王天云,奎 翔,趙春梅,王 燕

(昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科,云南 昆明 650032)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是高發(fā)的泌尿系統(tǒng)腫瘤,相關(guān)報(bào)告顯示,2020年RCC的新發(fā)病例共計(jì)431 000例,并有179 000例因RCC死亡[1],其中KIRC是腎細(xì)胞癌發(fā)病率最高的亞型[2]。由于對化療藥物耐藥和對放療不敏感,KIRC仍以手術(shù)切除作為主要的治療方式[3]。該病早期無特異性臨床表現(xiàn),因此其早期診斷率較低,約1/3的患者在初診時(shí)已發(fā)生擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移;即使在手術(shù)切除后,仍有近1/3的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[4]。隊(duì)列tRNA-核糖基轉(zhuǎn)移酶1(queuine tRNA-ribosyl transferase 1,QTRT1),有時(shí)也稱為tRNA-鳥嘌呤轉(zhuǎn)糖基酶 (tRNA-guanine trans glycosylase,TGT),位于染色體19p13[5],包含10個(gè)外顯子,大約為12 kb。QTRT酶由基因QTRT1編碼,其分子功能是鳥嘌呤與34位的Q堿交換,從而產(chǎn)生超修飾的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA,tRNA)[6]。QTRT1是參與 tRNA轉(zhuǎn)錄后修飾的關(guān)鍵酶,這些tRNA是蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心組成部分,它們的調(diào)節(jié)可以影響腫瘤進(jìn)展[7]。研究[8-10]顯示,QTRT1可能通過調(diào)節(jié) tRNA參與人結(jié)腸腺癌的癌變過程,并且在肺腺癌中顯示了QTRT1的預(yù)后價(jià)值。然而,QTRT1在KIRC中的作用價(jià)值仍然未知,與之相關(guān)的研究尚未見報(bào)道,現(xiàn)通過數(shù)據(jù)挖掘探討其在KIRC中的潛在作用,對QTRT1與KIRC之間的關(guān)系進(jìn)行研究,本研究的主要方法是基于Cancer Genome Atlas database(TCGA)數(shù)據(jù)庫,聯(lián)合多個(gè)在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,以生物信息學(xué)的方法探索QTRT1對KIRC預(yù)后以及免疫的影響。

1 資料與方法

1.1分析數(shù)據(jù)來源 TCGA中KIRC表達(dá)譜及表型數(shù)據(jù)于2022年2月5日下載 (https://xenabrowser.net/datapages/)。驗(yàn)證的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)GSE40435[11]來自于GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi )。

1.2數(shù)據(jù)處理 所有下載的數(shù)據(jù)都經(jīng)過R軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(版本為4.1.2 https://www.r-project.org/ )。

1.3QTRT1蛋白表達(dá)分析 R軟件中的“dplyr”包用于對QTRT1與患者臨床病理參數(shù)間的聯(lián)系進(jìn)行分析。

使用人類蛋白質(zhì)圖譜(The Human Protein Atlas HPA, http://www.proteinatlas.org/ )在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行QTRT1蛋白在KIRC中表達(dá)的分析。

1.4QTRT1與KIRC患者的預(yù)后 使用R軟件的“survival”包研究QTRT1表達(dá)對KIRC患者預(yù)后的影響,并利用“rms”包構(gòu)建與預(yù)后有關(guān)的列線圖模型。

1.5基因,蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 聯(lián)合使用STRING(https://cn.string-db.org/),GENEMAIN(http://genemania.org)2個(gè)在線數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白及基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。

1.6QTRT1的基因富集分析 利用基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)軟件進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析(版本4.2.1 http://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp)。

1.7QTRT1與KIRC免疫間的關(guān)系 聯(lián)合使用Sangerbox 3.0(http://vip.sangerbox.com/home.html)、Gene Expression Profiling interactive Analysis 2(GEPIA2,http://gepia2.cancer-pku.cn/#index)和TIMER2.0(timer.cistrome.org)等3個(gè)在線平臺(tái)進(jìn)行免疫相關(guān)分析。

1.8輔以實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quartiative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法檢測KIRC細(xì)胞和正常腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)情況 試驗(yàn)所用的KIRC細(xì)胞包括786-O細(xì)胞以及Caki-2細(xì)胞,正常腎小管上皮細(xì)胞為HK2細(xì)胞,以上細(xì)胞購于武漢普諾賽細(xì)胞庫。786-O細(xì)胞以10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素的1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng),Caki-2細(xì)胞以10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素的McCoy′s完全培養(yǎng)基培養(yǎng),HK2細(xì)胞以10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。在細(xì)胞長滿一個(gè)T25培養(yǎng)瓶后提取RNA進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)(試劑為Takara體系)。使用引物:QTRT1:上游-5′ GAAGGGCATCACGACCGAA-3′,下游-5′ CCCGGCCTTAGACCCAGAT-3′;內(nèi)參引物β-actin:上游-5′-CTCGCCTTTGCCGATCC-3′,下游-5′-TTCTCCATGTCGTCCCAGTT-3′。所得結(jié)果使用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用R軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用秩和檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)、單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),生存預(yù)后分析使用Kaplan-Meier(K-M)生存分析中的log-rank法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1QTRT1的轉(zhuǎn)錄組水平表達(dá) 通過對TCGA的535例癌和72例正常組織進(jìn)行秩和檢驗(yàn)顯示,KIRC組織中QTRT1的表達(dá)顯著高于正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。為了排除同一數(shù)據(jù)集的干擾,GSE40435數(shù)據(jù)集被用于對結(jié)論進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)一致(P<0.05),見表2。KIRC細(xì)胞780-O和Caki-2中QTRT1的mRNA表達(dá)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于正常腎小管上皮細(xì)胞HK2,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

2.2QTRT1的表達(dá)與KIRC臨床病理參數(shù)的關(guān)系及該蛋白的表達(dá) 將KIRC患者按QTRT1 mRNA表達(dá)量的中位數(shù)分為QTRT1高表達(dá)組和低表達(dá)組,并利用卡方檢驗(yàn)研究QTRT1表達(dá)與KIRC臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。QTRT1的mRNA表達(dá)在T分期和臨床分期的不同組別間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表4。HPA數(shù)據(jù)庫中收錄了QTRT1的免疫組化染色結(jié)果,通過檢索HPA數(shù)據(jù)庫,顯示QTRT1蛋白呈現(xiàn)胞漿陽性表達(dá),同時(shí)在KIRC組織中檢測到中等強(qiáng)度表達(dá),在正常腎組織中檢測到低強(qiáng)度表達(dá),見圖1。

表1 TCGA統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)比較

表2 TCGA統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)比較

表3 細(xì)胞統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)比較

表4 QTRT1 mRNA表達(dá)在臨床病理特征組間的比較

2.3KIRC預(yù)后模型 首先在生存分析中,按QTRT1 mRNA表達(dá)量的中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,結(jié)果顯示,QTRT1的基因表達(dá)與患者總生存期(overall survival,OS),無進(jìn)展生存期(progression-free survival,PFS)均為正相關(guān)(P<0.05),見圖2。以 臨床分期(Ⅰ+Ⅱ=0,Ⅲ+Ⅳ=1)、年齡(<65歲=0,≥65歲=1)、分級(jí)(<3級(jí)=0,3+4級(jí)=1)、M 分期(非M1分期=0,M1分期=1)、T 分期(

圖1 QTRT1蛋白在正常腎組織和KIRC組織中的表達(dá)

圖2 QTRT1mRNA表達(dá)與預(yù)后

圖3 多因素Cox分析森林圖

基于對TCGA數(shù)據(jù),本研究構(gòu)建了預(yù)后相關(guān)列線圖,利用該圖,可以估算KIRC患者的1年、3年和5年OS(圖4A)。該列線圖的曲線下面積(area under curve,AUC)分別為1年0.84、3年0.81、5年0.78(圖4B);C-指數(shù)為0.77,說明列線圖具有較合適的預(yù)測強(qiáng)度。如圖4C所示的列線圖校準(zhǔn)曲線進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的使用效能。

表5 多因素Cox分析

圖4 預(yù)后列線圖

2.4基因-基因相互作用(gene-gene interaction,GGI)網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 GeneMANIA被用于構(gòu)建與QTRT1有關(guān)的GGI網(wǎng)絡(luò),網(wǎng)絡(luò)中包含的相互作用形式包括物理相互作用(physical interactions),共表達(dá)(co-expression),預(yù)測(predicted),共定位(co-localization),遺傳相互作用(genetic interactions),通路(pathway),見圖5A,共有19種與QTRT1最具相互作用關(guān)系的基因被展示。同時(shí)利用STRING平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),并顯示了與QTRT1相互作用的10種蛋白質(zhì),見圖5B。

圖5 基因、蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5GSEA富集分析和腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden,TMB) 通過GSEA軟件得到了賴氨酸降解(KEGG_LYSI NE_D EGRADATION), 甘油脂代謝(KEGG_GLYCEROLIPID_METABOLISM),溶酶體(KEGG_LYSOSOME),泛酸和輔酶A 生物合成(KEGG_PANTOTHENATE_AND_COA_BIOSYNTHESIS)等4種與QTRT1表達(dá)有關(guān)的信號(hào)通路(圖6A,表6)。利用Sangerbox得到了QTRT1與腫瘤突變負(fù)荷Tumor Mutation Burden(TMB)間的關(guān)系,在KIRC中QTRT1與TMB呈現(xiàn)正相關(guān)(P<0.05,R>0,圖6B)。

圖6 GSEA富集分析

表6 QTRT1富集分析結(jié)果。

2.6QTRT1與免疫之間的關(guān)系 利用TIMRE2.0網(wǎng)站,并使用其中的XCell算法,探究QTRT1mRNA表達(dá)同免疫細(xì)胞浸潤之間的關(guān)系。在眾多的免疫細(xì)胞中,CD4陽性的Th1細(xì)胞(P<0.001,r=-0.329)、巨噬細(xì)胞(P<0.001,r=-0.329)、淋巴樣祖細(xì)胞(P<0.001,r=-0.231)、樹突狀細(xì)胞(P<0.001,r=-0.295)、單核細(xì)胞(P<0.001,r=-0.15)等5種免疫細(xì)胞的浸潤程度與QTRT1表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),而CD4陽性的Th2細(xì)胞(P<0.001,r=0.243)呈現(xiàn)正相關(guān)。并且,還用TIDE算法研究QTRT1與髓源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells MDSCs)間的聯(lián)系,顯示MDSCs與QTRT1正相關(guān)(P<0.001,r=0.196如圖7A所示)。此外,QTRT1與多個(gè)免疫檢查點(diǎn)基因和免疫細(xì)胞途徑均具有強(qiáng)相關(guān)性(P<0.001),見圖7B,C。在Stromal Score評分模式下,KIRC中QTRT1的表達(dá)與免疫微環(huán)境顯著負(fù)相關(guān),見圖7D。最后使用GEPIA2網(wǎng)站進(jìn)行了QTRT1與3個(gè)常用的免疫檢查點(diǎn)基因相關(guān)性的研究,見圖7E,QTRT1與PTCD1(PD1)、CD152(CTLA4)免疫檢查點(diǎn)分子顯著正相關(guān)(P<0.05,r>0)。以上結(jié)果都說明QTRT1與KIRC的免疫密切相關(guān)。

圖7 QTRT1與腫瘤免疫的關(guān)系

3 討 論

TCGA、GEO等眾多生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫的建立,使得分子生物數(shù)據(jù)得以共享,加之計(jì)算機(jī)科學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)的迅猛發(fā)展,生信分析技術(shù)日趨成熟。通過生信分析得出初步結(jié)論,再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和臨床研究驗(yàn)證,大大節(jié)省了研究資金和時(shí)間,也為科學(xué)研究帶來了更多的思路和方向[12-13]。如前所述,已有研究報(bào)告了QTRT1與結(jié)直腸癌、肺腺癌等腫瘤的聯(lián)系,但該基因與KIRC間關(guān)系的研究尚未見報(bào)道。生信分析顯示QTRT1在KIRC中顯著上調(diào),并且腫瘤的分期愈高該基因的表達(dá)也愈高。同時(shí)在Caki-2和786-O腎癌細(xì)胞系中,QTRT1 mRNA的表達(dá)水平明顯強(qiáng)于正常腎小管上皮細(xì)胞HK-2。而在HPA數(shù)據(jù)庫中,通過檢索顯示QTRT1蛋白在KIRC中為胞漿陽性表達(dá),并且其在癌和正常組織中表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。K-M曲線顯示,高表達(dá)的QTRT1是KIRC患者的不良預(yù)后因素。Cox回歸分析進(jìn)一步提示QTRT1和年齡、分級(jí)、M 分期可以作為KIRC患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)可以構(gòu)建以QTRT1和年齡、分級(jí)、M分期等參數(shù)為基礎(chǔ)的列線圖預(yù)后模型;當(dāng)已知KIRC患者的上述參數(shù)時(shí),根據(jù)模型計(jì)算出總分?jǐn)?shù),就能得出患者的1年、3年、5年OS的概率。因此,本研究構(gòu)建了基于QTRT1表達(dá)的列線圖模型,該模型可以更加精確地指導(dǎo)KIRC患者的預(yù)后。

在GSEA富集分析中,QTRT1高度富集的4個(gè)信號(hào)通路被篩選出來,這些通路可以幫助我們更好地理解KIRC致病的病理生理機(jī)制。GGI和PPI相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建呈現(xiàn)了多個(gè)與QTRT1有關(guān)的生物分子,這些生物分子的顯示給KIRC的研究帶來了更多的思路和切入點(diǎn)。

惡性腫瘤的高發(fā)病率和高病死率是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)無法回避的問題,而在抗擊腫瘤的道路上,人類取得了斐然的成績,先后創(chuàng)立了多種治療方式。其中免疫治療是近30年來發(fā)展壯大的臨床治療方法,已經(jīng)在多種腫瘤中運(yùn)用,并取得了理想的治療效果,如運(yùn)用于惡性黑色素瘤、肺癌和淋巴瘤[14-16]。免疫治療對患者正常細(xì)胞的影響較小,是一種相對安全的方法,免疫治療也是當(dāng)下的研究熱點(diǎn)。本研究QTRT1與TMB免疫治療效果預(yù)測因子聯(lián)系緊密,猜測后者可以在預(yù)測KIRC患者免疫治療反應(yīng)中發(fā)揮作用。此外,在KIRC中QTRT1與CD4陽性的Th1、巨噬細(xì)胞、淋巴樣祖細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞負(fù)相關(guān),同時(shí)其表達(dá)與MDSC的浸潤程度正相關(guān),可能導(dǎo)致腫瘤免疫微環(huán)境的抑制。MDSCs來源于骨髓,對免疫系統(tǒng)有抑制作用。MDSC可以產(chǎn)生一氧化氮和活性氧,后者可以硝酸化趨化因子并阻止CD8+T細(xì)胞進(jìn)入腫瘤[17]。MDSC會(huì)產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子,包括 IL-10和TGF-β,會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞生成。研究[18-21]表明,MDSCs 與肝細(xì)胞癌、胰腺癌、乙型肝炎、尿路上皮癌等疾病的預(yù)后和治療密切相關(guān)。因此QTRT1可能參與塑造了KIRC中免疫抑制的微環(huán)境,這很可能造成該腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展并影響患者預(yù)后(QTRT1作為預(yù)后不良因子的佐證),免疫抑制狀態(tài)也是一把雙刃劍,當(dāng)消除其干擾時(shí),也可能使腫瘤擺脫免疫抑制并激活免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用。同時(shí),在KIRC中QTRT1還與多個(gè)免疫檢查點(diǎn)(如PD1和CTLA4等)具有顯著相關(guān)性。

本研究不僅通過TCGA數(shù)據(jù)集和GEO數(shù)據(jù)集分析了QTRT1 mRNA在人體組織中的表達(dá),還通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞水平上進(jìn)行基因表達(dá)驗(yàn)證,同時(shí)通過HPA數(shù)據(jù)庫探尋其蛋白質(zhì)表達(dá),從基因到蛋白全面分析了該因子的表達(dá)情況。 此外,還分析了KIRC中QTRT1的多種元素,包括列線圖、GSEA、TMB、PPI、GGI、腫瘤免疫浸潤、免疫細(xì)胞通路和檢查點(diǎn)分子。

綜上所述,QTRT1是KIRC的潛在預(yù)后因子,與4種信號(hào)通路相關(guān),還與免疫治療密切相關(guān)。但是,本研究同樣存在不足之處。由于是回顧性數(shù)據(jù),來自TCGA的臨床信息有限,無法獲得各種重要數(shù)據(jù),包括潛在的慢性疾病、免疫療法的使用、腎切除術(shù)后復(fù)發(fā)等。研究主要基于生信分析,缺少基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。TCGA中正常腎組織(N = 72)的樣本量相對較小,這可能會(huì)導(dǎo)致一些偏差。