徐思凡

（江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院，江西南昌 330052）

熒光法具有快速、操作簡單和靈敏度高等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于結(jié)晶紫（Crystal Violet，CV）的檢測。近年來，以金納米簇為代表的納米熒光材料獲得越來越多的關(guān)注。金納米簇的熒光性質(zhì)與自身尺寸有關(guān)，當其粒徑接近于電子的費米波長（0.5 nm）時，表現(xiàn)出類似分子的性質(zhì)，如HOMO-LUMO躍遷和熒光特性等。隨著金核數(shù)量的增加，熒光將會發(fā)生紅移，這使金納米簇具有可調(diào)節(jié)的熒光波長[1]。長波長發(fā)射的金納米簇可以很好地降低生物自體的背景熒光干擾，為生物樣品的實際檢測提供了基礎(chǔ)。此外，由于銀原子擁有和金原子相似的尺寸和化學(xué)性質(zhì)，故在金納米簇合成過程中，銀的加入使二者表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，使雙金屬納米簇表現(xiàn)出比單一金屬納米簇更大的尺寸以及更強的熒光和催化活性。因此，本文以生物質(zhì)材料鴨蛋清為模板采用簡單的微波法快速制備了具有長波長熒光發(fā)射的鴨蛋清金銀納米簇（Duck Egg White-AuAg Nanoclusters，DEW-AuAgNCs），并構(gòu)建了一種基于FRET的檢測水產(chǎn)品中殘留CV的新方法，實現(xiàn)了CV的簡單快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

結(jié)晶紫（2 mmol·L-1）：稱取0.081 6 g CV粉末，用超純水定容于100 mL容量瓶，再轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶，4 ℃儲存?zhèn)溆茫涣下冉鹚幔? mmol·L-1）：稱取HAuCl4·6H2O 0.205 6 g，用超純水定容于100 mL容量瓶，再轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶4 ℃儲存?zhèn)溆?；硝酸銀（5 mmol·L-1）：稱取0.042 4 g AgNO3，用超純水定容于50 mL容量瓶，4 ℃儲存于棕色試劑瓶。實驗所用試劑全部為分析純，實驗用水為超純水，電阻率≥18.25 MΩ·cm。

1.1.2 實驗儀器

Luminous熒光分光光度計，美國賽默飛公司；UV2550紫外可見分光光度計，日本島津公司；Tecnai G2 F20 S-TWIN透射電子顯微鏡，美國FEI公司；Escalab 250Xi X射線光電子能譜儀，美國賽默飛公司；IRTracer-100傅立葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；FLS980熒光光譜儀，英國愛丁堡公司；Nano ZS-90動態(tài)光散射納米粒度分析儀，英國馬爾文公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DEW-AuAgNCs的合成

以鴨蛋清、氯金酸和硝酸銀為前體，采用一步微波法在1 min內(nèi)快速合成DEW-AuAgNCs。取鴨蛋清置于錐形瓶中，磁力攪拌10 min，并超聲20 min充分混勻。向錐形瓶中依次加入1.7 mL的鴨蛋清、2.4 mL的5 mmol·L-1HAuCl4和185 μL的5 mmol·L-1AgNO3溶液，磁力攪拌2 min后，逐滴加入800 μL的1 mol·L-1NaOH溶液，攪拌2 min，放入微波爐中，225 W反應(yīng)1 min，得到深黃色液體。為去除未反應(yīng)完的鴨蛋清、HAuCl4和AgNO3，采用50 KD截留量的超濾管4 000 r·min-1離心20 min對DEWAuAgNCs純化處理，棄去濾出液，將濃縮液置于4 ℃避光儲存。同時分別在不添加AgNO3和HAuCl4的條件下采用相同的方法合成DEW-AuNCs和DEW-AgNCs。

1.2.2 TEM表征

分別吸取適量的DEW-AuAgNCs溶液，滴加到銅網(wǎng)上，待完全干燥后，采用透射電鏡觀察DEWAuAgNCs的形貌、分布及粒徑大小。

1.2.3 XPS表征

將載玻片裁成1 cm×1 cm大小的正方形，王水浸泡24 h后用大量超純水清洗。將DEW-AuAgNCs滴加到載玻片上，放入真空干燥箱，待完全干燥后，采用X射線光電子能譜儀分析DEW-AuAgNCs的元素種類[2]。

1.2.4 紅外表征

將鴨蛋清和DEW-AuAgNCs分別進行冷凍干燥處理，得到固體粉末，壓片后上機掃描紅外光譜。

1.2.5 結(jié)晶紫檢測體系的建立

依次向pH值為5的NH4Ac-HAc緩沖液中加入50 μL DEW-AuAgNCs和50 μL不同濃度的CV標準溶液，放入恒溫混勻儀中30 ℃反應(yīng)5 min，上機掃描其熒光光譜。在380 nm激發(fā)波長下，記錄682 nm處的熒光強度，并計算熒光猝滅效率（F0-F）/F0（F0和F分別為加入CV前后的熒光強度值）。以（F0-F）/F0為縱坐標，CV的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.2.6 實際樣品的檢測

于當?shù)厥袌鲑徺I新鮮鯽魚和草魚，分別取適量魚肉利用組織研磨儀粉碎后，準確稱取5 g，加入13 mL乙腈并超聲30 min，離心取上清液。向沉淀中再加入12 mL乙腈，再次超聲30 min，離心取上清液。合并兩次提取液，放入真空干燥箱揮干乙腈，再加入25 mL超純水后檢測其中的CV含量，并進行加標回收實驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 DEW-AuAgNCs的形成

以鴨蛋清為保護劑和還原劑，采用一步微波法合成了DEW-AuAgNCs。DEW-AuAgNCs的形成過程可分為3步。①在堿性條件下，HAuCl4和AgNO3可被蛋白質(zhì)中具有還原性的成分（酪氨酸和半胱氨酸殘基）還原為零價的金和銀。由于AuCl4-的還原電勢低于Ag+，故金的還原速度比銀相對要快，因此被還原的Au原子先沉積形成金核[3]。②Ag+在先形成的金核表面形成金屬鍵，同時金核催化了銀核的沉積。③金核和銀核共沉積從而形成合金核，并在蛋白質(zhì)模板內(nèi)部進一步聚集，形成了具有強熒光發(fā)射的金銀納米簇。

2.2 DEW-AuAgNCs的表征

采用透射電子顯微鏡觀察了DEW-AuAgNCs的大小和形態(tài)。由圖1（a）可以看出DEW-AuAgNCs在水溶液中分散均勻，形狀為近球形，無核殼結(jié)構(gòu)。圖1（b）的粒徑在1.0～2.6 nm，平均尺寸約為1.83 nm。圖1（a）的內(nèi)插圖為DEW-AuAgNCs在高分辨率透射電鏡下的晶格結(jié)構(gòu)圖，通過Digital Micrograph軟件分析得DEW-AuAgNCs的晶格間距約0.19 nm。

利用傅里葉變換紅外（Fourier Transform Infrared，F(xiàn)T-IR）研究了DEW-AuAgNCs的化學(xué)結(jié)構(gòu)和形成機理。圖2是鴨蛋清和DEW-AuAgNCs的FT-IR圖，鴨蛋清和DEW-AuAgNCs的FT-IR光譜具有極為相似的吸收峰。3 298 cm-1處的吸收峰與O–H和N–H的伸縮振動有關(guān)，1 531 cm-1處歸因于C-N的特征峰，1 649 cm-1處屬于C=O的振動吸收峰，這證明了酰胺I帶和酰胺II帶的存在；在合成DEW-AuAgNCs前后，酰胺鍵的位置沒有發(fā)生明顯的變化，表明所合成的AuAgNCs被包裹在鴨蛋清中。合成DEWAuAgNCs后3 298 cm-1、1 649 cm-1和1 531 cm-1位置的峰強度均變?nèi)?，? 298 cm-1的峰變寬，這表明AuCl4-和Ag+與蛋白質(zhì)之間發(fā)生了相互作用，改變了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。

圖2 DEW-AuAgNCs 的紅外光譜圖

2.3 DEW-AuAgNCs檢測CV的原理

本文以廉價的生物質(zhì)材料鴨蛋清為模板，采用微波法快速（1 min內(nèi)）合成長波長發(fā)射的DEWAuAgNCs。合成的DEW-AuAgNCs在380 nm激發(fā)波長下，在682 nm處有最大熒光發(fā)射[4]?；贒EW-AuAgNCs與CV之間的FRET，DEWAuAgNCs的熒光被CV選擇性地猝滅，據(jù)此本研究構(gòu)建一種熒光猝滅法檢測水產(chǎn)品中殘留的CV，檢測原理如圖3所示。

圖3 DEW-AuAgNCs的合成和熒光猝滅法檢測CV的原理圖

2.4 熒光猝滅機制的分析

常見的熒光猝滅機制有光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（Photoinduced Electron Transfer，PET）、靜電相互作用、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）和內(nèi)濾效應(yīng)（Inner Filter Effect，IFE）。為探索CV猝滅DEW-AuAgNCs熒光的機制，通過紫外可見吸收光譜、熒光光譜、Zeta電位和熒光壽命等一系列表征來系統(tǒng)的驗證。由圖4（a）可以看出，在添加CV標準溶液后，DEW-AuAgNCs的紫外吸收峰位置沒有明顯改變，且未出現(xiàn)新的吸收峰，因此DEW-AuAgNCs和結(jié)晶紫反應(yīng)后沒有產(chǎn)生新的復(fù)合物排除PET。由圖4（b）可以看出，DEWAuAgNCs、CV、DEW-AuAgNCs+CV的Zeta電位分別為-18.43 eV、-6.29 eV和-21.5 eV，DEWAuAgNCs和CV均帶負電荷，故二者之間不會發(fā)生靜電相互作用。通過掃描DEW-AuAgNCs的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜和CV的紫外可見吸收光譜，由圖4（c）發(fā)現(xiàn)，DEW-AuAgNCs的熒光發(fā)射光譜和CV的紫外可見吸收光譜有部分重疊，因此，二者之間可能發(fā)生了FRET或IFE。

圖4 熒光猝滅機制驗證過程

FRET是當供體熒光分子從激發(fā)態(tài)向基態(tài)躍遷時，釋放的能量被受體分子吸收的能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。在FRET的過程中，供體分子本身熒光強度減弱，熒光壽命發(fā)生衰減，而受體分子熒光增加或不變。故FRET發(fā)生的前提是指供體的發(fā)射光譜與受體的紫外可見吸收光譜有重疊；二者的距離足夠近（一般在10 nm內(nèi)）；供體的熒光壽命發(fā)生衰減。IFE是指猝滅劑吸收熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光，從而使熒光物質(zhì)的熒光被猝滅的現(xiàn)象。在IFE過程中，猝滅劑的紫外可見吸收光譜與熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜或發(fā)射光譜重疊并且加入猝滅劑前后，熒光物質(zhì)的熒光壽命不會改變[5]。FRET和IFE的主要區(qū)別在于在猝滅劑的存在下，體系的熒光壽命是否發(fā)生了變化。因此進一步檢測了單獨的DEW-AuAgNCs和添加CV后的熒光壽命。由圖4（d）可以看出添加CV后體系的熒光壽命發(fā)生了明顯的衰減。DEW-AuAgNCs的熒光壽命為405 ns，與結(jié)晶紫反應(yīng)后，體系的熒光壽命衰減到282 ns，熒光壽命衰減了30.37%。以上的結(jié)果表明，CV猝滅DEWAuAgNCs熒光的機制是FRET。

2.5 實際樣品分析

作為水產(chǎn)品養(yǎng)殖的殺菌劑，CV易富集在魚類體內(nèi)，對人體健康造成威脅。為進一步驗證該方法的實用性，對草魚和鯽魚中CV的含量進行了檢測，并做了加標回收試驗。如表1所示，草魚和鯽魚中未檢測到CV，向樣品溶液中加入0.05 μmol·L-1、0.50 μmol·L-1和1.00 μmol·L-13個濃度的CV標準溶液，7次平行測定結(jié)果顯示，加標回收率在98.00%～104.90%。因此，本研究構(gòu)建的DEW-AuAgNCs熒光探針用于檢測魚類樣本中的CV具有準確性和可靠性。

表1 魚類樣品中CV的檢測結(jié)果表（n=7）

3 結(jié)論

基于FRET的傳感方法具有快速和靈敏度高等優(yōu)點，在藥物、食品和環(huán)境檢測領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。新型納米材料，如碳點、金屬納米簇、金屬納米粒子、上轉(zhuǎn)換納米粒子和二維層狀納米片具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和生物相容性，是FRET體系熒光供體和受體的理想材料。此外核酸適配體和抗體等具有高度特異性，可利用這個特性大大提高傳感方法的靈敏度。