張慶昕， 張玉霞*， 孫明雪， 夏全超， 王顯國(guó)， 劉庭玉， 杜曉艷

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古自治區(qū)飼用作物工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028041；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

苜蓿(Medicago sativa)作為多年生豆科草本植物[1]，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2]。雖然苜蓿的抗逆性較強(qiáng)，但是我國(guó)北部高寒地區(qū)冬季寒冷少雪，冬春兩季常會(huì)因寒流侵襲發(fā)生倒春寒、極端低溫等現(xiàn)象，這已經(jīng)成為限制苜?？沙掷m(xù)生產(chǎn)的重要因素[3]。

低溫脅迫下，植物細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程加劇，膜系統(tǒng)的氧化性損傷嚴(yán)重，會(huì)生成氧化分解產(chǎn)物丙二醛（malondialdehyde，MDA）[4]，對(duì)生物膜造成傷害，此時(shí)植物會(huì)通過(guò)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）等抗氧化酶清除一定范圍內(nèi)在低溫脅迫刺激下植物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧[5]，維持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此低溫脅迫下的MDA 含量可以衡量苜蓿的抗寒性[6]，抗氧化酶活性強(qiáng)弱是評(píng)價(jià)苜蓿抗氧化能力的生理指標(biāo)[7-8]。

鉀是植物生長(zhǎng)必需的三大元素之一，素有“抗逆元素”之稱(chēng)，是植物細(xì)胞內(nèi)含量最高的陽(yáng)離子，能高速通過(guò)生物膜[9-11]；鉀元素還是大多數(shù)酶的關(guān)鍵輔助因子，其中抗氧化酶系統(tǒng)中酶活性的啟動(dòng)就需要鉀元素的參與[12-14]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的鉀肥種類(lèi)有KCl、K2SO4和KH2PO4等[15-16]，已有的研究主要是圍繞苜蓿對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)及單一種類(lèi)鉀肥對(duì)其他作物的影響[17-20]，關(guān)于鉀肥種類(lèi)和用量對(duì)苜蓿抗氧化生理特性的影響是否存在差異的研究較少。因此，本研究對(duì)不同鉀肥種類(lèi)和用量對(duì)苜蓿根頸在低溫脅迫下生理響應(yīng)進(jìn)行了系統(tǒng)的分析，闡釋不同鉀肥處理的苜蓿根頸在低溫脅迫下膜質(zhì)氧化程度和抗氧化特性，提出種植苜蓿最適宜施用的鉀肥種類(lèi)及用量，旨在為科爾沁沙地苜?？购弋a(chǎn)栽培中鉀肥的高效管理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古通遼市開(kāi)魯縣東風(fēng)鎮(zhèn)林輝草業(yè)公司基地（43°61′N(xiāo)，121°30′E），該地區(qū)屬于溫帶大陸性半干旱氣候，四季分明，降水主要集中在夏季，冬季干旱少雪，≥10 ℃年積溫為3 000～3 200 ℃，年平均氣溫5.6 ℃，無(wú)霜期138～153 d，年平均降水量375 mm，年平均風(fēng)速3.0～4.4 m·s-1，土壤有機(jī)質(zhì)含量6.41 g·kg-1，速效磷含量3.62 mg·kg-1，速效鉀含量77.85 mg·kg-1，堿解氮含量35.84 mg·kg-1，全氮含量44.03 g·kg-1。

1.2 試驗(yàn)材料

供試紫花苜蓿品種(M. sativa‘Gibraltar’)為‘北極熊’，由北京百思特有限公司提供。該品種的秋眠級(jí)為2.0級(jí)，幼苗強(qiáng)壯、根系發(fā)達(dá)，是抗寒性能非常突出的苜蓿品種。供試肥料KCl（K2O≥60%）、K2SO4（K2O≥52%）和KH2PO4（K2O≥34%）分別來(lái)源于中化化肥有限公司、國(guó)投新疆羅布泊鉀鹽有限責(zé)任公司和四川省綿竹市漢旺無(wú)機(jī)鹽化工有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)地土壤類(lèi)型為沙壤土，該土壤類(lèi)型保水保肥能力較差，透氣性好，土壤持水量小，土溫變幅較大，易耕作。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，播種前一次性施入過(guò)磷酸鈣(P2O5含量為44%)200 kg·hm-2作基肥。2020年7月1日播種，播種量為22.5 kg·hm-2。分別施用KCl、K2SO4和KH2PO43種鉀肥，單施的施用量分別為100、200和300 kg K2O·hm-2（分別用K1、K2和K3表示），并設(shè)置不施鉀肥（0 kg K2O·hm-2）作為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理設(shè)置3 次重復(fù)，共30 個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為3 m×5 m=15 m2，行距為20 cm，供試鉀肥均作為基肥于播種前一次性施入，施肥方式為撒施。試驗(yàn)田灌水使用指針式噴灌，期間進(jìn)行正常的田間管理。

于封凍前（11 月15 日）挖取長(zhǎng)勢(shì)一致的苜蓿根系（越冬器官），帶回室內(nèi)進(jìn)行低溫處理。參照朱愛(ài)民等[21]的低溫處理方法，每個(gè)小區(qū)取60 株長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的苜蓿根頸，用蒸餾水洗凈擦干后平均分成4 份，其中1 份放入4 ℃冰箱中儲(chǔ)存（低溫冷藏），將另外3份苜蓿根系整齊的排放在20 cm×30 cm 的脫脂純棉布上包裹好，然后用適量蒸餾水將卷好的脫脂純棉布均勻噴灑，使棉布保持濕潤(rùn)，最后用30 cm×30 cm的錫箔紙包裹好，放入可程式恒溫恒濕試驗(yàn)箱[6-8,13-14,21]分別進(jìn)行-10、-20、-30 ℃低溫處理（低溫冷凍）?？沙淌胶銣睾銤裨囼?yàn)箱設(shè)置為：以4 ℃為起點(diǎn)，先以4 ℃·h-1的速率降溫，達(dá)到目標(biāo)溫度后保持6 h，然后以4 ℃·h-1的速度升溫至4 ℃。低溫冷凍材料取出后在4 ℃下放置12 h，與冷藏處理材料一同取苜蓿根頸下1 cm 長(zhǎng)度，切為薄片后測(cè)定根頸MDA 含量及CAT、POD 和SOD活性。

1.4 測(cè)定指標(biāo)及方法

丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[22]測(cè)定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法[14]測(cè)定，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法[22]測(cè)定，過(guò)氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法[13]測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 軟件處理、制作表格，用DPS 7.0軟件進(jìn)行方差顯著性分析及相關(guān)性分析，采用Duncan 檢驗(yàn)方法新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉀肥對(duì)低溫脅迫下苜蓿根頸丙二醛含量的影響

如表1所示，4、-20和-30 ℃低溫脅迫處理下，KCl處理的苜蓿根頸丙二醛（MDA）含量在K1處理下達(dá)到最小值，分別較CK 顯著（P<0.05）降低了13.56%、20.11%和17.01%。4、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下，K2SO4處理的苜蓿根頸MDA 含量在K2處理下達(dá)到最小值，分別較CK顯著（P<0.05）降低了18.64%、41.85%和44.44%。4、-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下，KH2PO4處理的苜蓿根頸MDA 含量均在K2處理下達(dá)到最小值，且與CK 差異顯著（4 ℃處理除外），在-10、-20 和-30 ℃下分別較CK 顯著（P<0.05）降低了34.62%、28.80%和39.24%。3 種鉀肥處理下，在4、-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫下K2SO4處理的苜蓿根頸MDA含量均最?。?30 ℃的K1處理除外）。以上說(shuō)明K2SO4種類(lèi)鉀肥更利于緩解苜蓿根頸細(xì)胞膜質(zhì)氧化過(guò)程，且以K2處理（200 kg·hm-2K2O施用量）為宜。

表1 不同鉀肥種類(lèi)和用量下低溫脅迫處理苜蓿根頸丙二醛的含量Table 1 MDA content in alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（nmol·g-1）

2.2 鉀肥對(duì)低溫脅迫下苜蓿根頸超氧化物歧化酶活性的影響

如表2 所示，4、-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下，KCl 處理的苜蓿根頸超氧化物歧化酶（SOD）活性在不同鉀肥施用量處理下均顯著（P<0.05）高于CK（-10 和-30 ℃處理的K3處理除外），且均在K1處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長(zhǎng)了23.50%、21.54%、30.13%和35.00%；K2SO4處理的苜蓿根頸SOD 活性在不同鉀肥施用量處理下均顯著高于CK（P<0.05），且在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長(zhǎng)了36.06%、30.02%、63.37%和52.06%；KH2PO4處理的苜蓿根頸SOD活性在不同鉀肥施用量處理下均顯著（P<0.05）高于CK（-10 ℃的K3處理除外），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長(zhǎng)了28.91%、24.28%、36.12%和47.69%。3 種鉀肥處理下，在4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫時(shí)均以K2SO4處理的苜蓿根頸SOD 活性最高（4 ℃的K1處理除外），其中在K2和K3處理下與KCl 處理之間差異顯著（P<0.05）。說(shuō)明K2SO4種類(lèi)鉀肥最有利于增強(qiáng)苜蓿根頸的SOD活性，且K2處理（200 kg K2O·hm-2）效果最佳。

表2 不同鉀肥種類(lèi)和用量下低溫脅迫處理苜蓿根頸超氧化物歧化酶的活性Table 2 SOD activity in alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（U·g-1 FW）

2.3 鉀肥對(duì)低溫脅迫下苜蓿根頸過(guò)氧化氫酶活性的影響

如表3所示，4、-20和-30 ℃低溫脅迫處理下，KCl 處理的苜蓿根頸過(guò)氧化氫酶（CAT）活性均在K1處理下達(dá)到最大值，分別較CK 顯著(P<0.05)增長(zhǎng)25.66%、31.26%和17.19%。4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫下，K2SO4處理的苜蓿根頸CAT活性在不同鉀肥施用量下均顯著高于CK（P<0.05），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長(zhǎng)63.36%、37.37%、75.83%和38.10%。4、-10 和-20 ℃低溫脅迫下，KH2PO4處理的苜蓿根頸CAT 活性在不同鉀肥施用量下均顯著高于CK（P<0.05），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長(zhǎng)46.12%、15.20%和44.57%。3種鉀肥處理下，在4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫時(shí)均以K2SO4處理的苜蓿根頸CAT 活性最高，且在不同鉀肥施用量下均與KCl 處理的CAT 活性差異顯著（P<0.05）（-20 ℃的K1處理除外）。說(shuō)明K2SO4種類(lèi)鉀肥K2處理（200 kg K2O·hm-2）最有利于增強(qiáng)CAT 活性，清除H2O-2，減輕有毒害作用的物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的傷害。

表3 不同鉀肥種類(lèi)和用量下低溫脅迫處理苜蓿根頸過(guò)氧化氫酶的活性Table 3 CAT activity in alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（U·g-1·min-1）

2.4 鉀肥對(duì)低溫脅迫下苜蓿根頸過(guò)氧化物酶活性的影響

如表4所示，4、-10和-20 ℃低溫脅迫處理下，KCl 處理的苜蓿根頸過(guò)氧化物酶（CAT）活性均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 顯著（P<0.05）增長(zhǎng)26.70%、27.36%和18.89%。4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫處理下，K2SO4處理的苜蓿根頸CAT活性在不同鉀肥施用量下均顯著高于CK（P<0.05），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長(zhǎng)58.59%、59.10%、44.13%和16.39%。4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫處理下，KH2PO4處理的苜蓿根頸CAT活性在不同鉀肥施用量下均顯著（P<0.05）高于CK（-30 ℃的K1處理除外），且均在K2處理下達(dá)到最大值，分別較CK 增長(zhǎng)45.86%、48.47%、23.35%和10.06%。3種鉀肥處理下，在4、-10、-20和-30 ℃低溫脅迫時(shí)均以K2SO4處理的苜蓿根頸CAT 活性最高（4 ℃的K1處理除外），且在不同鉀肥施用量下與KCl 處理的CAT 活性差異顯著（-30 ℃的K1處理除外），在-20 和-30 ℃下與KH2PO4處理的CAT 活性差異顯著（P<0.05）。說(shuō)明K2SO4種類(lèi)鉀肥K2處理下（200 kg·hm-2K2O）增強(qiáng)POD活性的效果最明顯。

表4 不同鉀肥種類(lèi)和用量下低溫脅迫處理苜蓿根頸過(guò)氧化物酶的活性Table 4 POD activity of alfalfa root crowns with different potassium fertilizer types and dosages under low temperature stress（U·g-1·min-1）

2.5 根頸中丙二醛與抗氧化酶活性的相關(guān)性分析

如表5 所示，4、-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下的苜蓿根頸CAT 活性均與POD 活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；-10、-20 和-30 ℃低溫脅迫處理下的苜蓿根頸SOD活性與MDA含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與CAT 活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；4、-10和-20 ℃低溫脅迫處理下的苜蓿根頸SOD 活性與POD 活性呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；4 ℃低溫脅迫處理下的MDA 含量與SOD 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），4 和-30 ℃低溫脅迫處理下的MDA 含量與CAT 活性呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05）；-30 ℃低溫脅迫處理下的POD 活性與MDA 含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與SOD 活性呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；-10 和-20 ℃低溫脅迫處理下的MDA 含量與POD 活性均呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），以上說(shuō)明苜蓿根頸中抗氧化酶（CAT、POD 和SOD）活性越高，MDA 含量就越低，苜蓿根頸細(xì)胞中清除毒害物質(zhì)的能力就越強(qiáng)，膜質(zhì)過(guò)氧化程度就越輕，苜蓿的抗寒能力更強(qiáng)。

表5 苜蓿根頸丙二醛與抗氧化酶活性的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of alfalfa root crown malondialdehyde and antioxidant enzyme activity

3 討論

植物受到低溫脅迫時(shí)，植物細(xì)胞膜的膜質(zhì)會(huì)發(fā)生過(guò)氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)的氧化性損傷[23]，MDA 含量的多少可反映植物細(xì)胞受傷害的程度[24-25]。本研究表明，隨著低溫脅迫溫度的降低，苜蓿根頸MDA 含量持續(xù)增加，說(shuō)明低溫脅迫會(huì)破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，溫度越低，細(xì)胞膜質(zhì)的過(guò)氧化過(guò)程越劇烈，積累的過(guò)氧化產(chǎn)物就越多。李雙銘等[26]研究表明，隨著溫度的降低，結(jié)縷草葉片中的MDA 含量升高；孫予璐等[27]研究也發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫下4 個(gè)供試品種紫花苜蓿丙二醛含量較對(duì)照組有所提高，且隨著溫度降低，丙二醛含量呈上升趨勢(shì)，均與本研究結(jié)果一致。本研究還表明，KCl、K2SO4和KH2PO43 種鉀肥對(duì)苜蓿根頸的MDA 含量均有顯著影響，并且隨著鉀肥施用量的增加，MDA 含量表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢(shì)，說(shuō)明適量的鉀肥有利于降低苜蓿根頸的MDA 含量，而過(guò)量的鉀肥會(huì)對(duì)苜蓿細(xì)胞產(chǎn)生脅迫，對(duì)細(xì)胞膜質(zhì)產(chǎn)生進(jìn)一步的傷害，進(jìn)而導(dǎo)致MDA 含量增長(zhǎng)[28]。本研究中，K2SO4處理的苜蓿根頸MDA 含量在不同低溫脅迫處理下明顯小于KCl 和KH2PO4處理，可能的原因是K2SO4中有，其中S元素也有影響植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用，且周杰[29]的研究表明，施硫能降低小麥旗葉MDA含量，因此與KCl和KH2PO4處理相比，K2SO4處理更有利于緩解細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化程度，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS 能參與各種新陳代謝，是調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)及死亡的第二信使，在正常的生長(zhǎng)環(huán)境中，ROS 在植物體內(nèi)應(yīng)處于動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)；低溫脅迫下，ROS的大量產(chǎn)生會(huì)造成DNA 受損、蛋白質(zhì)失活、細(xì)胞膜質(zhì)過(guò)氧化甚至細(xì)胞功能紊亂、死亡等一系列生化反應(yīng)[30]，進(jìn)而激活由酶抗氧化防御系統(tǒng)和非酶抗氧化防御系統(tǒng)組成的ROS 清除系統(tǒng)，其中酶抗氧化防御系統(tǒng)包括SOD、CAT 和POD 等抗氧化酶[31]。SOD 作為清除ROS 的第一道防線，能催化超氧陰離子（O2-）歧化為過(guò)氧化氫（H2O2），其活性的強(qiáng)弱直接影響了植物的抗寒性；POD 具有防止羥基在植物體內(nèi)合成，催化各種細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)合成及降解H2O2的作用；CAT 則是以鐵卟啉為輔基，既能催化H2O2分解，減輕H2O2對(duì)細(xì)胞的毒害作用，又能協(xié)助SOD清除ROS[32-33]。本研究表明，在-20 ℃低溫處理下3種抗氧化酶活性最強(qiáng)，但當(dāng)?shù)蜏孛{迫溫度低于-20 ℃，已超過(guò)抗氧化酶系統(tǒng)可清除的閾值，系統(tǒng)遭到破壞[34]，即CAT、POD 和SOD 活性降低。李波等[35]研究表明，隨著低溫脅迫溫度的降低，‘龍牧807’苜蓿幼苗POD、SOD 活性呈先升后降的變化趨勢(shì)；于丹等[36]的研究也表明杏樹(shù)雌蕊的CAT 和POD 活性隨溫度的降低呈先上升后下降的趨勢(shì)，均與本研究結(jié)果一致。本研究中，KCl、K2SO4和KH2PO4均對(duì)苜蓿根頸的CAT、POD 和SOD 活性有顯著影響，并且隨著鉀肥施用量的增加表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢(shì)，且在不同低溫脅迫處理下的CAT、POD 和SOD 活性在不同鉀肥施用量下均明顯高于CK（POD 活性在-30 ℃下除外），說(shuō)明施鉀有利于提高苜蓿根頸中的CAT、POD 和SOD活性，與沈超[37]、羅帥[38]的研究結(jié)果一致。并且本研究中，K2SO4處理較KCl 和KH2PO4處理的苜蓿根頸中抗氧化酶活性更強(qiáng)，可能是因?yàn)镵2SO4中的S 作為酶化反應(yīng)活性中心的重要元素[39]，對(duì)抗氧化酶活性的變化也有重要作用，且王媛媛等[40]的研究也表明，施S 明顯提高了花生葉片中CAT、POD 和SOD 活性。此外，本試驗(yàn)中K2SO4處理的苜蓿根頸在200 kg K2O·hm-2施用量處理下CAT、POD 和SOD 活性顯著高于CK 及其他鉀肥施用量（P<0.05），說(shuō)明施用K2SO4增強(qiáng)苜蓿根頸抗氧化酶活性的效果最明顯，并且以200 kg K2O·hm-2施用量為宜。