張沙沙，楊寧，張微思，羅曉莉，周锫，曹晶晶，孫達(dá)鋒*

（1.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南昆明 650221）（2.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南昆明 650221）

蘭茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica），隸屬于牛肝菌科（Boletaceae）、蘭茂牛肝菌屬（Lanmaoa），盛產(chǎn)于云南、貴州等地，俗稱“紅蔥”[1]。蘭茂牛肝菌營養(yǎng)豐富，其子實體粗蛋白含量為56%、粗纖維17%、氨基酸總量為33.40%、礦物質(zhì)元素為3 820 mg/kg、粗多糖7.20%[2]。蘭茂牛肝菌滋味鮮爽，具有獨(dú)特而濃郁的香氣，深受當(dāng)?shù)厝讼矏郏壳耙怎r食為主，其組織脆嫩，易腐爛變質(zhì)，保藏困難[3]。但是蘭茂牛肝菌有微毒性，烹飪不當(dāng)可能導(dǎo)致惡心、嘔吐、產(chǎn)生幻覺等癥狀，經(jīng)適當(dāng)加熱處理后毒性減弱或消失[4-6]，因此對蘭茂牛肝菌進(jìn)行深加工，提取其滋味成分制作調(diào)味品，為廣大消費(fèi)者提供方便快捷、安全的蘭茂牛肝菌制品。

人們?yōu)橛行岣吲８尉饰段镔|(zhì)釋放率，增加呈味作用較為明顯的小分子物質(zhì)含量，在產(chǎn)品加工中會采用超聲、酶解等多種提取方法[7,8]。其中，酶解法是較為常用的生物提取法，具有污染小、耗能低、反應(yīng)可控等優(yōu)點(diǎn)[9]。劉佳等[10]利用白牛肝菌邊角料，采用正交試驗優(yōu)化白牛肝菌邊角料酶解工藝，其蛋白質(zhì)水解度為20.16%。黃典等[11]以美味牛肝菌為試驗材料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，制得的酶解液水解度為34.12%，DPPH·清除率為55.91%。本團(tuán)隊在新鮮蘭茂牛肝菌呈味物質(zhì)研究中，發(fā)現(xiàn)蘭茂牛肝菌含有豐富的氨基酸、呈味核苷酸、有機(jī)酸等可溶性呈味物質(zhì)，是一種較好的鮮味物質(zhì)來源[12]。但尚不清楚蘭茂牛肝菌酶解液的滋味成分。

本文以蘭茂牛肝菌為試驗材料，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)，研究中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶酶解蘭茂牛肝菌的最適條件和添加量，分析酶解產(chǎn)物的游離氨基酸、呈味核苷酸、有機(jī)酸等非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及含量，為滿足人們的需求，豐富蘭茂牛肝菌精深加工產(chǎn)品類型，提高產(chǎn)品附加值提供重要理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

蘭茂牛肝菌鮮品，統(tǒng)貨，購于昆明木水花野生菌交易市場。

50 000 U/g中性蛋白酶、30 000 U/g木瓜蛋白酶，南寧龐博生物工程有限公司；50 000 U/g風(fēng)味蛋白酶，滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。氫氧化鈉容量分析用標(biāo)準(zhǔn)溶液，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醛溶液，西隴科學(xué)股份有限公司；HPLC級甲醇溶液、HPLC級乙腈溶液，上海百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司；呈味核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品、酒石酸等8種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；鹽酸（體積分?jǐn)?shù)≥36%），優(yōu)級純，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；氮?dú)猓兌?9.9%），昆明石頭人氣體產(chǎn)品有限公司；緩沖溶液，英國biochrom公司；氫氧化鈉（優(yōu)級純），西隴化工試劑有限公司；苯酚（優(yōu)級純）、氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液（純度≥99.9%），默克化工技術(shù)（上海）有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

5HG-0.3CK果蔬烘干機(jī)，云南種業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司；EasyPlusTitrator ET18自動電位滴定儀、FiveEasy Plus FE28 pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋，上海立辰科技有限公司；HR/T20MM離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；TYM-30L超微粉碎機(jī)，濟(jì)南天宇專用設(shè)備有限公司；RIGOL L-3000高效液相色譜儀，北京普源精儀科技有限責(zé)任公司；HT190R高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；MIX-25旋渦混合器，杭州佑寧儀器有限公司；Biochrom 30+全自動氨基酸分析儀，英國biochrom公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解液制備

新鮮蘭茂牛肝菌干燥后，采用超微粉碎機(jī)粉碎20 min，按料液比1:20（m/m）加水溶解，選取中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶用于蘭茂牛肝菌的酶解，酶添加量（以蘭茂牛肝菌粉計，m/m）、pH值、酶解溫度、酶解時間見表1～6，酶解結(jié)束后100 ℃滅酶5 min，離心（4 000 r/min、60 ℃、15 min）取上清液備用，酶解液制備重復(fù)3次。

表1 單因素試驗因素水平表Table 1 Factor level design table of single factor test

1.3.2 酶解液制備單因素試驗

1.3.3 酶解液制備正交試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶分別選取pH值、時間、酶添加量、溫度四個因素設(shè)計L9（34）正交試驗，以氨基酸態(tài)氮含量為指標(biāo)分別確定最佳酶解條件（見表2～表4）。

表2 中性蛋白酶正交試驗因素水平表Table 2 Factor levels of orthogonal test of neutral protease

表3 風(fēng)味蛋白酶正交試驗因素水平表Table 3 Factor levels of orthogonal test of flavoring protease

表4 木瓜蛋白酶正交試驗因素水平表Table 4 Factor levels of orthogonal test of papain

1.3.4 三種酶復(fù)配條件的確定

1.3.4.1 復(fù)合酶復(fù)配酶解條件優(yōu)化

基于三種酶的正交試驗結(jié)果，選取中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶添加量（m/m）分別為0.70%、0.90%、3.70%，以氨基酸態(tài)氮為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗將三種蛋白酶酶解條件進(jìn)行復(fù)配（見表5）。

表5 復(fù)合酶解條件正交試驗因素水平表Table 5 Factor levels of orthogonal test of complex enzyme

1.3.4.2 復(fù)合酶添加比例優(yōu)化

在pH值7.0、溫度50 ℃、時間1.5 h的條件下，以中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶三種酶添加量（m/m）為因子，氨基酸態(tài)氮為指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗將三種蛋白酶進(jìn)行復(fù)配（見表6）。

表6 復(fù)合酶添加比例正交試驗因素水平表Table 6 Factor levels of orthogonal test of complex enzyme addition ratio

1.3.5 氨基酸態(tài)氮含量測定

參照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》，采用自動電位滴定儀測定。

1.3.6 氨基酸測定

參照GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》，采用全自動氨基酸分析儀測定。

1.3.7 呈味核苷酸、有機(jī)酸含量測定

參照孫達(dá)鋒等[12]的方法。

1.3.8 滋味貢獻(xiàn)評價

采用味覺活性值（TAV）法評價呈味物質(zhì)對蘭茂牛肝菌酶解液滋味的貢獻(xiàn)，TAV指樣品中各呈味物質(zhì)的測定值與該物質(zhì)味道閾值之比[13]，計算見公式（1）。

式中：

C1——滋味化合物的含量，mg/g;

C2——為滋味閾值濃度，mg/g。

1.3.9 等效鮮味濃度分析

Yamaguchi等[14,15]提出用等效鮮味濃度（EUC）來評價食品的呈鮮味作用。EUC值越大，表示食品鮮味越強(qiáng)。計算公式見公式（2）。

式中：

EUC——等效鮮味濃度，g MSG/100 g；

ai——呈鮮氨基酸（谷氨酸或天冬氨酸）的質(zhì)量，g/100 g；

aj——呈味核苷酸（5'-AMP、5'-IMP、5'-GMP）的質(zhì)量，g/100 g；

bi——呈鮮氨基酸相對谷氨酸的值（谷氨酸=1.00、天冬氨酸=0.077）；

bj——呈味核苷酸相對5'-IMP的值（5'-IMP=1.00、5'-AMP=0.18、5'-GMP=2.30）；

1 218 ——協(xié)同作用常數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel處理，GraphPad prism5做差異性分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶添加量對三種蛋白酶酶解效果的影響

酶添加量過少會導(dǎo)致底物酶解不徹底，氨基酸態(tài)氮含量過低，但酶添加過多又會導(dǎo)致底物過度酶解，部分以氮形式存在的氨基酸也有可能被進(jìn)一步分解，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量的降低。由圖1可知，三種蛋白酶酶解液的氨基酸態(tài)氮含量均隨著酶添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，所以選取中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶最適添加量（m/m）分別為0.80%、0.80%、3.70%。

圖1 酶添加量對三種蛋白酶酶解液氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effects of enzyme dosage on amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysate

2.1.2 pH值對三種蛋白酶酶解效果的影響

不同的蛋白酶其最適pH值不同，對于不同的酶解底物，其所需pH值也會略有改變。由圖2可知，三種蛋白酶酶解液的氨基酸態(tài)氮含量隨著pH值的升高呈先升高后下降的趨勢。因此中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶最適pH值分別為：7.5、6.5、6.5。

圖2 pH值對三種蛋白酶酶解液的氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effects of pH values on amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysate

2.1.3 酶解溫度對三種蛋白酶酶解效果的影響

酶解溫度影響酶的活性及酶催化反應(yīng)的進(jìn)程。由圖3可知，三種蛋白酶酶解液的氨基酸態(tài)氮含量均隨著溫度的升高呈先上升后降低的趨勢。因此，中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶最適溫度分別為：50、50、55 ℃。

圖3 酶解溫度對三種酶酶解液氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effects of temperature on amino acid nitrogen content of enzymatic hydrolysate

2.1.4 酶解時間對三種蛋白酶酶解效果的影響

由圖4可知，酶解液中氨基酸態(tài)氮的含量隨著酶解時間的延長而增加，但到達(dá)一定值時，氨基酸態(tài)氮含量則隨著時間的延長開始減少，這可能是因為酶對底物的酶解是逐漸進(jìn)行的，需要經(jīng)過一定時間，但酶解時間過長，會使部分以氮形式存在的氨基酸被水解，導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮含量進(jìn)一步降低。因此，中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶選取的最適酶解時間分別為：3.0、3.0、1.5 h。

圖4 酶解時間對三種蛋白酶酶解液的氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effects of time on amino acid nitrogen contentof enzymatic hydrolysate

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

2.2.1 單一蛋白酶正交試驗優(yōu)化

由表7可知，中性蛋白酶酶添加量、pH值、溫度、時間四個因素對氨基酸態(tài)氮含量的影響順序為時間＞溫度＞pH值＞酶添加量，最佳工藝組合為A1B2C2D1，即酶添加量0.70%、pH值7.5、溫度50 ℃、酶解時間2.5 h。在該條件下進(jìn)行驗證試驗，酶解液氨基酸態(tài)氮含量為113.72 mg/100 mL。風(fēng)味蛋白酶四個因素對氨基酸態(tài)氮的影響順序為pH值＞時間＞溫度＞酶添加量，最佳工藝組合為A3B3C1D3，即酶添加量0.90%、pH值7.0、溫度48 ℃、時間3.5 h，在該條件下進(jìn)行驗證試驗，蘭茂牛肝菌酶解液氨基酸態(tài)氮含量為115.65 mg/100 mL。木瓜蛋白酶四個因素對氨基酸態(tài)氮的影響順序為pH值＞溫度＞酶添加量＞時間，最佳工藝A2B3C2D2，即酶添加量3.70%、pH值7.0、溫度55 ℃、時間1.5 h，在該條件下進(jìn)行木瓜蛋白酶酶解驗證試驗，蘭茂牛肝菌酶解液氨基酸態(tài)氮含量為110.48 mg/100 mL。

表7 單一蛋白酶正交試驗結(jié)果Table 7 Results of single protease orthogonal test

2.2.2 三種酶復(fù)配酶解條件優(yōu)化

由表8可知，pH值、溫度、時間三因素對三種復(fù)合酶酶解液氨基酸態(tài)氮的影響順序為時間＞溫度＞pH值。其最佳工藝組合為A2B2C1，即pH值7.0，溫度50 ℃，時間1.5 h。在該條件下進(jìn)行三種酶復(fù)配酶解條件的驗證試驗，蘭茂牛肝菌酶解液氨基酸態(tài)氮含量為122.24 mg/100 mL。

表8 三種酶復(fù)配條件正交試驗結(jié)果Table 8 Results of three enzyme compositeconditions orthogonal test

2.2.3 三種酶復(fù)配配比正交試驗結(jié)果

由表9可知，三種酶添加量對氨基酸態(tài)氮的影響順序為中性蛋白酶添加量＞木瓜蛋白酶添加量＞風(fēng)味蛋白酶添加量。其最佳工藝組合為A1B2C3，即中性蛋白酶添、風(fēng)味蛋白酶和木瓜蛋白酶加量（m/m）分別為0.60%、0.90%、4.70%。在該條件下進(jìn)行三種酶復(fù)配酶解條件的驗證試驗，蘭茂牛肝菌酶解液氨基酸態(tài)氮含量為124.01 mg/100 mL。

表9 三種蛋白酶復(fù)配配比正交試驗結(jié)果Table 9 Results of three protease compounding ratios orthogonal test

2.3 酶解液滋味分析

2.3.1 酶解液氨基酸分析

游離氨基酸不僅是營養(yǎng)成分，還可以改變食品的風(fēng)味，是食品的滋味成分[16]，呈現(xiàn)出鮮味、甜味、苦味等。五種酶解液中游離氨基酸組成及含量如表10所示。蘭茂牛肝菌酶解液中共檢出17種游離氨基酸，鮮味氨基酸含量和游離氨基酸總量均高于郝志林等[17]檢測的雞胸肉樣品的游離氨基酸含量，所以蘭茂牛肝菌酶解液適合做調(diào)味料。且五種酶解液的游離氨基酸中均是谷氨酸含量最高，單一蛋白酶中風(fēng)味蛋白酶酶解液的總游離氨基酸含量最高（11.50 mg/g），蛋白酶復(fù)配后酶解液中總游離氨基酸含量顯著高于單一蛋白酶（P＜0.01），因此蛋白酶復(fù)配后酶解有利于游離氨基酸的釋放。

表10 酶解液游離氨基酸的組成及含量Table 10 Composition and content of amino acids of enzymatic hydrolysate

目前，采用呈味強(qiáng)度值（TAV）法評價單個滋味成分對酶解液滋味的貢獻(xiàn)大小，通常認(rèn)為，當(dāng)TAV大于1時，該成分對樣品呈味有重要影響，并且數(shù)值越大，貢獻(xiàn)越大[18]。由表13可知，蘭茂牛肝菌五種酶解液TAV均大于1的游離氨基酸為谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、精氨酸（Arg），且谷氨酸最高，說明谷氨酸對蘭茂牛肝菌酶解液呈味貢獻(xiàn)最大。

2.3.2 酶解液呈味核苷酸分析

核苷酸是產(chǎn)生鮮味的重要物質(zhì)，與游離氨基酸、無機(jī)鹽等具有協(xié)同作用，能夠使鮮味增強(qiáng)[19]。五種酶解液中呈味核苷酸組成及含量見表11。木瓜蛋白酶酶解液的呈味核苷酸含量最高，主要是因為5'-CMP含量和5'-AMP較高，這與莊金達(dá)[20]的研究結(jié)果一致。5'-AMP可以使食用菌呈現(xiàn)甜味并抑制苦味[21]。由表13可知，呈味核苷酸TAV均小于1，所以單獨(dú)呈味核苷酸對蘭茂牛肝菌酶解液滋味影響不大，主要起協(xié)同作用。

表11 酶解液呈味核苷酸組成及含量Table 11 Composition and content of flavor nucleotides of enzymatic hydrolysate

2.3.3 酶解液有機(jī)酸分析

食用菌有機(jī)酸與酯類、氨基酸、芳香物質(zhì)的代謝有關(guān)[20]，其種類和含量影響食用菌獨(dú)特的風(fēng)味。五種酶解液中有機(jī)酸種類和含量見表12。蘭茂牛肝菌酶解液中蘋果酸含量最高，乙酸次之，二者占復(fù)合蛋白酶酶解液有機(jī)酸總量的50%以上，這與莊金達(dá)、谷鎮(zhèn)等[20,22]的研究一致。由表13可知，酒石酸、蘋果酸、乙酸TAV均大于1，且酒石酸TAV在9.50～33.25之間。所以酒石酸、蘋果酸、乙酸對蘭茂牛肝菌酶解液的風(fēng)味有貢獻(xiàn)，且酒石酸貢獻(xiàn)最大。

表12 酶解液有機(jī)酸組成及含量Table 12 Composition and content of organic acids in of enzymatic hydrolysate

表13 酶解液游離氨基酸、呈味核苷酸、有機(jī)酸TAV分析Table 13 TAV analysis of free amino acids, flavoring nucleotides and organic acids in of enzymatic hydrolysate

2.3.4 酶解液EUC值計算結(jié)果

由圖5可以看出，復(fù)配配比正交優(yōu)化的酶解液EUC值最高，但與復(fù)配條件正交優(yōu)化和中性蛋白酶酶解液的EUC值沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖5 酶解液等效鮮味濃度值EUCFig.5 EUC values of enzymatic hydrolysate

3 結(jié)論

本研究采用單因素和正交試驗優(yōu)化蘭茂牛肝菌酶解液制備工藝，獲得的最優(yōu)酶解條件為：pH值7.0，溫度50 ℃，時間1.5 h，中性蛋白酶添加量為0.60%、風(fēng)味蛋白酶添加量為0.90%、木瓜蛋白酶添加量為4.70%，此條件下獲得的酶解液的氨基酸態(tài)氮為124.01 mg/100 mL、游離氨基酸總量為12.33 mg/g、呈味核苷酸總量為96.48 μg/g、有機(jī)酸總量為4 511.59 μg/g，EUC值為2.46 g MSG/100 g，均高于單一蛋白酶酶解液。谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、精氨酸（Arg）對蘭茂牛肝菌酶解液呈味有直接貢獻(xiàn)，且谷氨酸貢獻(xiàn)最大；呈味核苷酸對酶解液呈味無直接貢獻(xiàn)；酒石酸是酶解液中對呈味貢獻(xiàn)最大的有機(jī)酸。本研究為酶解法制備食用菌調(diào)味精基料提供了理論基礎(chǔ)，豐富產(chǎn)品類型，滿足了人們的需求，提高產(chǎn)品附加值。