呂國華,鄭冰清,馬學(xué)艷,金武,李紅霞,宋長友,徐跑,顧若波,聞海波*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院,江蘇 無錫 214128;2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心農(nóng)業(yè)農(nóng)村部稻漁綜合種養(yǎng)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫 214081)

淡水石首魚(Aplodinotusgrunniens)屬鱸形目、石首魚科,俗稱淡水大黃魚、淡水黃花魚,其適應(yīng)性廣,是北美洲分布最廣泛的淡水魚類[1]。淡水石首魚因肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富且無肌間刺而受到人們喜愛,并具有巨大的經(jīng)濟(jì)前景[2]。目前國外對淡水石首魚研究較多,主要有生長與繁殖特性[3-6]、捕撈特征[7]、食性差異[8]以及出血病抗體檢測[9]等方面,而國內(nèi)對淡水石首魚研究較少,僅見營養(yǎng)成分分析[10]、人工催產(chǎn)與胚胎發(fā)育研究[11]、幼魚外部形態(tài)與內(nèi)部解剖學(xué)特征研究[2]、線粒體基因組特征研究[12]以及饑餓脅迫對形體指標(biāo)、肌肉脂肪酸和肝臟代謝基因表達(dá)的影響[13]等方面。中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心于2016年從美國引進(jìn)一批淡水石首魚并開展人工馴養(yǎng)和繁育試驗(yàn),取得了顯著成效,為我國淡水養(yǎng)殖業(yè)提供了新的養(yǎng)殖品種。

銅是廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動中殺藻劑和殺菌劑中的有效成分,水體中Cu2+超標(biāo)會對養(yǎng)殖水體產(chǎn)生嚴(yán)重的污染,并通過生物富集作用對魚類產(chǎn)生較強(qiáng)的毒害作用[14],引起魚類行為異常、生理功能紊亂以及細(xì)胞組織病變甚至死亡等[15]。銅也是生物體內(nèi)最基本的微量重金屬元素之一,作為氧化還原劑或氧載體存在于30多種酶中,參與脊椎動物體內(nèi)黑色素的合成和造血等過程,是魚體內(nèi)不可或缺的微量元素[15]。

有關(guān)重金屬污染對魚類毒性效應(yīng)的研究已有不少報(bào)道[15-17],但Cu2+對淡水石首魚抗氧化以及免疫系統(tǒng)的影響尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)主要研究了水體中不同濃度Cu2+脅迫對石首魚幼魚死亡率的影響以及對石首魚幼魚肝臟組織中的過氧化氫酶(catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase,GPx)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST),鰓Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase),腸道中α-淀粉酶(α-amylase,α-AMS)、脂肪酶(lipase,LP)和胃蛋白酶(pepsin,PP)活性以及皮質(zhì)醇(cortisol,COR)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響,以闡明重金屬Cu2+對石首魚幼魚的抗氧化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的毒性作用,為水體Cu2+對魚類的毒性作用機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以2016年美國引進(jìn)的淡水石首魚F2代幼魚為試驗(yàn)對象,質(zhì)量為(47.2±8.7)g,全長(17.8±1.0)cm。試驗(yàn)前30 d選取活力良好的幼魚在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng),試驗(yàn)用水為曝氣自來水,溫度(17±1)℃。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Cu2+急性毒性試驗(yàn)在0.1～1.5 mg·L-1Cu2+質(zhì)量濃度范圍內(nèi)根據(jù)等間距法選取5個(gè)不同質(zhì)量濃度組:0.100、0.197、0.387、0.762、1.500 mg·L-1,以及1個(gè)不含Cu2+的對照組,每組15尾魚。試驗(yàn)過程中不投喂、不換水,水溫(17±1)℃,每8 h觀察1次,記錄死亡數(shù)量并將死魚撈出。試驗(yàn)進(jìn)行96 h。根據(jù)死亡數(shù)據(jù)采用直線內(nèi)插法計(jì)算24和96 h的毒性試驗(yàn)回歸方程、半致死濃度和安全濃度。

1.2.2 Cu2+脅迫對肝臟、鰓和腸道酶活性影響試驗(yàn)根據(jù)急性脅迫試驗(yàn),選定0.197 mg·L-1Cu2+作為酶活性試驗(yàn)濃度,同時(shí)設(shè)定銅離子濃度為0 mg·L-1的空白對照組,每組3個(gè)平行,每個(gè)平行放20尾。分別在0、4、12、24、48 和96 h 6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣,每個(gè)平行組取3條,用魚安定(MS-222)將石首魚幼魚麻醉,測量體重、體長等數(shù)據(jù),分別取肝臟、鰓和前腸暫存液氮罐中,置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.3 抗氧化和免疫相關(guān)指標(biāo)的檢測方法

準(zhǔn)確稱取待測的鰓、肝臟、前腸等組織,加入一定體積的PBS(pH7.4),用組織勻漿儀充分勻漿,2 500 r·min-1離心20 min,取上清液分裝冷凍后分別進(jìn)行過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化酶(GPx)、谷胱甘肽(GSH)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、Na+-K+-ATP酶(Na+-K+-ATPase)、α-淀粉酶(α-AMS)、脂肪酶(LP)和胃蛋白酶(PP)酶活性以及皮質(zhì)醇(Cortisol)、丙二醛(MDA)含量檢測。試劑盒購自上海酶聯(lián)生物有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Cu2+對淡水石首魚幼魚的急性毒性

從表1可以看出:Cu2+質(zhì)量濃度范圍在0.100～0.197 mg·L-1時(shí)淡水石首魚幼魚死亡率較低,且48、72 和96 h沒有累加死亡;Cu2+濃度高于0.387 mg·L-1時(shí)死亡率較高,96 h的死亡率可達(dá)93.33%;而24 h時(shí)0.762、1.500 mg·L-1Cu2+處理組死亡率已達(dá)100%。根據(jù)死亡率計(jì)算Cu2+脅迫淡水石首魚幼魚24 h回歸方程,Y=1.405 4X+0.024 6,R2=0.888 7,半數(shù)致死濃度為0.313 mg·L-1;96 h回歸方程,Y=1.435 5X+0.038 2,R2=0.827 3,半數(shù)致死濃度為0.291 mg·L-1,安全濃度為0.029 mg·L-1。

表1 不同Cu2+質(zhì)量濃度處理淡水石首魚的死亡率Table 1 Mortality of juvenile Aplodinotus grunniens exposed to different Cu2+ concentrations %

2.2 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

2.2.1 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟CAT活性的影響如圖1-A所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚肝臟CAT活性無顯著差異(P>0.05),而試驗(yàn)組CAT活性呈先上升后下降趨勢,48 h 時(shí)達(dá)到最高(127.23±4.77)ng·g-1并顯著高于對照組(P<0.05),試驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)CAT活性無顯著差異(P>0.05)。

圖1 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟抗氧化性酶活性的影響Fig.1 Effects of Cu2+ stress on the activity of antioxidant enzymes in the liver of juvenile A. grunniensA. CAT:Catalase;B. SOD:Superoxide dismutase;C. T-AOC:Total antioxidant capacity;D. GPx:Glutathione peroxidase不同字母表示試驗(yàn)組不同時(shí)間存在顯著差異,*表示試驗(yàn)組與對照組存在差異。下同。Different letters indicate that there are significant differences in experimental group at different times,*indicates that there is a difference between the experimental group and the control group. The same below.

2.2.2 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟SOD活性的影響如圖1-B所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚肝臟SOD活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組SOD活性呈先升高后下降的趨勢,在4 h達(dá)到最大值(146.19±8.36)ng·g-1并顯著高于對照組(P<0.05),24 h開始均顯著低于對照組,96 h達(dá)到最低值(88.36±10.60)ng·g-1。4 h 時(shí)SOD活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),96 h時(shí) SOD活性與24 h差異不顯著(P>0.05),但顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.2.3 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟T-AOC的影響如圖1-C所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚肝臟T-AOC無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組T-AOC隨脅迫時(shí)間增加先上升又下降然后又上升,在4 h達(dá)到最大值(154.94±21.65)U·g-1并顯著高于對照組(P<0.05),48 h時(shí)達(dá)到最小值(95.69±25.76)U·g-1并顯著低于對照組(P<0.05),其他時(shí)間與對照組無顯著差異(P>0.05)。4 h時(shí) T-AOC 與 12 h 差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),48 h時(shí)T-AOC顯著低于4 h和12 h(P<0.05),而與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.4 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟GPx活性的影響如圖1-D所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚肝臟GPx活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組GPx活性隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降再上升趨勢,在4 h時(shí)達(dá)最高(702.21±76.05)ng·g-1且顯著高于對照組(P<0.05),48 h達(dá)最低(525.90±68.62)ng·g-1并顯著低于對照組(P<0.05),其他時(shí)間與對照組差異不顯著(P>0.05)。4 h時(shí)GPx活性與0 h差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.2.5 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟GSH活性的影響如圖2-A所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚肝臟GSH活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組GSH活性隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降趨勢,在4 h時(shí)達(dá)最高(2 983.13±362.47)μg·g-1并顯著高于對照組(P<0.05),96 h時(shí)最低為(1 890.14±122.58)μg·g-1并顯著低于對照組(P<0.05),其他時(shí)間與對照組差異不顯著(P>0.05)。4 h時(shí)GSH活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),48和96 h GSH活性與24 h差異不顯著(P>0.05),顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

圖2 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟抗氧化酶活性(A—C)和皮質(zhì)醇(D)、丙二醛(E)含量的影響Fig.2 Effects of Cu2+ stress on the activity of antioxidant enzymes(A-C)and cortisol(COR,D),malondialdehyde(MDA,E)content in the liver of juvenile A. grunniensGSH:Glutathione;ALT:Alamine aminotransferase;AST:Aspartate aminotransferase.

2.2.6 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟ALT活性的影響如圖2-B所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚肝臟ALT活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組ALT活性隨脅迫時(shí)間增加呈上升趨勢,12 h開始顯著高于對照組(P<0.05),在96 h達(dá)到最大值(197.17±40.39)ng·g-1。96 h ALT活性顯著高于0和4 h(P<0.05),與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.7 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟AST活性的影響如圖2-C所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚肝臟AST活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組AST活性隨脅迫時(shí)間增加呈上升趨勢,12 h開始顯著高于對照組(P<0.05),在96 h達(dá)到最大值(43 848.48±3 665.62)pg·g-1。48和96 h AST活性顯著高于0 h,但與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

2.2.8 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟皮質(zhì)醇含量的影響如圖2-D所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚肝臟皮質(zhì)醇含量無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組皮質(zhì)醇含量隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降趨勢,4 h時(shí)達(dá)最高(1 378.14±72.68)ng·g-1并顯著高于對照組(P<0.05),48 h皮質(zhì)醇含量顯著低于對照組(P<0.05),96 h 最低為(962.85±104.93)ng·g-1,但與對照組差異不顯著(P>0.05)。4 h時(shí)皮質(zhì)醇含量顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),24、48 和96 h皮質(zhì)醇含量無顯著性差異(P<0.05),但顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.2.9 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟MDA含量的影響如圖2-E所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚肝臟MDA含量無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組MDA含量隨脅迫時(shí)間增加呈上升趨勢,4 h開始顯著高于對照組(P<0.05),在96 h達(dá)到最大值(150.10±21.44)nmol·g-1。24和96 h MDA含量顯著高于0 h(P<0.05),但與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚鰓Na+-K+-ATP活性的影響

如圖3-A所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚鰓Na+-K+-ATP活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組Na+-K+-ATP活性隨脅迫時(shí)間增加先上升后下降并保持穩(wěn)定,在4 h時(shí)達(dá)最高(135.65±9.40)μmol·g-1并顯著高于對照組(P<0.05),在48 h時(shí)最低為(95.83±13.22)μmol·g-1并顯著低于對照組(P<0.05)。4 h時(shí)Na+-K+-ATP活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),48 h Na+-K+-ATP活性顯著低于4和12 h,與其他時(shí)間差異不顯著(P>0.05)。

圖3 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚鰓和腸道酶活性的影響Fig.3 Effects of Cu2+ stress on gill and intestinal enzyme activity of juvenile A. grunniens

2.4 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚腸道酶活性的影響

2.4.1 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚腸道α-淀粉酶活性的影響如圖3-B所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚腸道α-淀粉酶活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組α-淀粉酶活性隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降再上升趨勢,在4 h時(shí)最高為(2 097.98±93.66)pg·g-1并顯著高于對照組(P<0.05),48 h時(shí)最低為(1 142.41±399.89)pg·g-1并顯著低于對照組(P<0.05)。4 h時(shí)α-淀粉酶活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),48 h時(shí)與0和96 h差異不顯著(P>0.05),但顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.4.2 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚腸道脂肪酶活性的影響如圖3-C所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚腸道脂肪酶活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組脂肪酶活性隨脅迫時(shí)間增加先上升后下降并保持穩(wěn)定,在4 h時(shí)最高為(1 057.34±138.01)ng·g-1并顯著高于對照組(P<0.05),在96 h時(shí)最低為(481.60±138.43)ng·g-1,與對照組差異不顯著(P>0.05)。4 h時(shí)腸道脂肪酶活性顯著高于其他時(shí)間(P<0.05)。

2.4.3 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚腸道胃蛋白酶活性的影響如圖3-D所示:不同處理時(shí)間對照組淡水石首魚幼魚胃蛋白酶活性無顯著差異(P>0.05),試驗(yàn)組胃蛋白酶活性隨脅迫時(shí)間增加呈先上升后下降趨勢,在4 h時(shí)最高為(336.57±15.96)ng·g-1并顯著高于對照組(P<0.05),在96 h時(shí)最低為(228.84±8.99)ng·g-1且顯著低于對照組(P<0.05)。4 h時(shí)胃蛋白酶活性與12 h差異不顯著(P>0.05),但顯著高于其他時(shí)間(P<0.05),24和 96 h 胃蛋白酶活性與48 h差異不顯著(P>0.05),但顯著低于其他時(shí)間(P<0.05)。

3 討論

3.1 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚存活的影響

工業(yè)廢水的不合理排放以及農(nóng)業(yè)殺蟲劑的濫用會對水體生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重影響,威脅魚類生存。銅作為魚類不可或缺的微量元素,在水體中的濃度影響石首魚的健康養(yǎng)殖。研究表明:不同物種對Cu2+的耐受性和敏感程度存在較大差異,日本黃姑幼魚(Nibeajaponica)的Cu2+安全濃度為0.263 mg·L-1[17],中國花鱸幼魚(Lateolabraxmaculatus)的Cu2+安全濃度為0.086 mg·L-1[18],草魚幼魚(Ctenopharyngodonidella)的Cu2+安全濃度為0.008 mg·L-1[14],廣東魴幼魚(Megalobramaterminalis)的Cu2+安全濃度為0.01 mg·L-1[19]。本研究發(fā)現(xiàn)淡水石首魚幼魚對Cu2+的耐受性較差,Cu2+的安全濃度為0.029 mg·L-1。根據(jù)《危險(xiǎn)化學(xué)品魚類急性毒性分級試驗(yàn)方法:GB/T 21281—2007》可判斷Cu2+對淡水石首魚幼魚的危害等級為劇毒?！段鬯C合排放標(biāo)準(zhǔn):GB 8978—1996》中銅排放一級標(biāo)準(zhǔn)為0.5 mg·L-1,遠(yuǎn)高于淡水石首魚幼魚的安全濃度,含銅廢水的排放將給魚類和其他水生生物帶來較大的危害,因此在養(yǎng)殖過程中應(yīng)注意水環(huán)境管理和含銅水產(chǎn)藥物的安全使用。但本試驗(yàn)得到的淡水石首魚幼魚Cu2+安全濃度是在Cu2+單獨(dú)作用下的試驗(yàn)結(jié)果,在實(shí)際生產(chǎn)中水中的懸浮物、有機(jī)質(zhì)、鈣鎂離子等都能降低硫酸銅的毒性[17],因此需要結(jié)合實(shí)際情況進(jìn)行具體分析和處理。

3.2 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚肝臟抗氧化酶活性的影響

受到重金屬脅迫,魚體會產(chǎn)生不同程度的氧化應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)增多,當(dāng)超出魚體耐受范圍時(shí),會造成魚體脂質(zhì)過氧化損傷。研究表明,魚體清除ROS存在一定規(guī)律,首先會利用一些小分子非酶抗氧化產(chǎn)物(例如GSH、維生素C、維生素E等)清除過多ROS,當(dāng)非酶抗氧化產(chǎn)物無法清除過多ROS時(shí),魚體則開始合成抗氧化酶來緩減氧化壓力[19]。SOD是一種金屬酶,負(fù)責(zé)清除超氧陰離子,形成過氧化氫,而CAT則負(fù)責(zé)將過氧化氫分解為水和分子氧[20]。GPx能以GSH為特異性底物,降解有機(jī)過氧化物和過氧化氫,維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整[21]。高春生等[22]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+濃度較低時(shí)黃河鯉(Cyprinuscarpio)肝臟SOD、GPx活性和T-AOC隨脅迫時(shí)間增加酶活性先上升后下降,Cu2+濃度較高時(shí)則表現(xiàn)明顯的抑制作用。潘魯青等[23]研究發(fā)現(xiàn)短時(shí)間的金屬離子刺激可使中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)肝胰臟SOD和CAT活性升高,而較長時(shí)間的刺激則會導(dǎo)致酶活性受到抑制。本試驗(yàn)結(jié)果顯示:在受到Cu2+脅迫后淡水石首魚幼魚SOD、GSH、GPx活性和T-AOC均顯著上升,在4 h時(shí)達(dá)到最大值,這是因?yàn)闄C(jī)體在受到Cu2+脅迫后分泌大量抗氧化酶來清除過多的ROS。96 h時(shí)SOD和GSH活性表現(xiàn)為顯著的抑制作用,這是因?yàn)殡S脅迫時(shí)間延長,ROS不斷消耗產(chǎn)生的抗氧化酶,且ROS產(chǎn)生速度非?？?未及時(shí)清除的自由基會對肝臟細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的傷害,導(dǎo)致酶活性下降[24]。CAT活性顯著升高后恢復(fù),且應(yīng)激響應(yīng)速度較其他抗氧化酶滯后,可能與不同酶在應(yīng)急防御體系中承擔(dān)的功能不同有關(guān)[25]。研究表明SOD是機(jī)體防御自由基侵害的第一道防線[26],也是受到Cu2+脅迫最敏感的抗氧化酶[27]。本研究結(jié)果顯示SOD活性相較于其他抗氧化酶受Cu2+抑制最嚴(yán)重,因此可作為早期Cu2+污染的首選指示目標(biāo)。

魚類在受到刺激后,頭腎細(xì)胞會在下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPI)分泌的促腎上腺皮質(zhì)激素作用下分泌產(chǎn)生皮質(zhì)醇激素,皮質(zhì)醇常被作為衡量魚類應(yīng)激程度的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)激反應(yīng)會導(dǎo)致翹嘴鲌(Culteralburnus)[28]和斑點(diǎn)叉尾洄(Ictaluruspunctatus)[29]體內(nèi)皮質(zhì)醇含量快速增加,且受到的刺激越大皮質(zhì)醇含量越高[30]。本試驗(yàn)中,Cu2+脅迫4 h 皮質(zhì)醇含量會顯著升高,然后慢慢下降,說明魚體剛接觸Cu2+環(huán)境時(shí)受到刺激較大,分泌大量皮質(zhì)醇。但隨時(shí)間延長皮質(zhì)醇含量下降,推測可能是魚體內(nèi)銅耐受策略起作用,促進(jìn)了體內(nèi)皮質(zhì)醇的清除[31-32]。

MDA是機(jī)體細(xì)胞受到攻擊時(shí),由生物大分子和膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生,MDA含量高低可以反映細(xì)胞受損傷程度[33-34]。Cd暴露會對草魚(Ctenopharyngodonidellus)肝臟產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化作用,導(dǎo)致MDA含量上升[35]。ALT和AST是廣泛存在于肝組織細(xì)胞內(nèi)的氨基轉(zhuǎn)移酶,在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起著重要作用,當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí),會導(dǎo)致ALT和AST活性升高,ALT和AST也被認(rèn)為是肝功能受損的檢測指標(biāo)[36]。üner等[37]研究發(fā)現(xiàn)有毒物質(zhì)對機(jī)體產(chǎn)生損傷時(shí),會導(dǎo)致ALT活性突然持續(xù)性增強(qiáng)。王少博等[16]研究發(fā)現(xiàn)鎘中毒早期草魚肝臟ALT活性顯著上升。王丙蓮等[38]研究發(fā)現(xiàn)低濃度Cd2+會引起泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)肝胰臟ALT和AST活性升高。本試驗(yàn)中,MDA含量和ALT、AST活性隨脅迫時(shí)間增加顯著升高,MDA含量從脅迫4 h開始顯著高于對照組,ALT和AST活性從12 h開始顯著高于對照組。這說明Cu2+脅迫初期,即對淡水石首魚幼魚肝臟造成損傷,且隨脅迫時(shí)間增加損傷不斷加重,最終可能造成肝功能損傷。

3.3 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚鰓Na+-K+-ATP活性的影響

Na+-K+-ATP在生物體能量轉(zhuǎn)換、物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞方面具有重要作用。研究表明水體中的銅短時(shí)間內(nèi)(7 d)在魚鰓中的累積量大于肝臟和腎臟,鰓組織也最先受到Cu2+的毒性作用[39]。高春生等[39]研究發(fā)現(xiàn),Cu2+濃度較低時(shí)(0.01～0.05 mg·L-1)對黃河鯉鰓Na+-K+-ATP活性具有促進(jìn)作用,Cu2+濃度較高時(shí)(>0.1 mg·L-1)表現(xiàn)為抑制作用,且隨處理時(shí)間延長抑制作用增強(qiáng)。苗晶晶等[40]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+脅迫對褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)鰓絲Na+-K+-ATP酶有顯著的劑量和時(shí)間效應(yīng),Na+-K+-ATP酶活性隨脅迫時(shí)間增加顯著上升后又逐漸趨于穩(wěn)定。本試驗(yàn)結(jié)果顯示:在0.197 mg·L-1Cu2+脅迫下,淡水石首魚幼魚鰓組織中Na+-K+-ATP活性在4 h顯著上升,然后顯著下降并逐漸趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)轸~體暴露在Cu2+水體中,會導(dǎo)致體內(nèi)Na+和Ca2+短暫流失,魚體立即開啟應(yīng)激響應(yīng)即增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶活性來維持體內(nèi)離子平衡,隨著進(jìn)入體內(nèi)的重金屬增多,金屬離子與膜上蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,引起蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致酶活性顯著下降。魚類去毒生理反應(yīng)即魚鰓黏液分泌量增加,改變魚鰓微環(huán)境中金屬離子的分布或提高能絡(luò)合金屬離子的金屬硫蛋白濃度等方法使Na+-K+-ATP酶活性逐漸趨于穩(wěn)定[40]。本試驗(yàn)結(jié)果與高春生等[39]研究結(jié)果不同,可能與魚種類和Cu2+濃度及脅迫時(shí)間有關(guān)。

3.4 Cu2+脅迫對淡水石首魚幼魚腸道酶活性的影響

消化酶活性是判斷魚類消化生理的主要指標(biāo),α-淀粉酶、胃蛋白酶和脂肪酶分別負(fù)責(zé)消化道中淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪的消化與代謝。研究發(fā)現(xiàn)金屬離子可以與底物和酶產(chǎn)生極強(qiáng)的親和力,從而改變酶活性[41]。重金屬Cu2+誘導(dǎo)酶活性增加可能是因?yàn)镃u2+與調(diào)節(jié)操控基因的阻遏蛋白形成復(fù)合物導(dǎo)致阻遏作用失效,酶合成增加;而Cu2+對酶活性的抑制作用可能是因?yàn)镃u2+與機(jī)體產(chǎn)生的金屬硫蛋白結(jié)合而解毒,金屬硫蛋白飽和后多余的Cu2+與消化酶活性中心的半胱氨酸殘基的巰基結(jié)合或者與酶的非活性中心部分結(jié)合,改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活抑制了酶活性[42]。陳肖肖等[43]研究發(fā)現(xiàn)低濃度Cu2+對泥蚶(Tegillarcagranosa)淀粉酶活性起到先激活后抑制作用;高濃度Cu2+對脂肪酶活性起到先激活后抑制作用;Cu2+對胃蛋白酶起到先激活后抑制作用。王海英等[44]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)腸道蛋白酶有抑制作用。章龍珍等[42]對中華鱘(Acipensersinensis)幼魚研究發(fā)現(xiàn),Cu2+對消化道中的淀粉酶和蛋白酶有抑制作用,而對脂肪酶具有激活作用。Jiang等[45]研究發(fā)現(xiàn)Cu2+對鯽魚(Carassiuscarassius)腸道中蛋白酶和淀粉酶均有抑制作用。綜上研究表明:當(dāng)水體Cu2+達(dá)到一定濃度時(shí),對水生動物消化酶存在一定的激活或抑制作用,不同種類消化酶的作用效果并不完全一致。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,淡水石首魚幼魚在受到0.197 mg·L-1Cu2+脅迫時(shí),α-淀粉酶、脂肪酶和胃蛋白酶均顯著上升后又顯著下降。這說明短時(shí)間(<4 h)的Cu2+脅迫對α-淀粉酶、胃蛋白酶和脂肪酶活性均起到激活作用,加快淡水石首魚幼魚對淀粉、蛋白質(zhì)和脂肪的消化,而長時(shí)間(≥24 h)脅迫則會抑制α-淀粉酶和胃蛋白酶活性,影響淀粉和蛋白質(zhì)的消化,但不會抑制脂肪酶活性。