李彥湘,丁德東,何 靜,*,張金花,趙吉桃,趙 倩,候彩霞,朱 珠

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學 林學院,甘肅 蘭州 730070; 2.隴南市科學技術情報研究所,甘肅 隴南 742500)

植物侵染性病害是由細菌、真菌、線蟲、原生動物和病毒等多種微生物引起的[1],其中,真菌是主要致病因子之一,可侵染植物的根、莖、葉、花、果等大部分部位[2]。近年來,真菌病害的頻繁發(fā)生導致植株生長不良,產(chǎn)量和質(zhì)量下降,甚至引起植株死亡?，F(xiàn)階段化學防治仍是控制該類病害的主要手段,然而,化學農(nóng)藥的密集使用,嚴重影響了作物品質(zhì),甚至對人類和整個生態(tài)環(huán)境構成了巨大威脅[3-4]。因此,尋找高效、環(huán)保的綠色新型抗真菌藥劑已成為亟待解決的問題之一[5-6]。

木醋液是以木材或木材加工廢棄物、采伐剩余物,以及森林撫育采伐獲得的枝條等為材料,在干餾設備中干餾,導出的蒸汽氣體混合物經(jīng)冷凝分離后得到的液體[7]。因其制備所用原材料的種類、精制方法和熱解工藝等,其成分與含量略有差異,但都以酚類和酸類為主,此外還有酮類、醛類、酯類、醇類,以及鈣(Ca)、鎂(Mg)、鉀(K)、鐵(Fe)、鋅(Zn)、鍺(Ge)、錳(Mn)等微量元素[8]?，F(xiàn)階段,木醋液已在農(nóng)林業(yè)[9]、畜牧業(yè)[10]、食品加工業(yè)[11]、化工業(yè)[12]、醫(yī)藥衛(wèi)生業(yè)[13]等領域均得到廣泛應用。研究表明,木醋液對多種病原菌有抑制活性,如楊樹潰瘍病菌、石榴干腐病菌、辣椒枯萎病原菌、人參黑斑病菌、桃炭疽病菌等[14-16],但對其作用機制的研究還不成熟。研究者對木醋液中哪些成分起主導作用的說法并不統(tǒng)一[17]。研究發(fā)現(xiàn),木醋液中的酸性物質(zhì)[18]或酚類物質(zhì)[19-20]是其發(fā)揮抑菌活性的主要成分。木醋液抑菌機制的研究不僅是一項研究熱點,同時也是研究難點[21]。目前,木醋液抑菌機制的研究大多集中在細菌方面,已發(fā)現(xiàn)的木醋液對細菌的抑菌機制主要有:1)抑制細菌分裂能力;2)破壞細菌細胞膜結構,使細菌內(nèi)容物滲漏;3)抑制細菌蛋白合成,擾亂細菌代謝。段曉玲等[22]通過研究木屑木醋液、白樺木醋液、雜木木醋液、蒸餾木屑木醋液4種木醋液對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的生長曲線、細胞膜通透性、菌懸液可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響,發(fā)現(xiàn)木醋液的抑菌機制主要是通過抑制細菌生長、破壞細胞膜結構導致內(nèi)含物外泄,以及抑制細菌蛋白的合成,從而使細菌死亡。Shi等[23]研究表明,竹醋液中的酚類物質(zhì)可以降低細胞膜的通透性和蛋白酶活性,使菌體生理代謝紊亂,抑制細菌生長。施琳[24]研究表明,山杏殼木醋液的主要成分有機酸類物質(zhì)能夠導致細菌細胞壁破裂,從而使菌體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量驟減,有效阻礙細胞生長的全過程。但有關木醋液對植物病原真菌的抑菌機制還鮮有報道。

本研究通過木醋液對7種供試植物病原真菌的室內(nèi)毒力測定,篩選敏感菌,并通過考察其對供試敏感菌孢子萌發(fā)、菌絲干重、細胞膜通透性、細胞壁完整性、可溶性蛋白、可溶性糖、還原性糖和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)含量等指標的影響,結合電鏡觀察菌體超微結構變化揭示其作用機制,為木醋液在植物病害綠色防控中的應用提供理論依據(jù),對農(nóng)林業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的7種植物病原真菌為木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、楊生盾殼霉(Coniothyriumpopulicola)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、黃色鐮孢菌(Fusariumculmorum)、三線鐮孢菌(Fusariumtricinctum)、鏈格孢菌(Alternariaalternata),均由甘肅農(nóng)業(yè)大學林學院森林保護實驗室提供,經(jīng)活化后在0～4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

木醋液:桃殼木醋液購自石家莊宏森木炭有限公司,是以桃殼為原材料在干餾設備中干餾導出的蒸汽氣體混合物經(jīng)冷凝分離后得到液體,呈淡黃色半透明,具有煙熏香味,pH值2.3。

1.2 木醋液對7種病原真菌的抑菌活性

將供試的7種植物病原真菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上,于28 ℃培養(yǎng)7 d后取菌餅,分別接種于木醋液體積分數(shù)為0、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、10.5、14.5、18.5、22.5、26.5、30.5 μL·mL-1的瓊脂培養(yǎng)基中央,每個處理重復3次,28 ℃培養(yǎng)7 d后,測定菌落生長直徑,計算其抑制率。

1.3 木醋液對F. culmorum的影響

1.3.1 孢子萌發(fā)和芽管伸長

孢子懸浮液的制備:在PDA平板上接種F.culmorum,28 ℃黑暗培養(yǎng)7 d,用無菌水沖洗孢子并稀釋,最終制成6×106mL-1孢子懸浮液備用。

將孢子懸浮液和不同體積分數(shù)的木醋液按照1∶1的比例滴在載玻片上,使木醋液的終體積分數(shù)為0、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 μL·mL-1(F.culmorum在木醋液體積分數(shù)為6.5 μL·mL-1時不生長),混勻后放于濾紙保濕的培養(yǎng)皿中,28 ℃黑暗培養(yǎng)6 h,然后在光學顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)率和芽管長度,每處理3次重復,每個重復隨機取5個高倍鏡視野(每個視野下約20個孢子)進行鏡檢。以芽管長度超過孢子直徑一半記為萌發(fā),用下式計算孢子萌發(fā)率:

Rg=n/N。

(1)

式(1)中:Rg表示孢子萌發(fā)率;n表示孢子萌發(fā)數(shù);N表示總孢子數(shù)。

1.3.2 生物量

將上述孢子懸浮液加入馬鈴薯葡萄糖(PDB)液體培養(yǎng)基中,經(jīng)28 ℃、160 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)2 d后,過濾菌絲并轉移至含藥PDB培養(yǎng)基中(木醋液體積分數(shù)分別為0、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 μL·mL-1);然后28 ℃、160 r min-1避光振蕩培養(yǎng)0、3、6、9、12、24、36、48 h,收集菌絲晾干后稱其質(zhì)量,每處理3次重復。

1.4 木醋液對菌體細胞結構的影響

1.4.1 超微結構

菌絲制備:將制備好的孢子懸浮液加入PDB中,28 ℃、160 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)2 d后,過濾菌絲并將菌絲轉移到新的含藥PDB中(木醋液體積分數(shù)分別為4.98 μL·mL-1和5.5 μL·mL-1),以無菌水為對照;然后28 ℃、160 r·min-1避光振蕩培養(yǎng)6 h,收集菌絲備用。采用Chen等[25]的方法,取上述菌絲固定,脫水、浸透、包埋、切片后,使用透射電鏡(Hitachi HT7800/HT7700)觀察并拍照。

1.4.2 細胞膜

將F.culmorum在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后收集菌絲,用無菌水沖洗3～4次,稱取0.2 g菌絲加入10 mL 4.98 μL·mL-1木醋液溶液中,28 ℃、160 r·min-1避光振蕩培養(yǎng),分別于0、3、6、9、12、24、48 h測定電導率,最后加熱煮沸20 min,然后測定電導率。以加相同體積的無菌水為對照,每個樣品3次重復。以相對滲透率表示細胞膜的通透性,計算公式如下:

Rp=(ECt-EC0)/(ECb-EC0)。

(2)

式(2)中:Rp表示相對滲透率;ECt表示處理相對時間電導率值;EC0表示起始時間電導率;ECb表示煮沸處理后電導率。

將F.culmorum孢子懸浮液在含藥PDB中培養(yǎng)(木醋液體積分數(shù)為4.98 μL·mL-1),以無菌水為對照。6 h后收集孢子,用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗懸浮液,用終質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1碘化丙啶(PI)染色20 min。將染色后的孢子用PBS緩沖液充分洗滌3次,使用激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM800德國)觀察孢子染色情況,以確定細胞膜的破損程度。

1.4.3 細胞壁

F.culmorum菌絲體細胞壁完整性以堿性磷酸酶(AKP)的泄漏情況來表示[26]。采用上海優(yōu)選生物科技有限公司試劑盒測定AKP活性。將F.culmorum在PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d后,收集菌絲并稱取0.2 g加入10 mL 4.98 μL·mL-1木醋液溶液中,28 ℃、160 r·min-1避光振蕩培養(yǎng),分別于0、3、6、9、12、24、48 h取上清液,于37 ℃恒溫條件下測定其在510 nm處的吸光度。按照相應的蛋白質(zhì)濃度計算AKP活性,以37 ℃條件下每毫克蛋白質(zhì)每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol酚為1個酶活力單位。以加相同體積的無菌水為對照,每個處理重復3次。

1.5 木醋液對F. culmorum菌絲體細胞成分的影響

菌絲制備方法同1.4.3節(jié)。采用蒽酮比色法[27]測定可溶性糖含量。取0.2 g菌絲加入10 mL蒸餾水中,沸水浴30 min,自然冷卻后過濾并將濾液定容至25 mL。取0.5 mL濾液,分別加入蒸餾水、蒽酮-乙酸乙酯、濃硫酸,然后置于620 nm處測定吸光度。按葡萄糖標準曲線計算出相應的可溶性糖含量,以無菌水為對照,每個樣品重復3次。

采用考馬斯亮藍G-250法[28]測定可溶性蛋白含量,取0.2 g菌絲研磨至勻漿,離心取上清液加入考馬斯亮藍,在595 nm處測定吸光度,按蛋白質(zhì)標準曲線計算相應蛋白質(zhì)濃度,以無菌水為對照,每個樣品重復3次。

采用3,5二硝基水楊酸法[29]測定還原性糖含量,取上述上清液1 mL,加入2 mL二硝基水楊酸(DNS),沸水浴5 min,迅速冷卻并定容至10 mL,于540 nm處測定吸光度。按葡萄糖標準曲線計算出相應的還原性糖含量,以無菌水為對照,每個處理重復3次。

參考楊書珍[30]的方法,采用高效液相色譜法測定菌體ATP含量。取0.6 g菌絲體,加入3 mL 3%的高氯酸溶液,冰浴研磨均勻后離心10 min,取1 mL上清液,加80 μL 20%的氫氧化鉀溶液,4 ℃靜置30 min,于10 000×g離心5 min,取上清液進行測定。

高效液相色譜儀為Waters 2695,檢測器為Waters 2998 PDA檢測器。色譜柱為Hypersil ODS(200 mm×4.6 mm,25 μm),RP C18柱,流動相:A為200 mmol·L-1pH值6.5的KH2PO4-K2HPO4緩沖液,B為3%甲醇,等度洗脫,流速0.7 mL·min-1,進樣量10 μL;檢測波長為254 nm。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016、Origin 2018軟件處理,利用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差顯著性分析,采用單因素方差分析和Duncan's新復極差法進行差異顯著性檢驗,顯著性水平為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 木醋液對7種病原真菌的抑菌活性

由表1可知,木醋液對黃色鐮刀菌、三線鐮刀菌、楊生盾殼霉、木賊鐮刀菌、鏈格孢菌、尖孢鐮刀菌和腐皮鐮刀菌均有一定的抑制作用,其EC50值分別為4.98、5.10、5.33、9.69、10.80、26.50、22.04 μL·mL-1。其中,黃色鐮刀菌對木醋液最為敏感。因此,本文以黃色鐮刀菌(F.culmorum)為供試菌,進行木醋液抑菌機制的相關研究。

表1 木醋液對7種植物病原真菌的抑制作用

2.2 木醋液對F. culmorum的影響

2.2.1 孢子萌發(fā)和芽管伸長

由圖1可知,木醋液顯著(P<0.05)抑制了F.culmorum孢子的萌發(fā)和芽管伸長。經(jīng)28 ℃培養(yǎng)6 h后,對照組F.culmorum的孢子萌發(fā)率達90%以上,而5.5 μL·mL-1木醋液處理的F.culmorum孢子萌發(fā)率僅為8.99%。低體積分數(shù)(1.5、2.5 μL·mL-1)木醋液處理的F.culmorum的芽管長度分別較對照降低21.93%和19.54%,當木醋液處理體積分數(shù)≥3.5 μL·mL-1時,芽管長度較對照降低55%以上。

2.2.2 生物量

木醋液對F.culmorum生物量的影響如圖2所示,隨著木醋液體積分數(shù)的升高,F.culmorum菌絲的生物量逐漸降低,且呈劑量依賴性。供試體積分數(shù)下,木醋液對F.culmorum菌絲生物量抑制率分別為17.94%、31.90%、48.75%、75.75%、95.22%。

圖2 木醋液對黃色鐮刀菌生物量的影響Fig.2 Effect of wood vinegar on biomass of F. culmorum

2.3 木醋液對菌體細胞結構的影響

2.3.1 超微結構

由圖3可知,未經(jīng)木醋液處理的F.culmorum,其菌絲細胞壁和細胞膜薄厚均勻,結構完整,細胞基質(zhì)豐富,細胞器結構完整,分布有序(圖3-A);經(jīng)4.98 μL·mL-1木醋液處理后,細胞壁結構破損,內(nèi)含物泄漏,細胞內(nèi)部結構紊亂(圖3-B);經(jīng)5.5 μL·mL-1木醋液處理后,各細胞器結構紊亂,處于降解狀態(tài),細胞內(nèi)含物大量外滲(圖3-C)。

A,對照組;B,4.98 μL·mL-1 木醋液處理;C,5.5 μL·mL-1木醋液處理;CW,細胞壁;ER,內(nèi)質(zhì)網(wǎng);V,液泡。A, Control; B, Treatment with 4.98 μL·mL-1 wood vinegar; C, Treatment with 5.5 μL·mL-1 wood vinegar; CW, Cell wall; ER, Endoplasmic reticulum; V, Vacuole.圖3 木醋液對黃色鐮刀菌超微結構的影響Fig.3 Effects of wood vinegar on ultrastructure of F. culmorum(2 000×)

2.3.2 細胞膜和細胞壁

PI是一種熒光染料,可穿過受損的細胞膜進入細胞與核酸結合,形成一種紅色的熒光。未經(jīng)木醋液處理的F.culmorum孢子呈現(xiàn)微量熒光,經(jīng)木醋液處理后,孢子呈現(xiàn)強烈的紅色熒光(圖4-A),處理組熒光強度是對照組的6.52倍(圖4-B)。

圖4 木醋液對黃色鐮刀菌細胞膜完整性的影響Fig.4 Effects of wood vinegar on cell membrane integrity of F. culmorum

木醋液對F.culmorum細胞膜通透性的影響見圖5-A。在0～12 h,對照組和處理組的菌懸液相對滲透率均迅速上升,12 h時,處理組的相對滲透率是對照組的1.73倍,說明4.98 μL·mL-1木醋液在作用12 h時,對F.culmorum細胞膜破壞力度大。在12～48 h,處理組和對照組的相對滲透率上升程度趨于平緩,但處理組仍極顯著(P<0.01)高于對照組。表明木醋液處理增加了F.culmorum細胞膜的通透性,對細胞膜造成了損傷。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01)。下同。* indicates significant difference at P<0.05, and ** indicates significant difference at P<0.01. The same as below.圖5 木醋液對黃色鐮刀菌相對滲透率和AKP活性的影響Fig.5 Effects of wood vinegar on relative permeability and AKP activity of F. culmorum

木醋液對黃色鐮刀菌細胞壁完整性的影響如圖5-B所示。木醋液處理黃色鐮刀菌后,菌體AKP活性整體呈上升趨勢,處理組AKP活性始終大于對照組。對照組在0～3 h AKP活性上升幅度最大,隨后趨于平緩。處理組在0～12 h有明顯的上升趨勢,隨后上升幅度有明顯的減緩,表明木醋液對菌體的破壞作用主要集中在前12 h。在48 h,AKP活性達到最高值,處理組是對照組的3.74倍。

2.4 木醋液對菌體細胞成分的影響

木醋液對F.culmorum可溶性糖含量的影響見圖6-A。在6～9 h,對照組與處理組無顯著性差異(P>0.05)。在9～24 h,處理組的可溶性糖含量顯著(P<0.05)低于對照組,24 h時,處理組比對照組低41.03%,表明木醋液作用于F.culmorum后,菌體可溶性糖的合成受到抑制,導致菌體分解和合成代謝不平衡,從而使菌體死亡。

圖6 木醋液對黃色鐮刀菌可溶性糖、可溶性蛋白、還原性糖和ATP含量的影響Fig.6 Effects of wood vinegar on contents of soluble sugar, soluble protein, reducing sugar and ATP of F. culmorum

木醋液對F.culmorum可溶性蛋白含量的影響見圖6-B。隨著處理時間的延長,菌體可溶性蛋白含量總體呈下降趨勢。在0～12 h,對照組可溶性蛋白含量高于處理組,表明木醋液處理下,菌體蛋白結構被破壞,使之水解或變性,從而抑制蛋白的合成。

由圖6-C可知,F.culmorum經(jīng)木醋液處理后,菌體還原性糖含量總體呈下降趨勢,且對照組顯著(P<0.05)高于處理組。在36 h,還原性糖含量達到峰值,對照組還原性糖含量為19.30 mg·g-1,是處理組(15.64 mg·g-1)的1.23倍,表明F.culmorum培養(yǎng)液中加入木醋液后,菌體在生長過程中對糖的吸收利用能力降低。

如圖6-D所示,F.culmorum經(jīng)木醋液處理后,ATP含量呈下降趨勢,3～6 h和24～28 h,對照組顯著高于處理組,推測木醋液處理下F.culmorum菌體能量代謝紊亂。

3 討論

植物源活性物質(zhì)以其安全、無公害的特性成為當前研究的熱點。木醋液是以農(nóng)林廢棄物為原材料在高溫絕氧條件下熱解產(chǎn)生的氣體經(jīng)冷凝得到的混合物,因其成分的多樣性,具有廣譜的抑菌活性[31-32]。Zhang等[33]研究表明,木醋液中的酸和酚顯著抑制細菌的生長。郭運玲等[34]研究表明,木醋液對玉米大斑病菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn),木醋液對7種植物病原真菌均有不同程度的抑菌活性,對黃色鐮刀菌的抑制作用最強,造成黃色鐮刀菌菌絲生長變慢,孢子萌發(fā)率和生物量顯著降低,推測木醋液在植物真菌病害的生物防治中具有潛在的應用價值,但具體是何種成分在其抑菌活性中起主導作用,還有待通過進一步的研究進行揭示。

生物細胞膜是許多植物活性物質(zhì)抑制病原真菌的作用位點[35-36]。Pei等[26]研究發(fā)現(xiàn),香芹酚處理引起茶樹疽病菌(Colletotrichumfructicola)菌絲形態(tài)異常,細胞質(zhì)膜破壞,胞內(nèi)細胞器解體,菌懸液電導率增大,細胞滲透增加。袁康等[37]研究發(fā)現(xiàn),紫蘇精油處理后的灰綠曲霉經(jīng)PI染色后熒光強度明顯增加。本研究通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),木醋液作用于F.culmorum時,細胞壁結構破損,內(nèi)含物泄漏,細胞內(nèi)部結構紊亂,細胞器損傷;進一步研究結果表明,木醋液使F.culmorum菌懸液相對滲透率增加,PI染色后的孢子熒光強度增加,表明木醋液對黃色鐮刀菌的細胞膜造成損傷,這可能是由于木醋液中的有機酸類物質(zhì)與細胞膜中磷脂多糖等成分互作,破壞膜穩(wěn)定性。堿性磷酸酶位于細胞壁和細胞膜的間隙之中,正常情況下不會向外分泌,但當細胞遭到破壞后,其會泄漏到細胞外,因此可以通過胞外堿性磷酸酶含量的變化反映細胞壁完整性的變化[38]。F.culmorum經(jīng)木醋液處理后,AKP活性上升,推測木醋液破壞了菌體細胞壁完整性,從而達到抑菌效果。

糖和蛋白是重要的能源物質(zhì)[39]。真菌作為異養(yǎng)生物,從外界獲取糖類物質(zhì),進而合成各種能源物質(zhì),為菌體的生長提供能量[40]。尹大川等[41]研究發(fā)現(xiàn),用綠木霉(Trichodermavirens)T43的發(fā)酵液提取物處理4種重要林木病原菌后,菌體可溶性糖和可溶性蛋白含量均呈降低趨勢,菌體蛋白質(zhì)結構被破壞,使之水解或變性,從而抑制蛋白質(zhì)的合成。阮元等[42]研究表明,鹽酸小檗堿使小麥赤霉菌菌體還原性糖含量降低,影響小麥赤霉菌對還原性糖吸收和利用。本研究中,木醋液可導致F.culmorum的可溶性糖、可溶性蛋白和還原性糖含量降低,這與前人的研究結果一致。這可能是由于木醋液使胞內(nèi)物質(zhì)代謝失衡,物質(zhì)運輸中斷,酶和DNA等物質(zhì)的合成受阻所引起。

ATP為生物體的生理活動提供直接能量,是保證生物體生命活動的必要能量物質(zhì),它在生物體中的含量變化可以直接表明生物體的生理活動強度[43]。在本研究中,F.culmorum經(jīng)木醋液處理后,ATP含量不斷降低,表明木醋液處理下F.culmorum細胞內(nèi)能量物質(zhì)減少。這可能是由于木醋液抑制了某些產(chǎn)能代謝通路引起的,如三羧酸循環(huán)等。

綜上,木醋液主要是通過破壞菌體細胞結構、擾亂菌體物質(zhì)代謝和能量代謝來實現(xiàn)其對植物病原真菌的抑菌作用。本研究結果為木醋液在植物病害綠色防控中的應用提供了理論依據(jù),但本研究僅從細胞結構和生理代謝方面闡述了木醋液的抑菌機制,后續(xù)還需從分子方面進一步研究補充印證。