黃 薇，凌睿云，高樂(lè)欣，唐 文，錢令波，陳峰陽(yáng)

杭州醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053

CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,即Treg細(xì)胞,是CD4+T細(xì)胞的免疫抑制亞群,其特征是轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)上調(diào)。Treg細(xì)胞是維持免疫耐受和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的正常免疫系統(tǒng)不可或缺的組成部分,然而,在多數(shù)腫瘤的微環(huán)境中,聚集的Treg細(xì)胞抑制抗腫瘤免疫反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[1]。因此,Treg細(xì)胞與腫瘤的免疫逃逸、耐藥以及不良預(yù)后都密切相關(guān)[2]。

近年來(lái),腫瘤的治療手段日新月異,但化學(xué)治療(化療)仍是臨床治療的主要手段,而腫瘤耐藥是化療藥物難以為繼、無(wú)法達(dá)到預(yù)期治療效果的主要障礙。腫瘤化療藥物引起耐藥的原因多樣,期中一個(gè)重要原因是腫瘤免疫微環(huán)境的改變,包括Treg細(xì)胞比例或功能的改變[3]。研究發(fā)現(xiàn),有些化療藥如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)和吉西他濱(gemci-tabine)能降低腫瘤微環(huán)境Treg細(xì)胞的比例[4],而博來(lái)霉素(bleomycin)則會(huì)提高Treg細(xì)胞的比例[5],但大部分化療藥物對(duì)Treg細(xì)胞的影響并不清楚。

為了更好的了解化療藥物對(duì)Treg細(xì)胞的影響,進(jìn)而進(jìn)一步明確化療藥物對(duì)免疫微環(huán)境的改變及耐藥機(jī)制,本文選取20種臨床常用的化療藥,體外觀察了其對(duì)Treg細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠,6周齡[上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,合格證號(hào):SCXK(滬)2017-0005]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)得后飼養(yǎng)1周再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑:重組小鼠IL-2、FITC-抗小鼠-TCRβ和PerCP-Cy5.5抗小鼠-CD4(BD Pharmingen 公司);APC抗小鼠-Foxp3及其同型(isotype)對(duì)照、Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set和CellTraceTMViolet (Thermo Fisher Scientifc公司);20種化療藥標(biāo)準(zhǔn)品(上海阿拉丁試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾Treg細(xì)胞的分離:無(wú)菌取小鼠脾臟,制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞篩過(guò)濾及PBS洗滌后以含1%青霉素和鏈霉素及10% FBS的1640培養(yǎng)液混懸。

1.2.2 Treg細(xì)胞增殖的測(cè)定:取小鼠脾細(xì)胞,先用CellTraceTMViolet 標(biāo)記,后調(diào)整濃度為1×1010個(gè)/L。于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔加入細(xì)胞懸液100 μL,再加入重組小鼠IL-2及化療藥物各50 μL。IL-2的濃度為250 ng/L,化療藥物的濃度根據(jù)先前對(duì)脾細(xì)胞的毒性測(cè)定結(jié)果而定,采用無(wú)細(xì)胞毒性的最大濃度。3組細(xì)胞分別是control組(1640培養(yǎng)液); IL-2組(250 ng/L IL-2);化療藥物組(IL-2+化療藥)。培養(yǎng)3 d后,收集細(xì)胞,采用Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set破膜和固定,以熒光抗體FITC-TCRβ、PerCP-Cy5.5-CD4和APC-Foxp3標(biāo)記后,流式細(xì)胞儀測(cè)定Foxp3+CD4+T細(xì)胞比例及CellTrace標(biāo)記的增殖細(xì)胞比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 吉西他濱明顯抑制IL-2誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞的增殖

與對(duì)照組相比,IL-2刺激后,CD4+T細(xì)胞中Foxp3+Treg細(xì)胞的比例明顯增加(P<0.05);進(jìn)入細(xì)胞分裂周期的Treg細(xì)胞數(shù)也從正常組的約16%提高到約42%(P<0.05)。加入吉西他濱后,細(xì)胞分裂周期的Treg細(xì)胞數(shù)顯著降低(圖1)。

圖1 FACS測(cè)定Treg細(xì)胞比例和增殖Fig 1 Proportion and proliferation of Treg cells were assayed by FACS

2.2 20種化療藥對(duì)IL-2誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞增殖的影響

按照上述方法,共檢測(cè)20個(gè)化療藥在無(wú)細(xì)胞毒性濃度下的作用。有12個(gè)能顯著抑制IL-2誘導(dǎo)的Foxp3+Treg細(xì)胞增殖 (P<0.05),表現(xiàn)為Foxp3+Treg細(xì)胞比例的減少和分裂細(xì)胞數(shù)的降低(表1)。

表1 20種化療藥對(duì)IL-2誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞增殖的影響Table 1 Effects of 20 chemotherapeutic agents on the proliferation of Treg cells induced by n=3)

3 討論

在腫瘤組織中,Treg細(xì)胞可以通過(guò)搶奪效應(yīng)T細(xì)胞所需的IL-2,高表達(dá)CTLA-4分子干擾抗原遞呈細(xì)胞,分泌免疫抑制性細(xì)胞因子而抑制或殺傷其他抗腫瘤免疫細(xì)胞。因此,降低腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的數(shù)目或抑制其功能近年來(lái)被認(rèn)為是抗腫瘤免疫治療的新途徑[6]。吉西他濱(gemcitabine)能減少胰腺癌患者的外周血中Treg細(xì)胞的比例[7]。多西他賽(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel)治療非小細(xì)胞肺癌后,患者外周血中Treg細(xì)胞的比例也顯著降低[8-9]。表柔比星(epirubicin)能抑制小鼠Treg細(xì)胞的免疫抑制功能從而促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的功能[10]。與這些報(bào)道相似,本結(jié)果同樣顯示吉西他濱、多西他賽、紫杉醇和表柔比星能直接抑制IL-2誘導(dǎo)的Treg細(xì)胞增殖。奧沙利鉑(oxaliplatin)在結(jié)腸癌中能促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖引起耐藥[11],而本研究同樣發(fā)現(xiàn)其對(duì)Treg細(xì)胞增殖的抑制作用。由于實(shí)驗(yàn)條件及體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的差異, 奧沙利鉑對(duì)Treg細(xì)胞的確切影響還需要更多的證據(jù)。大部分化療藥對(duì)Treg細(xì)胞的影響迄今未見(jiàn)報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn),阿糖胞苷(cytarabine)、長(zhǎng)春地辛(vindesine)、伊立替康(irinotecan)等另外7個(gè)化療藥對(duì)Treg細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用,卡培他濱(capecitabine)、順鉑(cisplatin)、培美曲賽(pemetrexed)等8個(gè)藥物則沒(méi)有明顯的影響。雖然化療藥調(diào)節(jié)Treg細(xì)胞的作用已有一些報(bào)道,但其作用機(jī)制并不清楚。本研究中,影響微管蛋白的3個(gè)藥物, 干擾轉(zhuǎn)錄和RNA合成的3個(gè)藥物及2個(gè)拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑均能抑制Treg細(xì)胞增殖;而7個(gè)抑制核酸合成藥物及4個(gè)鉑類藥物的結(jié)果并不一致?；熕幊耸熘目鼓[瘤靶點(diǎn)外,通常也會(huì)脫靶產(chǎn)生其他生物效應(yīng)。Treg細(xì)胞表面表達(dá)有豐富的IL-2受體CD25,因此在IL-2作用下活化增殖,其機(jī)制主要與STAT5、Ras-Raf-MAPK和PI3K信號(hào)通路有關(guān)[12]。上述12種有效化療藥可能通過(guò)這3種途徑發(fā)揮抑制Treg增殖的作用。當(dāng)然,本實(shí)驗(yàn)只是體外細(xì)胞水平的觀察,其結(jié)果有待體內(nèi)實(shí)驗(yàn)尤其是臨床腫瘤患者的觀察和驗(yàn)證。

總之,通過(guò)對(duì)20種臨床常用的化療藥作用于Treg細(xì)胞的觀察,本研究發(fā)現(xiàn)有12種藥物能顯著抑制Treg細(xì)胞的增殖。表明除了常規(guī)作用機(jī)制外,這12種化療藥也可能通過(guò)抑制腫瘤微環(huán)境中Treg細(xì)胞的增殖而進(jìn)一步發(fā)揮抗腫瘤效果。該結(jié)果對(duì)進(jìn)一步闡明這些化療藥物的藥理作用機(jī)制及耐藥機(jī)制提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。