物[1-3],傳統(tǒng)的靛膏是含靛植物莖葉經(jīng)自然浸泡、過濾、加入石灰、攪拌、過濾(棄去濾液)得到靛膏,再經(jīng)曬干和粉碎得到靛藍(lán)粗提取物[4-9]。天然靛藍(lán)具有綠色安全、環(huán)境相容性好等優(yōu)點(diǎn),在紡織品上染、建筑用涂料、繪畫用顏料、化妝品和藥品等領(lǐng)域廣泛使用[10-12]。石巖等[13]通過藥典標(biāo)準(zhǔn)檢測方法分析了青黛無機(jī)物組成中總灰分為65%～85%、酸不溶性灰分為5%～29%。李永生等[14]采用反向高效液相色譜法同時(shí)測定青黛中5種核苷類成分。吳青青等[15]采用高效液相色譜法同時(shí)測定青黛中色胺酮、靛藍(lán)及靛玉紅的含量。傳統(tǒng)青黛炮制僅采用簡單攪拌收集浮沫得到靛花來制備較高靛藍(lán)(>8%)或有機(jī)物含量的青黛[16],但產(chǎn)量很低難以滿足臨床用藥需求,且不能滿足靛藍(lán)純度高或灰分含量低的要求,以及對不同新工藝得到的青黛的深入研究鮮有報(bào)道,青黛和靛藍(lán)提取物藥理活性與作用機(jī)制尚不清晰。因此,本研究以馬藍(lán)鮮葉自然發(fā)酵和生石灰打靛產(chǎn)生的靛膏為原料,分別通過預(yù)處理去雜、酸化、還原和溶劑萃取等工藝,制備靛藍(lán)粗提物、酸化-靛藍(lán)提取物、葡萄糖還原-靛藍(lán)提取物及乙酸乙酯萃取-靛藍(lán)提取物。采用熱裂解-氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用(Py-GC-MS)和超高效液相色譜-四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(UHPLC-TOF-MS)技術(shù)對不同提取工藝的靛藍(lán)提取物中化學(xué)成分進(jìn)行整體輪廓分析,并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),快速分析并鑒定其化學(xué)成分,以期為靛藍(lán)提取物中藥效物質(zhì)分析及利用提供基礎(chǔ),并為高品質(zhì)靛藍(lán)提取物中生物堿、酸類、多酚類、黃酮類等活性物質(zhì)有效富集提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

馬藍(lán)鮮葉發(fā)酵制備的靛藍(lán)膏(靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.09%,含水量50%～60%,灰分65.23%),由貴州小生源有限公司提供;靛藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥97%)、甲醇(色譜純),購于阿拉丁生化試劑有限公司;乙酸乙酯、氫氧化鈉、葡萄糖、N,N-二甲基甲酰胺,均為市售分析純;鹽酸,市售化學(xué)純。

CBM-10A VP Plus型高效液相色譜儀,日本島津公司;KF1100型箱式爐,南京博蘊(yùn)通儀器科技有限公司;QUINTIX35-1CN PC型電子天平,德國賽多利斯公司;LXJ-IIB型低速離心機(jī),海安亭科學(xué)儀器廠;KH5200E型超聲波清洗器,昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;RE-5LC型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀和DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器,河南省予華儀器有限公司;209 F1 Libra型熱重分析儀,德國耐馳儀器制造有限公司;ICAP 7400型雙通道電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀,UltiMate 3000型超高壓液相色譜(UHPLC)儀,美國賽默飛世爾科技公司;5600 QTOF型高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀,美國AB SCIEX公司;PY-3030D/7890B-5977A型熱裂解色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國安捷倫科技有限公司。

1.2 靛藍(lán)提取物的制備

1.2.1靛藍(lán)粗提物 將靛藍(lán)膏按質(zhì)量比1∶3加水?dāng)嚢?0 min,用粒徑0.18 mm濾布擠壓過濾,離心,濾渣經(jīng)80 ℃烘干,研磨成粉,過0.18 mm篩,得到靛藍(lán)粗提物(ICE)。

1.2.2酸化-靛藍(lán)提取物 取30 g ICE置于250 mL錐形瓶內(nèi),加入150 mL水,置于80 ℃ 的恒溫水浴鍋中攪拌10 min。然后緩慢滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%鹽酸水溶液直到反應(yīng)液pH值為2～3,攪拌反應(yīng)40 min。離心得沉淀,用100 ℃水洗滌沉淀至中性,離心,濾渣經(jīng)80 ℃烘干,制得酸化-靛藍(lán)提取物(AIE)。

1.2.3葡萄糖還原-靛藍(lán)提取物 取2 g AIE置于250 mL錐形瓶中,加入100 mL水和3 g氫氧化鈉,置于80 ℃恒溫水浴鍋中攪拌30 min。離心后將下層濾渣轉(zhuǎn)入錐形瓶中,再加入100 mL水、 3 g氫氧化鈉和2.5 g葡萄糖,瓶口用封口膜密封后在60 ℃恒溫水浴下攪拌反應(yīng)50 min。反應(yīng)后離心得上層液體,用氣泵通入空氣2 min,再滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%鹽酸調(diào)pH值為3～4,再次離心分離,下層沉淀用超純水洗滌至中性,沉淀烘干,制得葡萄糖還原-靛藍(lán)提取物(GRIE)。

1.2.4乙酸乙酯萃取-靛藍(lán)提取物 取20 g AIE置于500 mL燒杯中,加入200 mL乙酸乙酯后超聲波振蕩30 min。過濾,濾渣重復(fù)萃取2次,合并萃取液,蒸發(fā)乙酸乙酯溶劑后,烘干制得乙酸乙酯萃取-靛藍(lán)提取物(EAEI)。

1.3 分析方法

1.3.1HPLC分析 采用HPLC分析檢測不同提取工藝下的靛藍(lán)提取物的靛藍(lán)含量。HPLC條件:PRAZIS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇/水(體積比70∶30);流速1.0 mL/min;檢測波長289 nm。

1.3.2灰分和酸不溶灰分的測定 靛藍(lán)提取物中總灰分和酸不溶性灰分[17]參照2020年版《中華人民共和國藥典》中灰分測定法測定。

1.3.3Py-GC-MS分析 ICE、AIE、GRIE和EAEI 4種靛藍(lán)提取物的化學(xué)組成通過Py-GC-MS分析。分析條件:進(jìn)樣量3 mg,在氦氣氣氛下,以20 ℃/min的升溫速率從室溫升至600 ℃,保持20 s以確保待測樣品裂解完全,進(jìn)行GC-MS在線分析。色譜柱為HP-5MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);柱溫250 ℃,程序升溫:初始溫度55 ℃ 保持1 min,然后以15 ℃/min升至250 ℃ 并保持3 min;分流比為 50∶1;流速1 mL/min;載氣為氦氣;進(jìn)樣口溫度為300 ℃;傳輸線溫度為280 ℃。質(zhì)譜采用EI離子源,離子源溫度250 ℃,掃描范圍25～400 u[18-19]。

1.3.4UHPLC-TOF-MS分析 通過UHPLC-TOF-MS分析AIE和EAEI的化學(xué)組成。色譜條件:色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm);柱溫40 ℃,進(jìn)樣量3 μL;正離子模式流動相,A為0.1%甲酸水,B為0.1%甲酸乙腈;負(fù)離子模式流動相,A為2 mmol/L乙酸銨水溶液,B為乙腈。梯度洗脫:0～2 min,95% A;>2～30 min,95%～7% A;>30～47 min,7% A;>47～53 min,7%～0% A;>53～54 min,0%～95% A;>54～58 min,95% A。質(zhì)譜條件:AB 5600 Triple TOF質(zhì)譜儀為電噴霧離子源:正負(fù)離子檢測模式;一級采集范圍(m/z)為50～1 200;轟擊能量30 eV,每50 ms 10張二級譜圖。ESI離子源參數(shù)設(shè)置如下:霧化氣壓(GS1)414 kPa;輔助氣壓414 kPa;氣簾氣壓241 kPa;溫度650 ℃;噴霧電壓5 000 V(正離子模式)或-4 000 V(負(fù)離子模式)[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝對靛藍(lán)提取物主要成分的影響

不同提取工藝處理后的靛藍(lán)提取物的主要成分分布見表1。由表可知,市售靛藍(lán)膏中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.09%,剛達(dá)到2020年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn),并且其灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達(dá)65.23%。經(jīng)簡單地預(yù)處理去雜得到的靛藍(lán)粗提物中靛藍(lán)含量提高至未處理時(shí)的3倍,灰分也明顯減少,但仍有較多的SiO2類非石灰類雜質(zhì);以靛藍(lán)粗提物為原料,經(jīng)過酸化、還原和溶劑萃取等工藝得到的AIE、GRIE和EAEI中的靛藍(lán)含量均得到大幅提升,灰分含量也大幅減少。其中酸化處理步驟可以除去靛藍(lán)粗提物中絕大多數(shù)碳酸鈣、氫氧化鈣等,所以灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)由接近50%變?yōu)?5%以下;而在酸化基礎(chǔ)上繼續(xù)采用葡萄糖還原工藝能除去大量的多糖、膠質(zhì)體、植物纖維、葉綠素等有機(jī)物和石灰類等無機(jī)物,以及少量酸不溶灰分雜質(zhì),得到高純度靛藍(lán),但在酸化基礎(chǔ)上繼續(xù)采用乙酸乙酯萃取工藝,其提純效果不佳。由此可見,葡萄糖還原工藝是一種綠色、高效、簡便的高純度靛藍(lán)分離純化新工藝,可解決靛藍(lán)純化效率低和易造成環(huán)境污染等現(xiàn)實(shí)問題。

表1 不同提取工藝處理后的靛藍(lán)提取物的成分分布

靛藍(lán)一直以來被認(rèn)為是青黛的主要活性物質(zhì),由不同工藝制備得到靛藍(lán)提取物樣品中的靛藍(lán)含量顯著高于原料中靛藍(lán)的含量,由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,可以根據(jù)不同青黛靛藍(lán)含量需要選擇不同工藝。

2.2 Py-GC-MS法分析靛藍(lán)提取物揮發(fā)性成分

對4種靛藍(lán)提取物進(jìn)行Py-GC-MS裂解氣質(zhì)(室溫～600 ℃)成分分析。4個(gè)樣品的裂解氣質(zhì)圖及其化學(xué)組成分別見圖1和表2。

a.ICE; b.AIE; c.GRIE; d.EAEI

表2 不同靛藍(lán)提取物裂解組分的Py-GC-MS分析結(jié)果

由表2可知,靛藍(lán)提取物裂解后化合物組成復(fù)雜,12個(gè)碳以下的小分子種類較少,12碳及以上種類多且GC含量較高,因此,以 12個(gè)碳為分界點(diǎn)來對裂解產(chǎn)物的組分進(jìn)行分類。由表可知,ICE、AIE、GRIE和EAEI 4個(gè)樣品的裂解產(chǎn)物中12個(gè)碳以下的小分子組分較少,分別為1.76%、 9.73%、 13.04%和4.25%;而12～20個(gè)碳的組分較多,分別為7.91%、 57.09%、 54.4%和62.7%。

此外,從表2中還可以看出,僅在ICE與EAEI中檢測到靛藍(lán),說明AIE和GRIE中的靛藍(lán)已完全裂解。ICE中僅檢測到2種裂解產(chǎn)物,且GC含量之和小于10%,說明ICE中有機(jī)物成分很少。AIE中檢測到23種裂解產(chǎn)物,說明酸化工藝可以提高產(chǎn)品中有機(jī)物含量,且檢測到較多酸類物質(zhì)。GRIE中檢測到9種裂解產(chǎn)物,主要是吲哚類與酸類,應(yīng)是由靛藍(lán)裂解生成。EAEI共檢測到19種裂解產(chǎn)物,且分類較多,中等極性產(chǎn)物含量也較高,說明乙酸乙酯萃取工藝可得到較多的有機(jī)物,導(dǎo)致裂解產(chǎn)物組成較為復(fù)雜。

2.3 UHPLC-TOF-MS法分析靛藍(lán)提取物化學(xué)組成

利用UHPLC-TOF-MS對AIE和EAEI中化學(xué)成分進(jìn)行檢測分析,通過與NIST 08質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫比對,并利用面積歸一法得到各成分的相對峰面積,其UHPLC-TOF-MS圖譜及化學(xué)組分分類分別見圖2和表3。

圖2 2種靛藍(lán)提取物AIE(a)、EAEI(b)的UHPLC-TOF-MS分析

表3 不同靛藍(lán)提取物組分的UHPLC-TOF-MS分析結(jié)果

由表3可知,AIE中共鑒定出61種化合物,相對峰面積為15.28%;EAEI中鑒定出184種化合物,主要包括酸類、多糖類、黃酮類、生物堿類、苷類、多酚類、醛類、蛋白類、酯類9類物質(zhì),相對峰面積為56.04%。酸化-靛藍(lán)提取物通過乙酸乙酯萃取工藝處理后,酸類物質(zhì)由7.83%增加到48.72%;多酚類物質(zhì)由0.43%增加到4.56%;黃酮類物質(zhì)由0.33%增加到1.71%?？梢?乙酸乙酯萃取工藝對靛藍(lán)提取物中酸類、多酚類、黃酮類等實(shí)現(xiàn)了有效富集。

在相同分析條件下,EAEI中檢測到的有機(jī)化合物種類遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于AIE中的,可能是因?yàn)锳IE中部分有機(jī)化合物含量太低,未達(dá)到檢測限,所以未被檢測出;而乙酸乙酯萃取過程對這些有機(jī)物實(shí)現(xiàn)了有效富集,使得EAEI中檢測到的化合物增多。兩種樣品中共檢測到16種相同化合物,其中酸類化合物9種,分別為12-羥基十二烷酸、蓖麻油酸、肉豆蔻烯酸、 5-氨基-2-對甲苯基苯磺酸、 8-(4-磺基苯基)辛酸、肉豆蔻酸、油酸、棕櫚酸和硬脂酸;黃酮類化合物1種,為小豆蔻素;生物堿類化合物3種,分別為吲哚阿霉素、 2-(3-吡啶基)-苯并咪唑和4-羥基喹啉;酯類化合物1種,為雷公藤內(nèi)酯醇;多糖類化合物2種,分別為蔗糖和α-環(huán)糊精。基于UHPLC-TOF-MS全面分析靛藍(lán)提取物樣品中的化學(xué)成分,結(jié)果顯示EAEI中的有機(jī)化合物明顯多于AIE,說明乙酸乙酯萃取工藝可對靛藍(lán)酸化物中多種有機(jī)化合物實(shí)現(xiàn)有效富集。

3 結(jié) 論

3.1以靛藍(lán)膏為原料,利用不同工藝處理制備得到靛藍(lán)粗提物(ICE)、酸化-靛藍(lán)提取物(AIE)、葡萄糖還原-靛藍(lán)提取物(GRIE)和乙酸乙酯萃取-靛藍(lán)提取物(EAEI)。對4種靛藍(lán)提取物中靛藍(lán)成分測定結(jié)果表明:相比于靛藍(lán)膏,4種提取工藝制備的靛藍(lán)提取物中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均得到顯著提高,其中,GRIE中靛藍(lán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到85%。

3.2采用Py-GC-MS技術(shù)對靛藍(lán)提取物中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,結(jié)果表明:ICE、AIE、GRIE和EAEI的裂解產(chǎn)物中含有12～20個(gè)碳的組分較多,相應(yīng)的GC含量分別為7.91%、 57.09%、 54.4%和62.7%。其中,EAEI的裂解產(chǎn)物中中等極性產(chǎn)物含量較高,說明乙酸乙酯萃取工藝可得到較多的有機(jī)物。

3.3采用UHPLC-TOF-MS技術(shù)對AIE和EAEI中的化學(xué)成分進(jìn)行分析,結(jié)果表明:AIE和EAEI分別鑒定出61和184種化合物,主要包括酸類、多糖類、黃酮類、生物堿類、苷類、多酚類、醛類、蛋白類、酯類9類物質(zhì),其中,乙酸乙酯萃取工藝對靛藍(lán)提取物中酸類、多酚類、黃酮類等實(shí)現(xiàn)了有效富集。